孫天文, 劉思辰, 楊 柯

(周口市中心醫(yī)院檢驗科,河南 周口 466099)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)可在任何年齡的人群中引起感染,是兒童和青壯年社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的主要病原體之一[1]。其臨床癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、喉嚨痛及鼻炎,偶爾也有頭痛。MPP也會引起一些呼吸道疾病,如肺膿腫、閉塞性細支氣管炎、支氣管擴張、胸腔積液、肺栓塞、呼吸窘迫綜合征及一些肺外表現(xiàn)(如腦炎等),嚴重影響患者身體健康,因此需要盡早對MPP進行診斷和治療。然而,由于MPP感染的臨床征象及影像學不具有特異性,對MPP感染患兒的早期診斷仍存在困難[2]。

目前對于MPP的實驗室檢查方法較多,常用的有MPP培養(yǎng)、血清學抗體檢測、間接免疫熒光法、MPP核酸檢測技術及實時熒光核酸恒溫擴增試驗(simultaneous amplification testing,SAT)。由于MPP培養(yǎng)周期長且容易出現(xiàn)假陰性,該方法的早期診斷價值低。MPP血清學抗體檢測也存在一定缺陷,一方面血清檢測屬于有創(chuàng)操作,對于患兒特別是低齡兒童存在困難。另一方面血清學的抗體檢測需要宿主產生抗體,需要約1周時間,因此容易出現(xiàn)假陰性的結果,而雙份血清檢測耗時長,不適用于早期診斷。間接免疫熒光法也是近年來常用的一種方法,但其易受患兒年齡、病程、自身抗體等影響,也易因包被抗原不足出現(xiàn)假陰性[3]。MPP的核酸檢測技術依賴于DNA靶標,因此無法辨別“活菌”與“死菌”,容易出現(xiàn)假陽性結果[4]。SAT作為新一代“活菌”檢測技術,直接檢測“活菌”的RNA,有效區(qū)分“活菌”與“死菌”,具有高靈敏度、高特異性、反應穩(wěn)定等眾多優(yōu)點[5]。SAT技術目前已被用于多種病原體的檢測,包括解脲脲原體[6-7]、金黃色葡萄球菌[8]、肺結核分枝桿菌[9-10]等。目前對于MPP-SAT的報道不多,本研究旨在分析SAT技術與間接免疫熒光法在診斷兒童MPP中的價值,為更準確地選擇兒童MPP感染的檢測方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2020年4月—2021年10月在周口市中心醫(yī)院診治的382例CAP患兒的臨床資料進行回顧性研究,患兒的診斷均參照《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南》[11]。排除標準:①病歷資料不全。 ② 患有先天性免疫缺陷。③患有肺結核。④對阿奇霉素藥物過敏者。本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過,且患兒家屬均簽署知情同意書。MPP感染患兒診斷標準:MPP感染患兒的診斷標準參照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》[12],確診為CAP的基礎上滿足以下任意一項:① 入院24 h內初測血清MPP抗體陽性(單次血清抗體滴度≥1:160)。②病程處于恢復期時(10 d)復測血清MPP抗體呈4倍或4倍以上。其中男244例,女138例;年齡2個月～10歲1個月(4.92±4.06)歲。本研究以血清學抗體(IgM+IgG)診斷MPP感染的結果為參考,在382例兒童CAP患兒中,入院時初測血清MPP抗體陽性(單次血清抗體滴度≥1:160)的患兒85例,初測陰性的患兒在病程處于恢復期時(10 d)進行血清復測,復測血清MPP抗體呈4倍或4倍以上升高的患兒40例,兩次檢測共診斷MPP感染患兒125例,其中男69例,女56例;年齡≤1歲患兒5例,年齡>1歲患兒120例,年齡0～12(4.59±3.31)歲;病程2～21(5.94±6.76)d;患兒合并病毒感染12例,合并細菌感染19例;入院前曾有大環(huán)內酯類藥物治療史23例,無大環(huán)內酯類藥物治療史102例。

1.2 檢查方法

1.2.1 顆粒凝集法檢測MPP-Ab滴度 于入院24 h內采集患兒靜脈血,分離血清,采用珠海麗珠試劑公司的SERODIA-Myco Ⅱ試劑盒嚴格按照說明書步驟進行混合抗體滴度檢測。初測陰性的患兒于病程處于恢復期時(10 d)復測血清MPP抗體。

1.2.2 MPP-SAT檢測方法 采用上海仁度生物科技有限公司的MPP核酸檢測試劑盒進行檢測。在入院24 h內采集患兒的咽部分泌物,將拭子頭放于9 g·L-1鹽水中浸泡后貼壁擠干,加入等量裂解液獲得待測樣本。加入內標后,采用磁珠法提取待測核酸RNA進行擴增。體系為40 μL,42 ℃,1 min,共進行40個循環(huán)。設置HEX熒光通道為內標檢測通道,FAM熒光通道為樣本檢測通道。熒光信號每分鐘收集1次,共40次,繪制擴增曲線。dt ≤ 35 min 為陽性,>40 min為陰性;35～40 min 的樣本重新進行檢測。

1.2.3 間接免疫熒光法 于入院24 h內采集患兒靜脈血,分離血清,采用病原體IgM抗體檢測試劑盒嚴格按照說明書步驟檢測MPP-IgM抗體,結果判定嚴格按照說明書。

2 結果

2.1 MPP-SAT診斷價值分析 入院24 h內行MPP-SAT檢測,陽性結果共116例,其中屬于血清學抗體診斷陽性患兒110例,不屬于血清學抗體診斷陽性患兒6例。見表1。間接免疫熒光法陽性結果共88例,其中屬于血清學抗體診斷陽性患兒79例,不屬于血清學抗體診斷陽性患兒9例。見表2。由以上結果可知,MPP-SAT診斷兒童MPP的敏感度為88.00%(110/125)、特異度為97.67%(251/257)、陽性預測值為94.83%(110/116)、陰性預測值為94.36%(251/266)、MPP-SAT與血清學抗體檢測一致性Kappa值為0.873。間接免疫熒光法診斷兒童MPP的敏感度為63.20%(79/125)、特異度為96.50%(248/257)、陽性預測值為89.77%(79/88)、陰性預測值為84.35%(248/294),間接免疫熒光法與血清學抗體檢測一致性Kappa值為0.646。見表3。

表1 SAT與血清學抗體檢測MPP感染的效果比較

表2 間接免疫熒光法與血清學抗體檢測MPP感染的效果比較

表3 SAT與間接免疫熒光法對MPP感染的診斷效能分析

2.2 影響MPP-SAT檢測陽性率的相關特征分析 采用卡方檢驗分析了患兒性別、年齡、病程及大環(huán)內酯類藥物治療史對MPP-SAT檢測陽性率的影響,結果表明患兒病程及大環(huán)內酯類藥物治療史對MPP-SAT的檢測陽性率有顯著影響(P<0.05);病程<7 d院外無大環(huán)內酯類藥物治療史的患兒與病程≥7 d院外有大環(huán)內酯類藥物治療史的患兒比較,MPP-SAT檢測陽性率顯著增加。患兒性別及年齡對MPP-SAT的檢測陽性率無顯著影響(P>0.05)。見表4。

表4 影響MPP-SAT檢測陽性率的相關特征分析[n(%)]

2.3 MPP-SAT檢測陽性率影響因素的多因素logistic回歸分析 為排除混雜因素的影響,將上述對MPP-SAT檢測陽性率有顯著影響的特征(病程及大環(huán)內酯類藥物治療史)進行多因素logistic回歸分析,結果表明病程(≥7 d)及有大環(huán)內酯類藥物治療史均為MPP-SAT檢測陽性率的獨立影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 MPP感染患兒SAT檢測陽性率影響因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

MPP感染在臨床癥狀上難以與其他病原體感染區(qū)分,從影像學上也不具備特異性,因此MPP感染患兒的早期診斷仍存在困難[2]。而疾病的誤診或漏診容易導致病情進展,嚴重時可危及生命,因而急需尋找一種準確性和特異性高的MPP早期診斷方法[13]。目前單一的MPP檢測方法缺乏可靠性,多方法的聯(lián)合檢測時間長,經濟成本高。目前SAT作為新一代“活菌”檢測技術,以病原體特異性RNA 為擴增靶標,直接檢測“活菌”的RNA,而在“死菌”內幾乎檢測不到RNA,因此可有效區(qū)分“活菌”與“死菌”,具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)點[5,14],且其對于“活菌”的辨別使其能夠實時反映機體內支原體感染狀態(tài),不易出現(xiàn)假陽性的結果。SAT技術目前已被用于多種病原體的檢測,而對于MPP的檢測報道較少,本研究以血清學抗體檢測結果為參考,探討了SAT與間接免疫熒光法在診斷兒童MPP中的價值。

本研究結果發(fā)現(xiàn),SAT檢測MPP的敏感度高達88.00%,特異度為97.67%,與血清學抗體檢測一致性Kappa值為0.873;而間接免疫熒光法的敏感度為63.20%,特異度為96.50%,與血清學抗體檢測一致性Kappa值為0.646;SAT法的敏感度、特異度和Kappa值均高于間接免疫熒光法。通過卡方檢驗分析影響MPP-SAT檢測陽性率的因素發(fā)現(xiàn),病程及大環(huán)內酯類藥物治療史對MPP-SAT檢測陽性率有顯著影響,而年齡及性別對MPP-SAT檢測陽性率無顯著影響。同時,多因素logistic回歸分析表明病程及大環(huán)內酯類藥物治療史均為MPP-SAT檢測陽性率的獨立影響因素。這可能是由于患兒病程較長時自身免疫等因素導致病原體活性降低,同時病原體載量隨著病程增加也有所降低,病原體RNA被裂解因而不容易被SAT檢測?；純悍么蟓h(huán)內酯類藥物治療后,機體病原體被部分清除,同樣會導致病原體RNA被裂解而不容易被SAT檢測。

實驗室血清學抗體檢測是目前MPP感染常用的方法之一,但其有兩大缺點:一是早期診斷容易出現(xiàn)假陰性,這是由于MPP感染后機體大約在1周后才會產生抗體,而在入院24 h內單份血清檢測時有時由于血清抗體濃度不夠而呈現(xiàn)假陰性,需要在恢復期進行復測,難以達到早期診斷的目的[4]。二是年齡較小的嬰幼兒由于自身免疫功能發(fā)育并不完善,尚不能產生大量抗體,因此也容易出現(xiàn)假陰性的情況[15-16]。而本研究結果顯示,SAT檢測的陽性率與年齡無關,提示對于年齡小的患兒,更適合采用SAT法檢測MPP感染。此外,本研究結果也顯示,病程較短患兒的MPP-SAT檢測陽性率較病程較長患兒高,提示對于病程短的患兒,更適合采用SAT檢測MPP感染,也進一步說明了SAT用于MPP感染早期診斷的優(yōu)勢。同時,從SAT與間接免疫熒光法診斷MPP感染的敏感度和特異度來看,SAT在診斷MPP感染也優(yōu)于間接免疫熒光法。

綜上所述,SAT以病原體RNA作為直接的靶標,在MPP感染的早期診斷方面呈現(xiàn)出顯著優(yōu)勢,臨床上可采用SAT輔助進行MPP感染的早期診斷。同時,由于病程和大環(huán)內酯類藥物治療史對SAT檢測結果的影響,臨床使用時應在病程早期及無大環(huán)內酯類藥物治療史的患兒中進行檢測。