林 玲，朱浩哲，蔣翊宸，鄭燕燕，劉 政，吳中元，丁世杰*，周光宏*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

細胞培養(yǎng)肉是指用畜禽干細胞通過體外培養(yǎng)生產(chǎn)出的肉類，是一種新興肉類生產(chǎn)技術(shù)，其優(yōu)勢是低碳環(huán)保，未來可作為傳統(tǒng)肉類的替代蛋白供應。2013年，荷蘭科學家Mark Post教授研制出世界上第一塊細胞培養(yǎng)牛肉。2019年11月18日，周光宏教授團隊利用幼豬身上分離出來的肌肉干細胞，歷時20 d創(chuàng)制了中國第一塊細胞培養(yǎng)肉[1]。近年來，細胞培養(yǎng)肉的基礎研究和產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展，但仍然有許多難題需要解決，其中包括如何獲得大量優(yōu)質(zhì)的種子細胞用于后續(xù)培養(yǎng)肉的三維分化[2]。

肌肉干細胞是培養(yǎng)肉重要的種子細胞之一。肌肉干細胞是肌肉組織里的專能干細胞，當肌肉組織出現(xiàn)損傷時，肌肉干細胞可有效修復和再生肌纖維[3]。肌肉干細胞通常位于肌膜和基底膜之間，環(huán)繞于每根肌纖維周圍，因此又被稱為肌衛(wèi)星細胞[4]。肌肉干細胞在正常成熟的肌肉中表現(xiàn)為靜止狀態(tài)，也是肌纖維生長過程中新肌核的主要來源[5-9]。肌肉干細胞的數(shù)目取決于動物的年齡、種類、骨骼肌類型。例如新生鼠肌肉干細胞數(shù)目約占肌細胞核總數(shù)的30%，成年后降到約4%，老年則下降到約2%（29～30 個月）[10]。又比如5 d的新生兒和5 個月嬰兒的肌肉干細胞分別大約可分裂60 次和46 次，9 歲或者60 歲的人只能夠分裂20～30 次[11]。無論在正常情況還是病理情況下，肌肉干細胞都要以自我更新的方式維持肌肉干細胞池[12]。

在肌肉干細胞的大規(guī)模培養(yǎng)過程中，由于細胞的貼壁生長特性，不管在2D培養(yǎng)皿還是3D微載體上，極易出現(xiàn)密度較高的情況。已有研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)7 d的牛肌肉干細胞增殖效率下降，且細胞也出現(xiàn)了一些融合的細胞肌管[13-14]，增殖減緩和自發(fā)分化不利于培養(yǎng)后收獲高品質(zhì)的種子細胞。也有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞在體外誘導分化為肌肉干細胞過程中，需要其在高密度條件下促進肌源性發(fā)育形成肌管[15]，表明高密度對細胞的分化起到非常重要的作用。在高密度功能維持研究方面，Liu Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)激活Hippo通路中的YAP蛋白可提高豬肌肉干細胞的增殖和干性維持能力。目前已有的豬肌肉干細胞高密度培養(yǎng)研究主要針對特定的信號通路和細胞命運，但仍缺少豬肌肉干細胞在高密度培養(yǎng)條件下細胞命運的系統(tǒng)性研究。近年來高通量轉(zhuǎn)錄組測序得到快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組代表了細胞等樣本整體的基因表達水平，能夠全局反映細胞的命運變化，目前在包括豬等畜禽動物上也得到大量應用[17-19]，因此本研究通過對豬肌肉干細胞轉(zhuǎn)錄組分析及驗證并系統(tǒng)性地探究高密度培養(yǎng)對豬肌肉干細胞命運的影響，旨在為細胞培養(yǎng)肉研究在高密度條件下調(diào)節(jié)細胞增殖分化提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 周齡公豬（以下簡稱幼豬），提供自江蘇某肉類屠宰加工工廠。

澳洲胎牛血清、Ham’s F-10營養(yǎng)培養(yǎng)基、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）美國GIBCO公司；I型鼠尾膠原 美國Corning公司；100×青鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶溶液 上海貝博生物公司；Trizol總RNA提取試劑及培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；RIPA裂解液（強） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TB Green Premix ExTaqII、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） 日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒美國Thermo公司；兔抗P44/42單克隆抗體、兔抗p-P44/42單克隆抗體 美國CST公司；鼠抗PAX7 美國DSHB研究院；鼠抗MYOG 美國BD公司。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 5702 R低速冷凍離心機、Mastercycler nexus GSX1梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；細胞計數(shù)儀Countess II 英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度儀美國Thermo公司；酶標儀 美國Molecular Devices公司；QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)德國Applied Biosystems公司；ImageQuant 4000分子成像儀 美國GE公司；eBlot L1快速濕轉(zhuǎn)儀 金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同密度豬肌肉干細胞的培養(yǎng)

幼豬肌肉干細胞的分離純化與傳代培養(yǎng)參照Liu Zheng等[16]方法；取第5代肌肉干細胞分別以2.7×103、5.4×103、1.1×104、2.2×104cells/cm2的密度接種于膠原包被的直徑10 cm培養(yǎng)皿中，生長培養(yǎng)基（在基礎培養(yǎng)基中添加5 ng/mL bFGF）添加量為8～10 mL，十字搖勻，在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育，第2天換液，第3天觀察、拍照、收樣進行分析。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序

將兩組肌肉干細胞（對照組：以2.7×103cells/cm2密度接種培養(yǎng)3 d，編號L-D3；實驗組：以2.2×104cells/cm2密度接種培養(yǎng)3 d，編號H-D3）各取3 個重復，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，培養(yǎng)皿中加入1 mL Trizol，常溫裂解5 min，收集裂解液至1.5 mL離心管，進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3.3 總RNA的提取

收樣：將基礎培養(yǎng)基吸掉后用PBS清洗一遍，加入1 mL Trizol裂解5 min并收集至1.5 mL離心管中。

RNA提?。合蚣毎鸗rizol裂解液中加入200 μL氯仿溶液，渦旋振蕩15 s后靜置2 min，12 000 r/min離心15 min，吸取380 μL上清液至RNase-free離心管中，加入同等體積70%乙醇溶液，混勻后加入CR3吸附柱，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min；加入350 μL去蛋白液RW1，靜置1 min，12 000 r/min離心1 min；加入80 μL DNaseI，靜置15 min；再加入350 μL去蛋白液RW1，靜置1 min，12 000 r/min離心1 min；加入500 μL漂洗液RW，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min；再次加入500 μL漂洗液RW，靜置2 min，12 000 r/min離心1 min，離心3 min，靜置3 min；加入30 μL RNase-free水，12 000 r/min離心2 min到新離心管中，即RNA水溶液。

總RNA濃度以及純度的測定：利用超微量分光光度計進行測定，若OD260nm/OD280nm值大于1.8，則提取的RNA純度較好。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書操作，根據(jù)測得RNA濃度計算10 μL反應體系所用總RNA體積，按表1組分配制反轉(zhuǎn)錄反應液（反應液配制在冰上進行）；用旋渦振蕩器將混合液混合均勻并離心至管底，反轉(zhuǎn)錄程序設置為37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，后降溫至4 ℃，取出后可-20 ℃保存待用。

表1 總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應體系（10 μL）Table 1 Reverse transcription system of RNA (10 μL)

1.3.5 引物設計

在NCBI上查找相關基因的mRNA序列，利用Pick Primers設計如表2所示的上下游引物序列。

表2 豬肌肉干細胞實時PCR（real-time PCR）所用引物Table 2 Primers used for real-time PCR analysis of porcine muscle stem cells

1.3.6 real-time PCR

以cDNA為模板對目標基因和內(nèi)參基因進行real-time PCR，使用TaKaRa的TB Green Premix ExTaqII試劑盒進行操作，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板稀釋適當倍數(shù)后使用，real-time PCR 20 μL反應混合液配制見表3（反應液配制在冰上進行）；PCR設置為 95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s和60 ℃延伸34 s PCR重復40 個循環(huán)，95 ℃變性15 s、60 ℃延伸1 min和95 ℃變性15 s溶解曲線分析。其中擴增效率的測定如下：將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA采用RNasefree水依次進行10×梯度稀釋，制作5 個濃度梯度（即原始cDNA濃度、×10-1、×10-2、×10-3和×10-4）。所有基因均按照上述PCR步驟進行擴增，得到標準曲線。根據(jù)斜率（k）計算擴增效率（e）。斜率k在-3.0～-3.5之間，PCR擴增效率e在90%～110%之間效果較好。相關系數(shù)R2越接近于1，結(jié)果越可信。當目的基因的擴增效率和管家基因的擴增效率相同時，以GAPDH作為內(nèi)參，目的基因相對表達量用2-ΔΔCt法計算，其中：ΔΔCt=（Ct處理組目標基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目標基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。

表3 real-time PCR體系（20 μL）Table 3 Real-time PCR system (20 μL)

1.3.7 豬肌肉干細胞總蛋白提取和蛋白質(zhì)量濃度測定

總蛋白提取：根據(jù)細胞量加入適量體積的RIPA裂解液（提前加入金屬蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和EDTA），冰上裂解30 min后用細胞刮收集裂解液，-20 ℃存放待用。

蛋白質(zhì)量濃度測定：12 000×g離心5 min，收集上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)操作說明進行實驗，步驟如下：將牛血清白蛋白標準品稀釋為2 000、1 500、1 000、750、500、250、125、25、0 μg/mL梯度溶液，用以繪制標準曲線。配制工作液（50 份試劑A與1 份試劑B混合），取96 孔板，每個實驗孔加入200 μL工作液和10 μL樣品或者梯度質(zhì)量濃度標準品，振蕩混勻后37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫。酶標儀設562 nm波長測定并計算樣品蛋白濃度，樣品用ddH2O稀釋至統(tǒng)一蛋白濃度。蛋白液和5×樣品緩沖液以4∶1體積比混合，95 ℃煮5 min，-20 ℃冷凍備用。

1.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：提前配好電泳緩沖液和轉(zhuǎn)印液，選用4%～20%的SurePAGE蛋白預制膠，每孔加15 μg蛋白。設置電泳程序：先80 V、30 min后120 V、90 min。

轉(zhuǎn)膜：將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放入甲醇中活化3～5 s，泡入轉(zhuǎn)印液里待用。從下往上按照海綿、2 層濾紙、活化的PVDF膜、凝膠、2 層濾紙、海綿的順序依次放好，放入電泳槽，加入預冷過的轉(zhuǎn)印液，90 V運行1.5 h。

封閉：用1×Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（tris buffered saline with Tween-20，TBST）配制5%脫脂奶粉，待膜轉(zhuǎn)印好時，取出放入5%脫脂奶粉中，室溫搖床封閉2 h后用1×TBST清洗1 次。

一抗和二抗孵育：用1×TBST稀釋一抗，4 ℃孵育14～16 h，回收一抗。1×TBST洗膜3 次，每次5 min。加入稀釋后的二抗孵育2 h，孵育結(jié)束后用1×TBST清洗3 次，每次5 min。

顯影后使用Quantity One軟件進行灰度分析。本實驗使用的內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計分析和作圖，進行單因素方差分析，所有處理組均與對照組（低密度組）進行比較，然后進行Dunnett多重比較檢驗，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高密度培養(yǎng)對豬肌肉干細胞增殖能力的影響

為探究不同接種密度短期培養(yǎng)對肌肉干細胞的影響，將分離得到的豬肌肉干細胞傳至第5代后以不同密度接種至細胞培養(yǎng)皿。從圖1A可以看到，肌肉干細胞大部分呈梭狀，部分剛完成分裂的肌肉干細胞呈圓形。隨著接種密度提高，細胞相互接觸程度逐漸增強，最高密度組細胞完全接觸，細胞表現(xiàn)出融合分化的趨勢。將細胞消化計數(shù)，結(jié)果顯示終密度分別為1.780×104、3.226×104、5.066×104、6.264×104cells/cm2（圖1B），細胞分別增殖了6.59、5.97、4.60、2.85 倍（圖1C）。3 組細胞擴增倍數(shù)相比對照組分別減少了9.3%、28.8%、56.0%。

圖1 以4 種不同密度接種的豬肌肉干細胞培養(yǎng)3 d后細胞形態(tài)（A）與計數(shù)結(jié)果（B、C）（n=3）Fig.1 Cell morphology (A) and count (B and C) of porcine muscle stem cells seeded at four different densities after three days of culture (n = 3)

細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，有ERK-1和ERK-2兩種亞型[20]，其在細胞生長的信號級聯(lián)反應中起核心作用，活化的ERK催化許多下游蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)在未轉(zhuǎn)化的成纖維細胞[23]、上皮細胞[24]和血管內(nèi)皮細胞[25]中，細胞間接觸會導致ERK的下調(diào)和細胞周期蛋白D1的下降。因此，為了從分子水平進一步了解高密度對豬肌肉干細胞增殖的影響，本研究以磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表達情況進一步分析。如圖2所示，不同密度接種培養(yǎng)3 d后的細胞ERK蛋白水平在前3 個密度下無明顯變化，最高接種密度組p-ERK1下調(diào)為對照組的58.6%（圖2B）。類似的，最高密度組p-ERK2下調(diào)為對照組的57.7%（圖2C）。綜上所述，豬肌肉干細胞在3 d內(nèi)的擴增倍數(shù)隨接種密度升高而逐漸下降，且下降幅度隨接種密度升高而加大。同時高密度培養(yǎng)下p-ERK蛋白的表達量下調(diào)，進一步證實高密度培養(yǎng)抑制豬肌肉干細胞增殖。

圖2 以4 種不同密度接種的豬肌肉干細胞培養(yǎng)3 d后p-ERK1/2蛋白Western Blot條帶顯影圖（A）及p-ERK1（B）、p-ERK2（C）蛋白表達水平（n=3）Fig.2 Western blot of p-ERK1/2 protein in porcine muscle stem cells seeded at four different densities after three days of culture and expression levels of p-ERK1 (B) and p-ERK2 (C) (n = 3)

2.2 高密度培養(yǎng)對豬肌肉干細胞轉(zhuǎn)錄組的影響

上述結(jié)果表明，高密度培養(yǎng)的豬肌肉干細胞增殖受到顯著抑制，為了系統(tǒng)性了解高密度接種條件下細胞基因表達譜的變化[26]，對2.7×103cells/cm2（對照組，L-D3）和2.2×104cells/cm2（實驗組，H-D3）兩組細胞樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，將測序結(jié)果進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、基因差異表達分析、差異基因京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析。如圖3A所示，實驗組與對照組的離散程度較大，表明兩組樣品的差異性較大。據(jù)測序結(jié)果，選取log2Fold change絕對值大于1，即細胞的基因表達在處理組和對照組中表達量上調(diào)/下調(diào)超過2 倍的基因進行差異表達分析[27-28]。如圖3B所示，和對照組相比，H-D3組顯著上調(diào)超過2 倍的基因共1 301 個，顯著下調(diào)2 倍的基因共824 個。如圖3C所示，H-D3與L-D3兩組中差異表達基因主要富集在細胞衰老、PI3K-Akt信號通路和細胞周期等通路。這些結(jié)果表明，高密度培養(yǎng)更易發(fā)生細胞衰老、細胞周期蛋白表達異常變化，這些信號通路的變化可能是造成高密度下豬肌肉干細胞增殖減緩以及干性衰退的重要原因之一，有待于進一步研究。

圖3 高密度接種豬肌肉干細胞培養(yǎng)3 d后的轉(zhuǎn)錄組測序分析Fig.3 Transcriptome sequencing results of porcine muscle stem cells inoculated at high density after three days of culture

2.3 高密度培養(yǎng)對豬肌肉干細胞命運基因的基因分析

轉(zhuǎn)錄組分析表明細胞高密度接種會導致細胞衰老以及周期蛋白表達異常等基因表達變化，然而富集在細胞的干性和分化等命運相關通路的顯示較少。為了進一步探究高密度對細胞命運的影響，本研究在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中篩選了與干性、分化和衰老相關的基因表達情況。在肌肉干細胞中，核轉(zhuǎn)錄因子PAX7是最重要的標志基因，對肌肉干細胞功能至關重要[29]，部分亞群同時也表達PAX3[30]，這兩個轉(zhuǎn)錄因子是肌肉干細胞在出生前和出生后最重要的標志物[31]。通過篩選每千堿基外顯子的序列片段數(shù)（number of sequenced fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，F(xiàn)PKM）發(fā)現(xiàn)，對照組PAX3和PAX7的FPKM較低，而高密度條件下PAX3和PAX7的表達量有一定上調(diào)（圖4A、B）。另外，Sprouty1（SPRY1）是酪氨酸激酶受體信號傳導抑制基因，通常在靜息狀態(tài)下PAX7陽性的肌肉干細胞中高表達，隨著肌肉干細胞的激活，表達量逐漸下調(diào)。肌肉干細胞在修復損傷后，SPRY1是一部分肌肉干細胞重新變成靜息狀態(tài)下，維持干細胞池穩(wěn)態(tài)必不可少的基因[32-33]。SPRY1基因的FPKM結(jié)果顯示，高密度條件下該基因也出現(xiàn)了上調(diào)表達（圖4C），表明高密度條件下部分豬肌肉干細胞可能轉(zhuǎn)變成了靜息狀態(tài)下的干細胞。

圖4 高密度接種的豬肌肉干細胞培養(yǎng)3 d后各基因轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果（n=3）Fig.4 Transcriptome sequencing results of several genes of highdensity seeded porcine muscle stem cells cultured for three days (n = 3)

針對分化相關基因MYOD和MYOG的轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（圖4D、E），表征分化起始的基因MYOD和表征分化進程中后期的標志性基因MYOG在高密度培養(yǎng)3 d條件下上調(diào)。另外，胚胎骨骼肌肌球蛋白重鏈3（MYH3）表征細胞分化形成新生肌管[34]，其隨著密度升高而上調(diào)表達進一步表現(xiàn)了分化進程（圖4F）。以上結(jié)果表明，高密度可能推動了肌肉干細胞的分化進程。

轉(zhuǎn)錄組學信號通路分析結(jié)果顯示，高密度條件下細胞發(fā)生了衰老，對標志性的衰老基因進行了分析。Zheng Quanhui等[35]研究發(fā)現(xiàn)P21參與甲基化介導的生物體衰老過程。Helmbold等[36]研究顯示P53是細胞衰老的主要調(diào)節(jié)因子。Liu Shuang等[37]研究發(fā)現(xiàn)敲除P15等能有效抑制人類真皮干細胞的衰老。因此P21、P53和P15作為經(jīng)典的衰老相關基因，被選為分析衰老基因表達變化的目標基因。P21、P53和P15基因的FPKM的結(jié)果顯示（圖4G～I），3 個衰老基因的表達都出現(xiàn)了上調(diào)，表明高密度條件下部分豬肌肉干細胞可能出現(xiàn)了衰老。

2.4 高密度培養(yǎng)對豬肌肉干細胞干性、分化以及衰老關鍵基因蛋白表達的影響

在成年肌肉中，衛(wèi)星細胞在靜止時表達PAX7、SPRY1、P57、Notch3和CD34等[32,38]。PAX7是肌肉干細胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子，一般通過免疫學標記PAX7的方法鑒定肌肉干細胞[39]。缺少PAX7表達的小鼠在出生時具有大量肌肉干細胞，但隨著細胞周期停滯和細胞凋亡增加，肌肉干細胞數(shù)量逐漸減少，在極少數(shù)活到成年期的小鼠中，其肌肉再生能力受到損害[40-41]。經(jīng)過蛋白免疫印跡檢測，如圖5A所示，與對照組相比，5.4×103、1.1×104、2.2×104cells/cm2組PAX7的蛋白表達水平分別上調(diào)到1.70、2.66、2.70 倍，高密度培養(yǎng)顯著上調(diào)PAX7的蛋白表達（P＜0.01）。本研究結(jié)果顯示，SPRY1在轉(zhuǎn)錄水平上隨著接種密度的升高而升高，和對照組相比，5.4×103、1.1×104、2.2×104cells/cm2組分別上調(diào)到1.07、1.25、1.81 倍，最高密度組的SPRY1表達顯著升高（P＜0.01）（圖5B）。結(jié)果表明，豬肌肉干細胞在一定的高密度培養(yǎng)條件下，可能是通過SPRY1的作用，讓一部分肌肉干細胞由激活狀態(tài)重新變成靜息狀態(tài)，從而上調(diào)了PAX7的表達。以上結(jié)果表明在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，豬肌肉干細胞的干性隨接種密度升高而升高。

圖5 不同密度接種豬肌肉干細胞培養(yǎng)3 d后的蛋白及轉(zhuǎn)錄水平（n=3）Fig.5 Transcript and protein levels of porcine muscle stem cells with different seeding densities cultured for three days (n = 3)

在轉(zhuǎn)錄組學分析中，還發(fā)現(xiàn)細胞的分化基因也出現(xiàn)了上調(diào)。MYOG是肌生成過程中的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，當細胞分化時開始表達，并隨著分化進程逐漸上調(diào)，當形成肌管時再次下調(diào)[42]。為了檢測高密度培養(yǎng)對肌肉干細胞分化能力的影響，利用real-time PCR和Western Blot檢測了分化關鍵基因MYOG的表達。如圖5C所示，realtime PCR結(jié)果顯示，和對照組相比，5.4×103、1.1×104和2.2×104cells/cm2組的MYOG在轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)到2.08、10.68、68.35 倍，最高密度組比對照組有顯著上調(diào)（P＜0.05）。在蛋白水平，5.4×103、1.1×104、2.2×104cells/cm2組的MYOG蛋白水平分別上調(diào)到1.42、1.36、4.13 倍，最高密度組顯著上調(diào)（P＜0.001），以上結(jié)果說明在高密度培養(yǎng)條件下，部分肌肉干細胞進入了細胞的分化進程。

轉(zhuǎn)錄組學研究顯示，高密度培養(yǎng)抑制肌肉干細胞增殖，且高密度下衰老相關通路中的P21等基因顯著上調(diào)，為了驗證轉(zhuǎn)錄組學的研究結(jié)果，檢測了衰老相關基因P21的表達。如圖5D所示，培養(yǎng)3 d后P21的轉(zhuǎn)錄水平隨著接種密度的升高而升高，5.4×103、1.1×104、2.2×104cells/cm2組分別上調(diào)為對照組的1.72、3.25、4.29 倍，高密度兩組顯著上調(diào)（P＜0.01）。因此，在高密度條件下，細胞周期蛋白的表達變化可能是細胞增殖能力變化的潛在原因，但其上游通路中基因的表達情況還需要進一步研究。

以上結(jié)果表明，高密度培養(yǎng)條件一方面促使部分細胞進入靜息狀態(tài)維持干細胞池；另一方面推動部分細胞肌源分化，同時還導致了一定數(shù)目細胞的衰老。

3 討 論

已有大量研究表明，動物細胞在高密度培養(yǎng)條件下會發(fā)生“接觸抑制”現(xiàn)象，即細胞的增殖能力顯著下降。Nakatsuji等[43]證明I型星形膠質(zhì)細胞在增殖過程中產(chǎn)生明顯的接觸抑制，但并未指出其中的機制。之后Nakatsuji等[44]又在研究中發(fā)現(xiàn)p27Kip1上調(diào)、cyclin A下調(diào)是星形膠質(zhì)細胞增殖產(chǎn)生接觸抑制的原因。加入外源性表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）能提高高密度下的細胞增殖并形成多個細胞層。但EGF的加入并不能很大程度地改變p27Kip1和cyclin A的水平，而是提高了cyclin D1的水平。在FH109人胚胎成纖維細胞中[45]，接觸抑制僅通過相鄰細胞上兩種細胞蛋白的相互作用介導，即通過糖蛋白接觸抑制素與之結(jié)合[46]，受體稱為接觸抑制素受體[47]。腫瘤抑制因子p16lnk4和Cdk4之間締合的增加[48]以及p27Kip1和Cdk2/cyclin E復合體的締合增加[49]會產(chǎn)生抗增殖信號，從而導致細胞阻滯在G1期。最后的結(jié)果是視網(wǎng)膜母細胞瘤基因產(chǎn)物保持低磷酸化狀態(tài)，從而抑制其進入細胞周期S期的進程[48-50]。因此，密度引發(fā)的細胞周期通路變化是細胞接觸抑制最直接的原因。Leontieva等[51]研究發(fā)現(xiàn)，細胞衰老分兩步發(fā)生，首先是細胞周期停滯，這部分可由高密度引起并且可逆，第二步是衰老轉(zhuǎn)化，將可逆的停滯變?yōu)椴豢赡娴乃ダ?，這部分與mTOR信號通路相關。本研究結(jié)果顯示，在高密度條件下，豬肌肉干細胞也出現(xiàn)了明顯的接觸抑制現(xiàn)象，相關細胞衰老和周期基因出現(xiàn)了上調(diào)。另外，本研究轉(zhuǎn)錄組學也揭示了相關差異蛋白富集到了PI3K-Akt信號通路，與前人的結(jié)果吻合。

PAX7是肌肉干細胞的干性標志基因，結(jié)果表明細胞干性隨接種密度升高而增加。進一步研究調(diào)節(jié)肌肉干細胞可逆的靜止激活狀態(tài)的基因SPRY1發(fā)現(xiàn)，SPRY1隨著密度的上升逐漸升高。SPRY1通常在靜息狀態(tài)下PAX7陽性的肌肉干細胞高表達，隨著肌肉干細胞的激活表達量逐漸下調(diào)[32]。若降低SPRY1的表達，則會顯著減少靜息狀態(tài)下的肌肉干細胞并且提高了凋亡的細胞比例。另外，研究發(fā)現(xiàn)SPRY1的作用可能是通過抑制ERK信號通路實現(xiàn)[32]。本研究也發(fā)現(xiàn)了高密度培養(yǎng)下磷酸化ERK蛋白的表達量下調(diào)。但在高密度條件下，SPRY1調(diào)節(jié)豬肌肉干細胞的PAX7的表達還需要深入研究。

高密度培養(yǎng)條件還會影響細胞的分化。例如，在角質(zhì)細胞分化方案中增加初始hPSC接種密度會增加分化終末K18＋/p63＋簡單上皮細胞的數(shù)量，提高細胞純度[52]。Hsiao等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在貼壁情況下，hPSC分化為神經(jīng)上皮祖細胞和神經(jīng)元的動力學水平和分化程度以YAP依賴的方式受細胞接種密度影響，細胞接種密度越高，分化程度越高。Singh等[54]研究了胚胎干細胞向FLK1＋血管祖細胞的分化轉(zhuǎn)變與細胞密度和細胞代謝的關系，發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變依賴于較高的接種密度，且與代謝物的轉(zhuǎn)變有關。在間充質(zhì)干細胞中，有研究得到基質(zhì)彈性和細胞密度是驅(qū)使人間充質(zhì)干細胞增殖和分化的重要微環(huán)境因素[55]。高密度培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細胞，其成骨分化程度更高并伴隨著ERK蛋白表達的下降[56]。高密度培養(yǎng)也改變了牙髓干細胞的特性，并通過整合素信號的傳導產(chǎn)生了更多致力于成骨分化的細胞[57]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了高密度條件會促進成肌細胞的分化進程。

4 結(jié) 論

肌肉干細胞在高密度培養(yǎng)條件下產(chǎn)生接觸抑制，增殖減緩。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學和后續(xù)的驗證，發(fā)現(xiàn)高密度培養(yǎng)一方面促進部分細胞進入靜息狀態(tài)維持干細胞池，表現(xiàn)為干性基因上調(diào)；另一方面，高密度促進細胞分化進程，表現(xiàn)為分化相關基因上調(diào)；此外，高密度還導致了細胞衰老，表現(xiàn)為衰老基因上調(diào)。本研究結(jié)果有助于理解高密度下細胞命運決定機制，為細胞培養(yǎng)肉研究在高密度條件下調(diào)節(jié)細胞增殖分化提供一定的理論基礎。