付國輝, 黃麗杰, 岳 磊, 劉娜娜, 閆懿高

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院中藥教研室,鄭州 451191; 2.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所,鄭州 450000)

小柴胡顆粒是一個(gè)由多味藥材組成的復(fù)方中成藥制劑,其組方有柴胡、黃芩、姜半夏、黨參、生姜、甘草和大棗七味藥材。小柴胡顆粒組方來源于東漢名醫(yī)張仲景的醫(yī)學(xué)著作《傷寒雜病論》中的經(jīng)典和解劑名方小柴胡湯。小柴胡湯中所用人參在小柴胡顆粒中替換成了黨參,且在小柴胡顆粒中增大了大棗的用量。小柴胡顆粒有解表散熱、疏肝和胃的功能,臨床上主要用于外感病,邪犯少陽證,常見病癥有寒熱往來、胸脅苦滿、食欲缺乏、心煩喜嘔和口苦咽干等。

小柴胡顆粒的標(biāo)準(zhǔn)雖已建立,但對(duì)其研究仍在繼續(xù),且存有爭議之處。參考2020年版《中國藥典》一部可知,在其含量測定項(xiàng)下僅以黃芩苷一個(gè)化合物作為指標(biāo)性成分,而黃芩苷主要存在于臣藥黃芩中,作為君藥且用量最大的柴胡卻沒作任何規(guī)定,評(píng)價(jià)指標(biāo)略顯單薄。因此,其檢驗(yàn)檢測評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍有值得研究之處。

在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,通過反復(fù)確證,最終以中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)模式對(duì)小柴胡顆粒進(jìn)行考察。自2016年劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物[1]概念以來,利用此模式對(duì)中藥材、中藥飲片及中成藥進(jìn)行研究的文獻(xiàn)逐年增多,如今距此概念提出已達(dá)六年之久,該模式已得到了較為普遍的推廣,經(jīng)受住了時(shí)間和研究者們的考驗(yàn),顯示了其創(chuàng)新性和科學(xué)性。本文基于該模式中的“五要素”對(duì)小柴胡顆粒進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測分析,為科學(xué)、系統(tǒng)、綜合和全面地評(píng)價(jià)小柴胡顆粒提供充足的理論依據(jù)。

1 化學(xué)成分

化學(xué)成分是中藥起效的物質(zhì)基礎(chǔ),化學(xué)成分種類和含量的差異直接影響到藥物的治療效果。當(dāng)其具備的條件成熟,中藥成分就能成為反映中藥質(zhì)量的標(biāo)志物(quality marker,Q-markers)[1]。截至目前,無論是水提取部位或是醇提取部位,均尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)小柴胡顆粒復(fù)方制劑的化學(xué)成分研究,化學(xué)成分研究局限于單味藥材和復(fù)方制劑顆粒中多成分的含量同時(shí)測定。馬蓉等[2]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜(UHPLC-MS)技術(shù)分離鑒定出66種化學(xué)成分。張慧等[3]利用高效液相色譜(HPLC)紫外單波長法對(duì)小柴胡顆粒中7種指標(biāo)性成分進(jìn)行了同時(shí)測定,包括甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素。張雪等[4]基于小柴胡顆粒的生產(chǎn)工藝制備小柴胡顆?；鶞?zhǔn)樣品,采用UPLC法建立小柴胡顆粒中8種化學(xué)成分的含量測定方法,包括柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草苷、甘草皂苷G2和甘草酸。莊延雙等[5]建立了小柴胡顆粒的特征圖譜并同時(shí)測定了5種指標(biāo)性成分的含量,包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素和甘草次酸。王嘉林等[6]采用HPLC-MSMS法測定了小柴胡顆粒中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量?；谝陨涎芯?預(yù)測柴胡皂苷a(SSa)、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷d(SSd)、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、甘草苷、甘草酸、甘草次酸和甘草皂苷G2可能作為小柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)志物。

2 藥理作用

2.1 調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤 趙艷玲[7]發(fā)現(xiàn),在對(duì)52例感染性心肌炎患者在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用小柴胡顆粒進(jìn)行治療后,外周血T淋巴細(xì)胞亞群中(CD3+、CD4+、CD8+)及NK水平提高,心肌酶譜指標(biāo)中血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)水平降低,心肌損傷的特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T水平均降低,表明小柴胡顆粒能減輕心肌損傷,增強(qiáng)細(xì)胞的免疫功能,提高臨床有效率。小柴胡顆粒具有明顯提高機(jī)體免疫力的作用,而免疫系統(tǒng)在抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用[8]。張軍能等[9]通過建立小鼠lewis肺癌模型,比較小柴胡顆粒治療組和磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注組小鼠的生存率、荷瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移情況及腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的差異,結(jié)果表明與磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注組小鼠相比,小柴胡顆粒治療組小鼠的生存率明顯提高,肺部病灶轉(zhuǎn)移少,腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng),脾臟分泌的細(xì)胞因子TNF-α(抗腫瘤活性最強(qiáng)因子)、IFN-γ(提高NK細(xì)胞的活性因子)和IL-2(提高T細(xì)胞抗腫瘤活性因子)升高,IL-4(抑制T細(xì)胞活性因子)下降,表明小柴胡顆粒是通過提高天然免疫細(xì)胞的殺傷力,增加抗瘤細(xì)胞因子的分泌達(dá)到抗腫瘤作用。

2.2 抗炎保肝 張旭等[10]運(yùn)用小柴胡顆粒對(duì)28例重度全身性感染性腎損傷患者進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn),臟器功能指標(biāo)血清胱抑素C(CysC)和急性炎癥指標(biāo)血清降鈣素原(PCT)水平均降低,表明小柴胡顆粒具有較好的抗炎作用。賈為壹等[11]使用硫代乙酰胺(TAA)造模大鼠急性肝損傷,通過小柴胡顆粒的治療,確定大鼠病變范圍和程度均有所改善,研究發(fā)現(xiàn)是因激活了Nrf2信號(hào)通路和下游分子醌氧化還原酶1(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸合成酶催化亞基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸合成酶調(diào)節(jié)亞基(GCLM)的信使RNA和蛋白表達(dá),對(duì)急性肝損傷具有良好的治療作用。

2.3 退熱 馬蓉等[2]在小柴胡顆粒中確證了66種化合物,篩選出68個(gè)潛在退熱靶點(diǎn),對(duì)7個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,研究顯示小柴胡顆粒退熱機(jī)制與機(jī)體多個(gè)發(fā)熱環(huán)節(jié)相關(guān)聯(lián),具有很好的退熱效果。畢聰?shù)萚12]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的組方配伍規(guī)律解析了小柴胡顆粒的退熱作用及其機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)27個(gè)腫瘤壞死因子信號(hào)通路,確證了5個(gè)由7味藥材共同作用的核心靶點(diǎn)核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和胱天蛋白酶3(CASP3)組成的多靶點(diǎn)協(xié)同退熱治療。

3 臨床應(yīng)用

3.1 上呼吸道感染 翟登合等[13]觀察小柴胡顆粒聯(lián)合蒲地藍(lán)消炎口服液對(duì)治療上呼吸道感染的影響,結(jié)果顯示患者治療總有效率可達(dá)95.0%,癥狀消失時(shí)間明顯縮短。在給予患者阿奇霉素片常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,加用小柴胡顆粒和連花清瘟膠囊進(jìn)行治療,結(jié)果顯示聯(lián)合小柴胡顆粒和連花清瘟膠囊治療的效果優(yōu)于單獨(dú)使用阿奇霉素片,血常規(guī)(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例)和血清干擾素-γ(IFN-γ)均較低,有效提高了臨床療效[14]。陳瑛[15]選取110例流行性上呼吸道感染患者為研究對(duì)象,隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組,各55例,觀察組給予小柴胡顆粒,對(duì)照組給予酚咖片,療程為3 d,觀察治療結(jié)果,發(fā)現(xiàn)2組免疫功能指標(biāo)(CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)均顯著提高,炎癥指標(biāo)(中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù))、血清C反應(yīng)蛋白(CRP)及體溫均降低明顯,但觀察組效果更佳,且治療過程中未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng),提示安全性較高,說明小柴胡顆粒治療上呼吸道感染有較大優(yōu)勢。

3.2 慢性支氣管炎 姜振[16]探討小柴胡顆粒在治療慢性支氣管炎患者中的作用,聯(lián)合羧甲司坦口服溶液治療一周后,患者的咳痰、發(fā)熱、肺部啰音和咽喉疼痛癥狀均明顯消失或減輕。劉珊珊等[17]研究發(fā)現(xiàn),在服用小柴胡顆粒聯(lián)合鹽酸氨溴索注射液治療2周后,患者呼吸狀況和肺功能(FEV1、FEV1%)明顯改善,治療效果較佳。在對(duì)慢性支氣管炎急性發(fā)作期的治療中,小柴胡顆粒聯(lián)合鹽酸氨溴索霧化吸入方式治療取得了良好的臨床效果,與治療前相比,患者在臨床有效率、臨床癥狀消失時(shí)間、肺功能變化、炎癥因子水平(IL-6、IL-8、TFN-α)的變化等方面都取得了滿意效果,該聯(lián)合用藥,有明顯縮短臨床癥狀、提高臨床效率、提升肺功能和顯著降低炎癥因子水平等優(yōu)勢[18]。李玉輝等[19]用Meta分析法對(duì)5篇文獻(xiàn)進(jìn)行探究,考察小柴胡顆粒聯(lián)合西藥治療慢性支氣管炎的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥治療總有效率均顯著提高,其他常見指標(biāo)均取得滿意效果,且在治療同時(shí)配合體育療法,可實(shí)現(xiàn)延長患者復(fù)發(fā)時(shí)間間隔、增強(qiáng)患者呼吸系統(tǒng)功能和減少組織破壞等效果[20]。

3.3 胃食管反流 方向前[21]研究在使用莫沙比利與奧美拉唑聯(lián)合治療胃食管反流病(GERD)的基礎(chǔ)上加用小柴胡顆粒進(jìn)行治療。結(jié)果三藥聯(lián)用顯示出更高的治愈率和總有效率,臨床效果顯著。有研究[22]還發(fā)現(xiàn),在使用泮托拉唑和莫沙比利治療的基礎(chǔ)上加用小柴胡顆粒治療反流性食管炎(RE),能較好地改善患者的生活質(zhì)量和抑郁水平。還有西藥聯(lián)合小柴胡顆粒和左金丸共同治療胃食管反流病的臨床研究,均取得良好的臨床效果[20]。

3.4 聯(lián)合用藥 李兆華等[23]采用厄貝沙坦聯(lián)合小柴胡顆粒治療慢性腎功能不全,結(jié)果顯示患者24 h尿蛋白、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平均顯著降低,總有效率顯著升高,聯(lián)合用藥可從多途徑改善腎功能,從局部和整體對(duì)患者進(jìn)行綜合治療。黃峰等[24]發(fā)現(xiàn)小柴胡顆粒聯(lián)合大黃粉膠囊治療重型肝炎,可以明顯改善重型肝炎癥狀,降低并發(fā)癥的發(fā)生率,提高生存率,且小柴胡顆粒的抗纖維化作用在治療重型肝炎中意義重大。余黃鵬等[25]臨床探討小柴胡顆粒聯(lián)合高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)方式治療艾滋病,研究顯示小柴胡顆?？山档陀蒆AART治療引起的不良反應(yīng),提高患者免疫力、服藥依從性和生活質(zhì)量。王榮[26]在通過臨床分組研究膽囊切除術(shù)后綜合征的治療中發(fā)現(xiàn),小柴胡顆粒聯(lián)合馬來酸曲美布汀和鹽酸多塞平共同治療比單純使用馬來酸曲美布汀和鹽酸多塞平治療可提高治療總有效率,癥狀積分降低,顯著改善了患者的臨床癥狀。廖觀全[27]觀察小柴胡顆粒聯(lián)合馬來酸曲美布汀片治療腸易激綜合征(IBS),比較聯(lián)合用藥和僅使用馬來酸曲美布汀片治療前后的IBS-SSS評(píng)分及療效,結(jié)果顯示聯(lián)合用藥IBS嚴(yán)重程度量表(IBS-SSS)評(píng)分較低,臨床癥狀顯著改善,體現(xiàn)了中西醫(yī)結(jié)合治療的特色。

3.5 其他臨床用藥 李素那等[28]將使用小柴胡顆粒治療經(jīng)期外感的患者臨床結(jié)果與使用酚麻美敏片治療的38例患者臨床結(jié)果進(jìn)行對(duì)比觀察,結(jié)果顯示與服用酚麻美敏片相比,服用小柴胡顆粒治療經(jīng)期外感療效顯著。張鈺[29]在臨床治療中發(fā)現(xiàn),小柴胡顆粒配合其他湯劑使用可使風(fēng)熱感冒患者病情得到快速好轉(zhuǎn)。林鳴[30]研究發(fā)現(xiàn),服用小柴胡顆粒并結(jié)合外治法治療體虛風(fēng)寒感冒可以取得很好的療效,如結(jié)合拔火罐、照神燈等治療比單純使用小柴胡顆粒治療療程更短。在對(duì)復(fù)發(fā)性口瘡復(fù)發(fā)率的影響研究中發(fā)現(xiàn),隨訪2年后的結(jié)果顯示,使用小柴胡顆粒治療復(fù)發(fā)性口瘡可以顯著降低復(fù)發(fā)率,并顯著優(yōu)于目前使用的常規(guī)治療方法。

4 質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析

自中藥質(zhì)量標(biāo)志物提出以來,已經(jīng)產(chǎn)生了不少科研理論和實(shí)踐成果,此概念在中藥研究領(lǐng)域愈加顯示出其獨(dú)特的分析研究視角,為建立全新的藥物質(zhì)量管理體系發(fā)揮了重要作用。小柴胡顆粒組方配伍獨(dú)特,兼具祛邪扶正、透表清里和疏肝治脾的功效,性平,和緩,顧全局。本文依據(jù)Q-marker“五要素”中的“中藥功效-作用機(jī)制關(guān)聯(lián)性”“生物學(xué)-有效性、安全性”“質(zhì)量物質(zhì)可測性”和“質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性”等原則對(duì)小柴胡顆粒質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測分析,以期為其全面研究提供參考。

4.1 基于中藥成分特有性的Q-marker預(yù)測分析

4.1.1 柴胡 柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld. 的干燥根。又習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡的主要化學(xué)成分有皂苷類、揮發(fā)油、多糖、甾醇和黃酮等,還有其他如多元醇、香豆素、脂肪酸等十多類成分[31]。柴胡皂苷為皂苷類的主要活性成分,其中有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f等150多種柴胡皂苷[32]。溫度和pH值對(duì)柴胡皂苷的提取有很大影響,有研究[33]發(fā)現(xiàn),I型原生皂苷中SSa、SSd等結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,尤其在高溫或酸性條件下,環(huán)氧醚鍵斷裂后轉(zhuǎn)化為Ⅱ型柴胡皂苷B1和B2等次生皂苷,對(duì)提取工藝要求較為嚴(yán)格,適宜在低溫及堿性條件下進(jìn)行提取;以醋炮制后總皂苷含量下降,用蜜炮制后總皂苷含量升高明顯[34]。因此,在進(jìn)行藥物質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)時(shí),應(yīng)綜合考慮提取工藝對(duì)藥物內(nèi)部化學(xué)成分的影響,以免造成誤判?！吨袊幍洹穬H規(guī)定了北柴胡的含量測定指標(biāo)性成分,規(guī)定含SSa和SSd的總量不得少于0.30%[35]。作為柴胡的有效成分之一,揮發(fā)油的研究目前僅停留在成分的分析鑒定研究階段。李勇慧等[36]在柴胡中共分析鑒定出64種揮發(fā)油成分,分別為酸類、酯類、酮類、醇類和烷羥類化合物,含量較大的成分有(Z,Z)-9,12-十八烯酸、十八烯酸、n-十六烷酸、鄰苯二甲酸二丁酯、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-乙酮和Z-5-甲基-6-二十一碳烯-11-酮等。目前僅有王鵬等[37]關(guān)于柴胡中揮發(fā)油含量測定的報(bào)道,利用重量法對(duì)不同采收期的柴胡中揮發(fā)油總成分進(jìn)行測定,且與此相關(guān)聯(lián)的體內(nèi)藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究也很少,若作為評(píng)價(jià)柴胡的指標(biāo)性成分,還需要做進(jìn)一步的探索研究。柴胡中活性成分多糖類,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[38-39],主要單糖有阿拉伯糖和半乳糖,以及木糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖醛酸等,目前并無柴胡多糖的含量測定報(bào)道。甾醇類也是柴胡的有效活性成分,主要有β-菠甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麥角-7-烯醇葡萄糖苷等[40]。黃酮類作為活性成分之一,主要大量存在于柴胡地上部分,有蘆丁、異鼠李素及異鼠李素糖苷類、山奈酚及山奈酚糖苷類、槲皮素及槲皮素糖苷類和曲克蘆丁等成分,梅贊等[41]測定了4種柴胡地上部分中6種黃酮類成分(蘆丁、廣寄生苷、水仙苷、槲皮素、山柰素、異鼠李素)的含量,可為柴胡地下部分黃酮類成分含量研究提供借鑒。綜上可知,柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷f可作為柴胡Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.2 黃芩 黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。黃芩主要化學(xué)成分有黃酮類、多糖類、揮發(fā)油和甾類等。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[42-44],黃芩中黃酮類特異性活性成分主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、野黃芩苷、白楊素、千層紙素A、芹菜素、木犀草素、異紅花素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、韌黃芩素-I、黃芩黃酮-Ⅱ等。牛宇龍等[45]采用HPLC法測定黃芩中6種黃酮類化合物的含量,其中黃芩苷的含量最高,黃芩素次之,其次為漢黃芩素、野黃芩苷、千層紙素A和白楊素。房佳敏等[46]收集4個(gè)不同產(chǎn)地的黃芩樣品,對(duì)其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素4種成分進(jìn)行含量測定,并考察黃芩提取物中化學(xué)成分含量高低對(duì)A549肺癌細(xì)胞的抑制作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549肺癌細(xì)胞的存活率與黃芩提取物中化合物呈濃度依賴性,化合物含量越高,A549肺癌細(xì)胞存活率越低,表明黃芩提取物中化學(xué)成分具有抑制肺癌細(xì)胞增值的效果。《中國藥典》中黃芩藥材以黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素作為黃芩藥材的定性鑒別指標(biāo),含量測定指標(biāo)性成分為黃芩苷,規(guī)定含量不得少于9.0%[47]。綜合分析,黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、野黃芩苷、千層紙素A和白楊素可作為黃芩Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.3 半夏 半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。為常用有毒中藥,化學(xué)成分有生物堿類、有機(jī)酸類、氨基酸類、揮發(fā)油、苯丙素類、黃酮類和糖類等[48-49]。臨床所用半夏炮制品有生半夏、法半夏、姜半夏和清半夏,小柴胡顆粒組方所用半夏為姜半夏,引入生姜強(qiáng)化了半夏的止嘔作用,弱化了化痰和止咳作用?，F(xiàn)代臨床及藥理學(xué)有研究[50]表明,與炮制前相比,炮制后的姜半夏中生物堿(麻黃堿、膽堿、葫蘆巴堿、核苷類)、蛋白類(鳥苷、尿苷、腺苷)、多糖、草酸鈣和β-谷甾醇含量均有所降低,有機(jī)酸含量升高[51]。半夏中生物堿具有鎮(zhèn)咳祛痰和抗癲癇等作用,半夏多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用,有機(jī)酸具有鎮(zhèn)咳祛痰、平喘、止瀉等作用,半夏蛋白具有抗早孕、抗凝血作用,而半夏生物堿、有機(jī)酸、多糖、蛋白等都表現(xiàn)出抗腫瘤和止嘔作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[52-53],目前對(duì)姜半夏進(jìn)行測定的化學(xué)成分有肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、6-姜辣素、鹽酸麻黃堿、多糖和有機(jī)酸?！吨袊幍洹芬徊坎⑽磳?duì)姜半夏作指標(biāo)性成分的規(guī)定。綜合分析,肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、6-姜辣素、鹽酸麻黃堿、多糖、有機(jī)酸可作為半夏Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.4 生姜 生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖。作為一種藥食同源的植物,生姜的使用歷史悠久,在傳統(tǒng)醫(yī)藥中占有非常重要的地位。生姜的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷類、黃酮類、氨基酸類、多糖類和微量元素等。生姜中揮發(fā)油主要分為單萜烯類及其氧化物和倍半萜烯類及其氧化物,化學(xué)成分有姜烯、α-姜黃烯、蒎烯、α-蒎烯、茨烯、水芹烯、β-水芹烯、3-(1,5-二甲基-4-己烯基)-6-亞甲基-環(huán)己烯、桉油精、龍腦、橙花醇、檸檬醛和松油醇等[54-55]。姜辣素的主要化學(xué)成分有姜酚(6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚)、姜烯酚(6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚)、姜酮酚和姜油酮、1-去氫姜辣二酮等[56-57]。劉琳琪等[54]在對(duì)從9種不同產(chǎn)地生姜揮發(fā)油中分離鑒定出的化學(xué)成分的分析中發(fā)現(xiàn),85%～94%為單萜類和倍半萜類,且β-水芹烯和姜烯含量最高,其次為姜黃烯。《中國藥典》一部[58]生姜含量測定項(xiàng)下規(guī)定揮發(fā)油不得少于0.12%(mg/g),6-姜辣素、8-姜酚和10-姜酚總量不得少于0.040%。綜合分析,揮發(fā)油、β-水芹烯、6-姜辣素、姜烯、姜黃烯、8-姜酚和10-姜酚可作為生姜Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.5 黨參 黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根。目前對(duì)黨參化學(xué)成分的研究已很成熟,在已分離鑒定出的二百多種化學(xué)成分中,生物堿類、聚炔類、木質(zhì)素類、黃酮類和多糖被認(rèn)為是主要活性成分[59]。較為常見的生物堿有黨參堿、黨參次堿、管花黨參堿A～B、黨參吡咯烷鎓B和黨參腦苷脂A等;炔類及烯類成分有黨參炔醇、黨參炔苷、黨參炔苷寧、黨參二炔苷A～G、黨參烯炔苷A～B、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅲ和黨參炔A～B等;木質(zhì)素類成分有黨參苷Ⅰ～Ⅵ、黨參苷Ⅷ、去氫雙松柏醇、丁香苷、紫丁香苷和松柏苷等;酚酸和有機(jī)酸類成分有黨參酸、煙酸、阿魏酸、丁香酸和綠原酸等[60]。張璐[61]采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化了黨參中黨參炔苷含量測定的提取工藝,并運(yùn)用HPLC法測定了黨參炔苷的含量。劉付松等[62]利用HPLC法建立了黨參中5種化學(xué)成分含量測定的方法,測定并比較了不同品種及采收期黨參藥材中黨參炔苷、丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅱ、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅲ的含量,結(jié)果顯示不同品種和采收期藥材中5種成分含量存在較大差異。陳娟等[63]測定了黨參中紫丁香苷、黨參炔苷和蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅲ的含量,結(jié)果顯示回收率高,重復(fù)性良好。《中國藥典》一部[64]中黨參藥材無含量測定項(xiàng)目,僅以黨參炔苷作為定性指標(biāo)用以薄層色譜法中黨參藥材的鑒別。綜合分析,黨參炔苷、丁香苷、紫丁香苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅱ和蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅲ可作為黨參Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.6 大棗 大棗為鼠李科植物棗ZiziphusjujubeMill.的干燥成熟果實(shí)。大棗化學(xué)成分復(fù)雜,主要化合物類型有三萜類(主要類型有羽扇豆烷型、齊墩果烷型和Ceanothane型3種)、黃酮類、糖苷類、核苷類(cAMP、cGMP)及各種氨基酸等?，F(xiàn)已分離鑒定出的三萜類化合物有樺木酮酸、齊墩果酮酸、樺木酸、齊墩果酸、羽扇豆醇、麥珠子酸和白樺脂酮酸等[65-66]。黃酮類化合物有蘆丁、當(dāng)藥黃素和棘苷[67]。郭盛等[68]基于一測多評(píng)法測定大棗藥材中6種三萜酸類化學(xué)成分(白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、樺木酮酸、齊墩果酮酸和熊果酮酸),以白樺脂酸對(duì)照品為內(nèi)參物,計(jì)算結(jié)果與各成分外標(biāo)法計(jì)算所得數(shù)值相比較無顯著性差異,顯示該方法可行。侯廣月等[69]采用HPLC二極管陣列檢測器法測定大棗中齊墩果酸、熊果酸、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的含量,方法簡便、快速和可靠。王福玲等[70]探討了大棗中總黃酮的提取工藝,并以蘆丁對(duì)照品為指標(biāo)性成分,采用紫外分光光度法測定大棗中總黃酮的含量,該法重現(xiàn)性好、結(jié)果穩(wěn)定。李昊月等[71]測定了4個(gè)產(chǎn)地大棗中18種氨基酸的含量,發(fā)現(xiàn)包括8種人體必需的氨基酸在內(nèi)的18種氨基酸均存在于4個(gè)產(chǎn)地(山西汾陽、新疆和田、陜西延安、河南新鄭)的大棗中,且新疆大棗中氨基酸總含量最高。此外還有多糖[72]、維生素[73]等的含量測定。《中國藥典》一部[74]中大棗藥材無含量測定項(xiàng)目,鑒別項(xiàng)下也未指定任何指標(biāo)性成分,原因可能與至今仍未發(fā)現(xiàn)大棗藥材中的特有化合物有關(guān)。綜合分析,白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、樺木酮酸、齊墩果酮酸、熊果酮酸、cAMP、cGMP和氨基酸可暫作為大棗Q-marker的目標(biāo)化合物。

4.1.7 甘草 甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖。甘草的主要化學(xué)成分有三萜類、黃酮類和香豆素類,此外還有多糖類、生物堿、揮發(fā)油和微量元素等。三萜類活性成分有18α-甘草酸、18β-甘草酸及甘草次酸;黃酮類主要活性成分為甘草素、異甘草素、甘草苷和異甘草苷。此外,甘草次酸為甘草酸的水解產(chǎn)物,三萜類成分在光果甘草中的含量最高,黃酮類在烏拉爾甘草中含量最高[75]。不同基原甘草的化學(xué)成分差異較大,為更好地在臨床使用,應(yīng)在使用前加以區(qū)分。陳佳等[76]探討了新疆地區(qū)光果甘草和脹果甘草化學(xué)成分的差異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可將新異甘草苷、異甘草苷、甘草查耳酮A、甘草苷、甘草酚、甘草皂苷G2及異甘草素7個(gè)化學(xué)成分作為區(qū)分2個(gè)基原甘草藥材的差異性化學(xué)成分?！吨袊幍洹芬徊縖77]中甘草藥材含量測定項(xiàng)下設(shè)置了2個(gè)指標(biāo)性成分,分別為含甘草苷不得少于0.50%和甘草酸不得少于2.0%。綜合分析,甘草素、異甘草素、甘草苷、異甘草苷、甘草酸和甘草皂苷G2可作為甘草Q-marker的目標(biāo)化合物。因甘草中總黃酮和總?cè)祁惡吭诟什莘N屬間具有顯著性差異[78],因此,建議將光甘草定作為光果甘草的特異性質(zhì)量標(biāo)志物,將甘草查耳酮A作為脹果甘草的特異性質(zhì)量標(biāo)志物。

4.2 基于成分與藥效關(guān)聯(lián)性的Q-marker預(yù)測分析 中藥化學(xué)成分復(fù)雜,且存在初級(jí)代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物之分,經(jīng)過生產(chǎn)工藝提取后中成藥制劑中化學(xué)成分更加復(fù)雜多樣,因此,對(duì)中成藥制劑中化學(xué)成分與藥效間的關(guān)聯(lián)性研究變得極為重要。厘清中成藥制劑中化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)系,對(duì)于藥物在臨床上的合理應(yīng)用極具現(xiàn)實(shí)意義。

馬蓉等[2]使用UHPLC-MS技術(shù)分離鑒定出小柴胡顆粒中66個(gè)化合物,其中包括山奈酚、柴胡皂苷B2、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷、6-姜辣素、甘草素、甘草黃酮醇、甘草苷、甘草次酸、甘草酸、甘草皂苷G2、黨參堿、丁香脂素、鳥苷和腺苷等;利用Bioinformatics &Evolutionary獲取小柴胡顆粒退熱潛在作用靶點(diǎn)68個(gè),將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,采用Cytoscape軟件計(jì)算核心基因,排名前十的核心基因分別為VEGFA、TNF、CCL2、CXCL8、IL-6、PTGS2、IFNG、IL-10、ICAM1和IL-1β,提示這些基因可能為小柴胡顆粒發(fā)揮解表散熱作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),進(jìn)一步構(gòu)建干酵母致熱大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示小柴胡顆粒對(duì)干酵母致熱模型大鼠發(fā)熱的上升期、高峰期和下降期均有顯著的降溫作用,能維持體溫24 h不反彈,而且其作用呈現(xiàn)劑量依賴性,中、高劑量的小柴胡顆粒降溫能力能與阿司匹林相媲美。IL-6和TNF是目前已被證實(shí)的內(nèi)生致熱原,小柴胡顆粒的退熱機(jī)制可能關(guān)聯(lián)多個(gè)環(huán)節(jié),如降低機(jī)體炎癥水平、抑制內(nèi)生致熱原和抑制發(fā)熱介質(zhì)PGE2合成的主要限速酶環(huán)氧合酶2。

4.3 基于復(fù)方配伍環(huán)境的Q-marker預(yù)測分析 畢聰?shù)萚12]通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫和查閱文獻(xiàn),篩選到167個(gè)小柴胡顆粒中的活性成分和268個(gè)潛在作用靶點(diǎn),并和7味藥材一起導(dǎo)入Cytoscape,即得到藥材-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖?；谕藷釞C(jī)制和配伍規(guī)律,分析后得到7味藥材共同作用的5個(gè)核心靶點(diǎn),分別為NF-κB、AP-1、PTGS2、MMP9和CASP3,說明小柴胡顆粒可通過激活細(xì)胞因子、參與炎癥反應(yīng)、提高免疫力和直接參與退熱等作用多方面地發(fā)揮退熱功效。有研究[79]表明,半夏配伍生姜,生姜中姜辣素可抑制半夏凝集素蛋白刺激巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥因子釋放、ROS的過量生成、RIP3的表達(dá)增高和巨噬細(xì)胞壞死。半夏和生姜均有降逆止嘔的功效,且生姜可解半夏之毒。有研究[80]表明,黃芩與生姜配伍后,黃芩中的化學(xué)成分溶出率隨著配伍比例的變化而變化,當(dāng)黃芩-生姜(1∶1)配伍時(shí)對(duì)黃芩中化合物的溶出率影響最小,提示在后續(xù)對(duì)小柴胡顆粒的研究中可適當(dāng)關(guān)注藥材配伍變化而產(chǎn)生的影響。

4.4 基于成分可測性的Q-marker預(yù)測分析 劉傲雪等[81]采用一測多評(píng)法建立了同時(shí)測定小柴胡顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2和甘草酸7種化合物的含量。張雪等[4]自制小柴胡顆?；鶞?zhǔn)樣品,采用UPLC法建立同時(shí)測定小柴胡顆粒中柴胡皂苷B2、柴胡皂苷B1、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草苷、甘草皂苷G2和甘草酸8種成分含量的方法。王嘉林等[6]采用液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定小柴胡顆粒中SSa和SSd的含量,操作方法簡單迅速。綜合目前小柴胡顆粒中可檢測的化學(xué)成分含量區(qū)間,分別為0.50%～0.77%(柴胡皂苷B1)、0.86%～2.19%(柴胡皂苷B2)、0.000 2%～0.011 0%(柴胡皂苷a)、0.000 1%～0.003 8%(柴胡皂苷d)、0.13%～49.11%(黃芩苷)、0.011%～8.80%(漢黃芩苷)、1.01%～4.32%(黃芩素)、0.001 3%～0.490 0%(漢黃芩素)、2.60%～15.42%(甘草酸)、0.001 9%～3.720 0%(甘草苷)、0.11%～1.08%(甘草皂苷G2)。在已有的對(duì)小柴胡顆粒中化學(xué)成分的檢測中,發(fā)現(xiàn)未檢出半夏、生姜、黨參和大棗這4味藥的特有性成分。有研究[4]表明,在含酸性溶劑的洗脫系統(tǒng)中SSa和SSd表現(xiàn)不穩(wěn)定,對(duì)其檢測過程中會(huì)限制流動(dòng)相的選擇范圍;黃芩苷含量最高且穩(wěn)定,對(duì)照品價(jià)廉易得;柴胡皂苷B2與市售不同廠家小柴胡顆粒的價(jià)格呈顯著正向相關(guān)性,將柴胡皂苷B2納入評(píng)價(jià)小柴胡顆粒的評(píng)價(jià)性指標(biāo),可為小柴胡顆粒的定價(jià)和優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提升競爭力?？紤]包含主要藥味的化學(xué)信息,兼顧君(柴胡)臣(黃芩)佐使(甘草)的原則,能更具有代表性和更全面地評(píng)價(jià)小柴胡顆粒的質(zhì)量,可將柴胡皂苷B2、黃芩苷、黃芩素、甘草苷和甘草酸這5個(gè)化合物作為小柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)志物。見表1和圖1。

圖1 小柴胡顆粒Q-marker的結(jié)構(gòu)

表1 小柴胡顆粒的Q-marker信息

5 結(jié)語

中藥成分復(fù)雜,單一藥材中可發(fā)現(xiàn)的化合物多達(dá)幾十種,中藥材按組方原則配伍成復(fù)方制劑后成分更加繁多,因此,復(fù)方制劑在發(fā)揮治療作用的過程中可能是由多成分之間相互產(chǎn)生多種模式來共同完成,而不是單一化學(xué)成分起作用,也不是多個(gè)化學(xué)成分獨(dú)立作用的簡單相加或堆疊。在質(zhì)量評(píng)價(jià)中,更多的體現(xiàn)中醫(yī)藥特色,從不同方面反映出中藥的不同屬性和內(nèi)涵尤為重要。在中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)探索中,出現(xiàn)了越來越多的中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)模式,參考文獻(xiàn)得知[82-85],已有模式如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),中藥特征圖譜和指紋圖譜,一測多評(píng)法、聚類分析法、灰色關(guān)聯(lián)分析法、直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法和質(zhì)量標(biāo)志物等,這些模式從不同層面對(duì)中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)進(jìn)行了科學(xué)分析,既有創(chuàng)新獨(dú)特之面,又有不足之處,各種評(píng)價(jià)模式之間不能互相替代,可互補(bǔ)共同構(gòu)成中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)體系。

小柴胡顆粒組方是按“君、臣、佐、使”基本結(jié)構(gòu)的組方原則進(jìn)行配伍而成。該方中柴胡為君藥,起主要治療作用;黃芩為臣藥,輔助柴胡治療主病、兼病或兼證,柴胡升散,黃芩降泄,此配伍構(gòu)成了和解少陽的基本結(jié)構(gòu)。半夏、生姜、黨參和大棗四味藥為佐藥,佐助柴胡和黃芩以起加強(qiáng)治療的作用,半夏、生姜和胃降逆止嘔,黨參大棗益氣健脾;甘草為使藥,起調(diào)和諸藥的作用。此配伍方法,主和解少陽,兼補(bǔ)胃氣,祛邪調(diào)胃,諸癥自除。

基于目前可查的文獻(xiàn)和結(jié)合現(xiàn)有研究,通過考察小柴胡顆粒的化學(xué)成分、藥理作用、成分特有性和可測性、成分與藥效的關(guān)聯(lián)性以及復(fù)方配伍環(huán)境等,對(duì)小柴胡顆粒進(jìn)行綜合分析和最終確認(rèn),確定小柴胡顆粒的質(zhì)量標(biāo)志物有柴胡皂苷B2、黃芩苷、黃芩素、甘草苷和甘草酸。因本次探究是基于目前現(xiàn)有的研究和可查文獻(xiàn),結(jié)論仍值得繼續(xù)探索、確證和發(fā)展。且在整理分析時(shí)發(fā)現(xiàn),目前對(duì)小柴胡顆粒的研究仍有空白之處,如尚未有對(duì)佐藥(半夏、生姜、黨參、大棗)中特有性成分的檢測,對(duì)小柴胡顆粒體內(nèi)入血成分的分析及藥效研究,對(duì)小柴胡顆粒不同溶劑提取物(如水提物)中化學(xué)成分及藥理作用的分析研究等。相信隨著藥物分析現(xiàn)代技術(shù)的快速發(fā)展,從組方中的各味藥材中發(fā)現(xiàn)新的更具特異性的指標(biāo)性成分亦有可期,謹(jǐn)以此次探討,為小柴胡顆粒以后更深入的研究提供思路和方向。