劉惠珍, 陳雅莉, 夏 凌, 肖小華, 李攻科

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

微芯片電泳(microchip electrophoresis, MCE)的分析效率比普通毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)高,且MCE系統(tǒng)試劑和樣品消耗量少、易于高度集成、有助于現(xiàn)場分析,在生物醫(yī)學(xué)和藥物分析[1]、環(huán)境監(jiān)測[2]、法醫(yī)調(diào)查[3]和臨床診斷[4]等方面應(yīng)用廣泛。

微芯片表面改性方法包括靜態(tài)涂層改性和動態(tài)涂層改性。動態(tài)涂層通過在緩沖液中添加聚合物或表面活性劑改變電滲流(electroosmotic flow, EOF)來實(shí)現(xiàn),操作方便且過程可逆,但涂層容易脫落。靜態(tài)涂層改性是電泳微芯片最有效的表面改性方法,涂層穩(wěn)定且可提高電泳重現(xiàn)性。常見靜態(tài)涂層改性方法包括紫外接枝法[5]、等離子處理法[6]和多層化學(xué)沉積法[7]。采用陰離子靜態(tài)涂層[8]對微通道進(jìn)行改性,能產(chǎn)生陽離子EOF,用于陽離子分析物分離。保健品中常見的陽離子氨基酸有γ-氨基丁酸和賴氨酸。γ-氨基丁酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),它影響大腦發(fā)育,在促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、預(yù)防失眠等方面發(fā)揮重要作用[9]?？诜嚢彼崮茉黾由L激素釋放,有助于人體鈣吸收和腎臟保護(hù),增加骨膠原交聯(lián)過程[10]。陰離子靜態(tài)涂層可提高M(jìn)CE對陽離子氨基酸的分離效果,但不適用陰離子氨基酸分析。采用動/靜態(tài)涂層結(jié)合的環(huán)烯烴共聚物(cycloolefin copolymer, COC)微通道表面改性方法,可提高M(jìn)CE對陰離子氨基酸的分離效果。?；撬岷吞於彼岬汝庪x子氨基酸常作為有消除疲勞、提高記憶力等功效的保健品中的功效成分。牛磺酸是重要神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化劑,能調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì),影響能量代謝[11],常被添加到嬰兒食品和運(yùn)動飲料中,是合法的食品添加劑[12]。天冬氨酸是有酸性側(cè)鏈的蛋白源性氨基酸,能刺激神經(jīng)元受體,是哺乳動物大腦中主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[13],它參與葡萄糖生成,可維持正常能量代謝,對瞬時腦力勞動負(fù)荷后能量修復(fù)有積極作用[14]。γ-氨基丁酸和賴氨酸常用檢測方式包括高效液相色譜法(HPLC)[15]、比色法[16]、熒光傳感器檢測[17]、電化學(xué)檢測[18]、CE[19]等。而?；撬岷吞於彼釞z測方法有色譜法[20]、CE[21]、電化學(xué)法[22]、核磁共振法[23]等。

本研究采用光學(xué)性能好、惰性且低成本的COC作為MCE芯片基底材料,在COC微芯片通道表面通過疏水氨基酸吸附、戊二醛(glutaraldehyde, GA)固定化和親水氨基酸功能化構(gòu)建靜態(tài)涂層,提高陽離子分析物的MCE分離效果,結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光(laser-induced fluorescence, LIF)檢測,用于兒童保健品中賴氨酸與γ-氨基丁酸MCE分離分析;采用動/靜態(tài)涂層結(jié)合微芯片通道表面改性方法,通過纈氨酸吸附、羧基活化和乙二胺(ethylenediamine, EDA)功能化在COC微通道構(gòu)建靜態(tài)涂層,向微通道引入含有羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methyl cellulose, HPMC)與十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate, SDS)的緩沖液形成動態(tài)涂層,提高陰離子分析物MCE分離性能,結(jié)合LIF檢測,用于運(yùn)動飲料中天冬氨酸與?；撬岬姆蛛x分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HVS448高壓電源(美國LabSmith公司); DS-Ri2 CCD攝像機(jī)和ECLIPSE Ti2-U倒置熒光顯微鏡(日本尼康株式會社); FA 1604電子天平(上海天平儀器廠); CNC數(shù)控雕刻機(jī)(深圳市捷豐泰科技有限公司);自制LIF檢測器(由455 nm激光二極管、505 nm DM505二色鏡、520 nm BP520長通濾波器和AD500-8-TO52S2雪崩光電二極管構(gòu)成); USB-6002多功能數(shù)據(jù)采集卡(National Instruments, USA); LC-2010C HT高效液相色譜儀(日本島津株式會社); TGL-20M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司); ESCALab250 X-射線光電子能譜儀(XPS,賽默飛,美國); DSA100接觸角測量儀(克呂士,德國); JSM-6330F冷場發(fā)射掃描電鏡(field emission scanning electron microscope, SEM,日本電子株式會社,日本)

丙氨酸(alanine, Ala, 99%(純度,下同))、纈氨酸(valine, Val, 99%)、亮氨酸(leucine, Leu, 99%)、異亮氨酸(isoleucine, Ile, 98%)、甲硫氨酸(methionine, Met, 99%)、脯氨酸(proline, Pro, 99%)、色氨酸(tryptophan, Try, 99%)、苯丙氨酸(phenylalanine, Phe, 99%)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp, 98%)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA, 98%)、賴氨酸(lysine, Lys, 98%)、精氨酸(arginine, Arg, 99%)和?；撬?taurine, Tau, 98%)購于百靈威科技有限公司(北京)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC, 98%)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide, NHS, 98%)、硼砂(99%)和SDS(≥98.5%)、磷酸二氫鈉(99.9%)、氫氧化鈉(97%)與乙腈(色譜級)購于阿拉丁試劑有限公司(上海)。4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑(4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, NBD-F, 99%)、HPMC(USP2910, 2%)購于上海麥克林生化有限公司(上海)。GA(50%)購于BBI生命科學(xué)有限公司(上海)。磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2～7.6 (1×))購于賽國生物科技有限公司(廣州)。碳酸氫鈉(99%)、EDA(99%)、三水合乙酸鈉和甲醇(色譜級)購于廣州化學(xué)試劑廠,實(shí)驗(yàn)用水均為由Millipore純化系統(tǒng)得到的超純水(18.25 MΩ·cm)。C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,北京DiKMA科技有限公司)。兒童保健品(壓片糖果)和運(yùn)動飲料購于零售店。

1.2 微芯片制作

COC微芯片通過數(shù)控銑床機(jī)械雕刻法建立微通道,使用打孔器打孔,通過熱壓技術(shù)封裝構(gòu)建,詳細(xì)制作過程參考文獻(xiàn)[24]。微芯片通道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計如圖1a,包括4個通道段,所有通道均寬100 μm,深70 μm;分離通道長2.7 cm,其他3個通道長0.8 cm。微通道雕刻完成后在4個通道端處打孔,乙醇超聲洗凈后于40 ℃烘干。然后將其置于135 ℃烘箱中熱壓10 min封裝構(gòu)建微芯片。將5 mL離心管蓋打孔后作為儲液池,使用由COC溶解到甲苯中制作成的膠水將儲液池連接到4個孔處,放置過夜。

圖1 (a)芯片電泳、(b)負(fù)電荷涂層及(c)正電荷涂層COC表面改性過程的示意圖

1.3 表面改性和表征

1.3.1負(fù)電荷涂層

COC微通道表面負(fù)電荷涂層通過疏水氨基酸吸附、GA固定化、親水氨基酸功能化構(gòu)建,如圖1b。首先,將2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))疏水氨基酸/PBS溶液充滿通道,室溫靜置30 min后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干;其次,將2.25%(v/v)GA水溶液充滿通道,室溫靜置60 min后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干;最后,將2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))親水氨基酸/PBS溶液充滿通道,室溫靜置30 min后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干制得微芯片,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

通過XPS表征改性COC芯片表面基團(tuán)。通過接觸角測量儀測量接觸角研究COC表面親水性。在具有負(fù)電荷涂層COC微通道內(nèi)充滿含有10 mmol/L NBD-F標(biāo)記氨基酸混合物的0.1 mmol/L硼砂緩沖液(pH 9.3)并靜置30 min,用去離子水沖洗5 min后檢測,用倒置熒光顯微鏡拍攝COC微通道照片,使用Image J處理圖片得到熒光強(qiáng)度圖,通過熒光強(qiáng)度研究COC表面吸附情況。通過SEM表征改性前后微通道表面平整度。

1.3.2正電荷涂層

COC微通道表面正電荷涂層通過Val吸附、EDC/NHS羧基活化、EDA功能化構(gòu)建,如圖1c。首先,將2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Val/PBS溶液充滿通道,室溫靜置30 min后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干;其次,將含有4.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDC/NHS的PBS溶液充滿通道,室溫靜置過夜后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干;最后,將5.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDA/PBS溶液充滿通道,室溫靜置5 h后用蒸餾水沖洗所有通道,38 ℃烘干制得微芯片,4 ℃儲存?zhèn)溆?。動態(tài)涂層通過將含有0.015%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS和0.005%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HPMC的0.1 mmol/L硼砂緩沖液引入COC通道自動形成。

通過XPS表征改性COC芯片表面基團(tuán),通過接觸角測量儀測量接觸角研究COC表面親水性。在COC微通道內(nèi)充滿含有10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp與Tau的0.1 mmol/L硼砂緩沖液(pH 5.5),靜置30 min,用去離子水沖洗5 min后檢測,研究吸附性能。

1.4 MCE實(shí)驗(yàn)方法

依次用水和緩沖液沖洗微芯片通道5 min。將樣品溶液置于儲液池1,將緩沖液先填充到其余儲液池中,采用門控進(jìn)樣模式將樣品進(jìn)樣到分離通道中。然后在儲液池1和2處施加高電壓形成穩(wěn)定樣品流;隨后,將儲液池2處高電壓切換到接地,實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣,進(jìn)樣時間為1 s;進(jìn)樣完成后馬上在儲液池1和2處施加電壓(φ),為分離通道提供合適電場,實(shí)現(xiàn)電泳分離?；蛟趦σ撼?和4處施加高電壓形成穩(wěn)定樣品流;隨后把儲液池3處高電壓切換到接地,實(shí)現(xiàn)樣品進(jìn)樣,進(jìn)樣時間1 s;進(jìn)樣完成后馬上在儲液池3和4處施加高電壓,實(shí)現(xiàn)電泳分離。

通過LIF檢測器[24]檢測樣品,通過MATLAB和Origin數(shù)據(jù)分析工具分析得到的電泳圖。

1.5 樣品制備

兒童保健品:精確稱量0.02 g研磨后的兒童保健品,溶解在4.0 mL純水中,渦旋混合1 min,超聲波輔助萃取10 min,萃取液以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,上清液用0.45 μm膜過濾后,濾液待測。

運(yùn)動飲料:取1 mL樣品用0.45 μm膜過濾后,濾液待測。

標(biāo)準(zhǔn)品衍生化:將100 μL 25 mmol/L NBD-F甲醇溶液分別加入200 μL不同質(zhì)量濃度的Lys (0.05～122 mg/L)、GABA(0.34～86 mg/L)、Tau(0.40～104 mg/L)及Asp(0.40～111 mg/L)溶液中,80 ℃水浴反應(yīng)15 min,冷卻至室溫后,儲存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

樣品衍生化:將10 μL 25 mmol/L NBD-F甲醇溶液加到10 μL待測液中,衍生化方法同上。

1.6 液相色譜方法

保健品中Lys和GABA采用HPLC標(biāo)準(zhǔn)方法[25,26]做對比實(shí)驗(yàn)。流動相為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液-乙腈(75∶25, v/v)。采用C18色譜柱作為分析柱,進(jìn)樣體積10.0 μL,柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL/min,紫外檢測波長為360 nm。

Tau和Asp采用HPLC法[27]做對比實(shí)驗(yàn)。流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5)-乙腈(85∶15,v/v)。采用C18色譜柱作為分析柱,進(jìn)樣體積10.0 μL,柱溫為40 ℃。流速為1.0 mL/min,紫外檢測波長為360 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)表面改性微芯片

2.1.1改性微芯片的性能表征

通過疏水氨基酸(以Val為例)吸附、GA固定化、親水氨基酸(以Asp為例)功能化在COC通道表面構(gòu)建Val-GA-Asp 3層靜態(tài)涂層。通過XPS表征確定其是否成功涂覆在COC表面,并考察了靜態(tài)涂層改性微芯片表面親水性和抗吸附性能。

2.1.1.1涂層表征

為確定Val-GA-Asp靜態(tài)涂層改性COC微芯片表面的元素組成,進(jìn)行了XPS表征。如圖2a, C 1s、N 1s和O 1s的特征峰分別出現(xiàn)在284.8、400.6和532.2 eV處。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu),C 1s峰被擬合為3個成分。如圖2b, 284.8、285.8和288.0 eV處主要成分分別來自碳碳單鍵(C-C)、碳氮單鍵(C-N)以及羧基(O-C=O)中的碳[28], N 1s峰被擬合為1個成分。如圖2c, 401.8 eV處主要成分來自C-N=C中的氮[29]。如圖2d, O 1s峰被擬合為2個成分。其中531.8 eV和532.8 eV處主要成分分別來自羧基中碳氧單鍵(C-O)和碳氧雙鍵(C=O)中的氧[28]。除了COC微芯片上有的C-C鍵外,其余化學(xué)鍵均來自Val-GA-Asp涂層,XPS表征結(jié)果證明負(fù)電荷涂層成功涂覆在COC芯片上。

圖2 (a)靜態(tài)涂層改性COC表面XPS光譜圖, (b)C 1s、(c)N 1s、(d) O 1s峰擬合圖,(e)負(fù)電荷涂層COC板上接觸角, (f)COC微通道中空氣-水界面輪廓圖以及靜態(tài)涂層(g)涂覆前和(h)涂覆后COC通道表面對氨基酸的吸附

2.1.1.2親水性和抗吸附性能表征

采用接觸角測量儀測量負(fù)電荷涂層涂覆前后COC板的水接觸角,研究了COC表面親水性。如圖2e,負(fù)電荷涂層改性后,COC表面親水性提高,水在COC表面上接觸角從97.44°變?yōu)?2.31°。如圖2f,除了COC板上接觸角減小,負(fù)電荷涂層改性后COC微通道中空氣-水界面輪廓從直線變?yōu)榍€,也證明了其親水性增強(qiáng)。

為研究負(fù)電荷涂層改性后COC通道表面抗氨基酸吸附能力,以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為背景電解質(zhì)(back-ground electrolyte, BGE),將10 mmol/L NBD-F標(biāo)記氨基酸混合物充滿負(fù)電荷涂層改性COC微通道,去離子水沖洗后檢測,熒光強(qiáng)度與通道內(nèi)吸附量成正比,如圖2g,未改性COC通道對于氨基酸有較強(qiáng)吸附,通道照片呈現(xiàn)強(qiáng)熒光。如圖2h,負(fù)電荷涂層可有效避免通道對氨基酸非特異性吸附,改性COC通道內(nèi)外熒光強(qiáng)度相同。

2.1.2芯片改性用氨基酸的選擇

由于氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)不同,負(fù)電荷涂層中第1層涂覆的疏水氨基酸涂層與第3層涂覆的親水氨基酸涂層可能影響分析物柱效,選用帶有最多正電荷的Arg作為模型分析物,研究了不同氨基酸涂層對其柱效的影響。

疏水氨基酸種類可能影響涂覆均勻性,從而影響抗吸附效果和電泳性能。將Trp、Leu、Phe、Met、Ile、Val、Ala和Pro 8種疏水氨基酸分別吸附在COC表面作為靜態(tài)涂層第1層,通過GA固定化和Lys功能化構(gòu)建負(fù)電荷涂層。以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Arg進(jìn)樣,以800 V為分離電壓,得到不同涂層下的Arg電泳與理論塔板高度(H)圖。結(jié)果表明,以Val為第1層涂層時,Arg的峰形最好,峰寬最窄(如圖3a), Arg的H值有最小值(如圖3b),即其涂層均勻性和電泳性能最好,因此選擇Val為第1層疏水氨基酸涂層用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為得到好的分離效果,考察了第3層親水氨基酸種類對Arg峰形與柱效的影響。通過Val吸附、GA固定化后,采用不同的親水氨基酸作為第3層構(gòu)建負(fù)電荷涂層。以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Arg進(jìn)樣,以800 V為分離電壓,得到不同涂層下Arg電泳與H圖。結(jié)果表明,在側(cè)鏈基團(tuán)含羧基的Asp作為改性第3層涂層時,Arg獲得最好的峰形,峰寬最窄(如圖3c),H最低(如圖3d),柱效好。因此選擇Asp為第3層親水氨基酸涂層用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3電泳分離條件考察

樣品移動速度(u) 考察了不同分離電壓對Val-GA-Asp涂層改性通道的COC微芯片中Lys和GABA移動速度的影響。將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Lys和0.50 mmol/L NBD-F標(biāo)記GABA分別進(jìn)樣,在進(jìn)樣口下游1.5 cm處檢測。如圖4a, Lys和GABA的u均隨分離電壓線性增加。在同一分離電壓下,Lys的u比GABA大,且Δu隨著電壓增大而增大,表明負(fù)電荷涂層改性微芯片同步MCE分離分析Lys與GABA有可能性。

圖4 分離電壓φ對(a)u以及(b)H的影響,(c)不同 分離距離和(d)不同分離電壓下Lys和GABA的分離度(n=3)

柱效 用Lys和GABA的H與φ的關(guān)系表征MCE的分離性能。圖4b為φ對COC通道中Lys和GABA遷移的影響。隨著φ增大,Lys和GABA的H值先降低后增加,在800 V處取得了最小值。這符合電泳規(guī)律,能通過調(diào)節(jié)φ達(dá)到最佳柱效。

分離度(Rs) 將Lys和GABA的混合物進(jìn)樣,在分離通道中檢測并計算電泳圖中的峰分離度,研究改性芯片的MCE分離性能及分離距離(L)對分離性能的影響。以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Lys和0.50 mmol/L NBD-F標(biāo)記GABA混合物進(jìn)樣,分離電壓為800 V,在分離通道不同分離距離處檢測,獲得一系列電泳圖。如圖4c, Lys和GABA的Rs與L成正比,在L=2.0 cm時獲得L最大值2.82。分離電壓對分離性能的影響如圖4d, Lys和GABA在φ=800 V時獲得最大Rs值2.28。因此,選擇L=2.0 cm與φ=800 V用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在此條件下,每次分離只需40 s即可完成。

2.1.4MCE分析Lys和GABA的方法學(xué)考察

在800 V分離電壓下,以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將NBD-F標(biāo)記Lys和GABA進(jìn)樣,并在分離通道距離進(jìn)樣口2.0 cm處檢測,建立了Lys和GABA的分析方法。結(jié)果表明,在0.10～122 mg/L(對應(yīng)樣品中含量為0.10～122 mg/kg)范圍內(nèi),NBD-F標(biāo)記Lys的峰面積(A)線性增加,A與分析物含量(c, mg/kg,下同)之間的線性方程為A=5.79×10-3c+2.79×10-4,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 0; GABA線性方程在1.03～68.7 mg/L(對應(yīng)樣品中含量為1.03～68.7 mg/kg)范圍內(nèi)為A=1.54×10-3c+6.23×10-4,r為0.997 6。Lys和GABA的檢出限(LOD)分別為0.03和0.12 mg/kg (S/N=3);測得含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于7.3%(n=5)。

將靜態(tài)涂層改性COC微芯片的MCE-LIF方法用于兒童保健品中Lys和GABA的分析。加標(biāo)前后兒童保健品的電泳圖如圖5, Lys和GABA的測得含量和回收率列于表1中。在兒童保健品中,檢測到3.08 mg/kg Lys和2.53 mg/kg GABA, Lys和GABA的回收率分別為104%～118%和84.8%～114%, RSD≤7.2%(n=3)。

表1 兒童保健品中Lys和GABA的分析(n=3)

圖5 兒童保健品及3.00 mg/kg加標(biāo)樣品的電泳圖

作為參考,兒童保健品也通過HPLC標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行了分析,在0.12～12.2 mg/kg范圍內(nèi),Lys的線性方程為A=7.77×103c-83.1,r為0.999 3; GABA的線性方程在0.09～8.59 mg/kg范圍內(nèi)為A=3.13×104c-1.17×104,r為0.998 7 (n=3)。

由表1可以看出,MCE方法測定結(jié)果與HPLC方法測定結(jié)果的相對誤差分別為0.98%和9.1%。說明該方法對保健品中Lys和GABA的分離分析準(zhǔn)確可靠。

2.2 動/靜態(tài)結(jié)合表面改性微芯片

2.2.1改性微芯片的性能表征

根據(jù)1.3.2節(jié)表面改性方法,通過Val吸附、EDC/NHS羧基活化、EDA功能化在COC通道表面構(gòu)建Val-EDA靜態(tài)涂層。通過XPS表征確定靜態(tài)涂層是否成功涂覆在COC微芯片表面,并考察了改性微芯片的親水性和抗吸附性能。

涂層表征 為確定Val-EDA靜態(tài)涂層改性COC微芯片表面的元素組成與表面化學(xué)特性,進(jìn)行XPS表征,如圖6a, C 1s、N 1s和O 1s特征峰分別出現(xiàn)在289.9、406.4和537.3 eV處。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu),C 1s峰被擬合為2個成分,如圖6b, 284.8和285.8 eV處主要成分分別來自碳碳單鍵(C-C)和碳氮單鍵(C-N)中的碳[28]。N 1s峰被擬合為2個成分,如圖6c, 399.6 eV和400.5 eV處主要成分分別來自氨基(NH2)和碳氮單鍵(C-NH-C)中的氮[28]。如圖6d, O 1s峰被擬合為1個成分,在532.2 eV處主要成分來自碳氧雙鍵(C=O)中的氧[28,30]。除了COC微芯片上有的C-C鍵外,其余化學(xué)鍵均來自Val-EDA涂層,證明正電荷涂層成功涂覆在COC芯片上。

圖6 靜態(tài)涂層改性COC表面(a)XPS光譜圖和(b)C 1s、(c)N 1s、(d)O 1s峰擬合圖,(e)正電荷涂層COC板上接觸角和(f)COC微通道中空氣-水界面輪廓,靜電涂層(g)涂覆前和(h)涂覆后COC通道表面對Asp和Tau的吸附

親水性和抗吸附性能表征 如圖6e,正電荷涂層改性后,COC表面親水性提高,水在COC表面上接觸角從98.10°降到54.74°。如圖6f,除了COC板上接觸角減小,正電荷涂層改性后COC微通道中空氣-水界面輪廓從直線變?yōu)榍€,也證明了其親水性增強(qiáng)。為研究正電荷涂層改性COC微芯片通道表面抗吸附能力,以0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp和Tau混合物充滿正電荷涂層改性COC微通道,熒光強(qiáng)度與通道內(nèi)目標(biāo)物吸附量成正比,如圖6g,未改性COC通道由于對Asp和Tau有較強(qiáng)吸附,通道照片呈現(xiàn)強(qiáng)熒光。如圖6h,正電荷涂層可有效避免通道對Asp和Tau非特異性吸附,改性COC通道內(nèi)外熒光強(qiáng)度相同。

2.2.2電泳分離條件考察

動態(tài)涂層改性劑濃度影響 為提高Asp和Tau的分離度,使用不帶電荷的HPMC與帶負(fù)電荷的SDS混合體系作為動態(tài)涂層,考察了HPMC與SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Asp和Tau的峰展寬(σ)的平方(σ2)與u的影響。以含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)HPMC與SDS的0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp和0.05 mmol/L NBD-F標(biāo)記Tau混合物進(jìn)樣并檢測。HPMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%～0.015%, SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%～0.020%,硼砂濃度固定為0.1 mmol/L。如圖7a, Asp的u隨著HPMC與SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而降低,如圖7b, Tau的u隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加先降低后增加,在0.015% SDS處取得最小值。當(dāng)SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.015%時,Tau的u隨HPMC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加無明顯變化。如圖7c與7d, 當(dāng)HPMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.005%時,Asp與Tau的σ2隨SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加先減小后增大,在0.015% SDS處取得最小值。當(dāng)SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.015%時,Asp的σ2隨著HPMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加,而Tau的σ2隨HPMC含量增加先增加后降低,在0.005% HPMC處取得最小值。在0.005% HPMC和0.015% SDS混合體系處有最小的σ2。為得到最優(yōu)分離度,將0.005% HPMC以及0.015% SDS混合體系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

樣品移動速度 以含有0.005% HPMC與0.015% SDS混合體系的0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp和0.05 mmol/L NBD-F標(biāo)記Tau分別進(jìn)樣到僅動態(tài)涂層、僅靜態(tài)涂層以及動/靜態(tài)涂層結(jié)合的分離通道中,采用LIF檢測。如圖8a,在涂覆有各種表面涂層的分離通道中,Asp與Tau的u均隨分離電壓線性增加。在同一分離電壓下,僅正電荷靜態(tài)涂層通道中Asp的u最大,僅動態(tài)涂層COC通道中Asp的u最小,具有動/靜態(tài)涂層結(jié)合的通道中Asp的u居中。如圖8b, Tau的u受各種通道表面涂層模式的影響與Asp趨勢類似。在相同條件下,Asp的u比Tau的大,表明改性微芯片對Asp和Tau進(jìn)行MCE分離分析有可能性。

圖8 φ對(a)Asp和(b)Tau u的影響及φ對(c)Asp和(d)Tau H的影響(n=3)

柱效 靜態(tài)涂層與動態(tài)涂層對柱效的影響會顯著影響MCE分離性能。用Asp和Tau的H與φ的關(guān)系表征MCE性能。φ對具有不同表面涂層COC通道中Asp的影響如圖8c,在所有分離電壓下,隨φ增大,Asp的H值先降低后增加,僅動態(tài)涂層中Asp的H值最大,而動/靜態(tài)涂層中H值最小。如圖8d, Tau的H受各種通道表面涂層模式的影響與Asp類似。動態(tài)涂層與靜態(tài)涂層均對MCE柱效提高有影響,動/靜態(tài)涂層結(jié)合改性通道的COC微芯片有最佳柱效。

分離度 將BGE中0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp和0.05 mmol/L NBD-F標(biāo)記Tau混合物引入具有不同涂層模式的COC微通道中,以800 V為分離電壓,考察不同涂層模式對Asp和Tau分離度的影響。如圖9a,僅動態(tài)涂層的芯片中Asp和Tau的流速較慢但峰展寬較大,有一定的分離效果。在僅靜態(tài)涂層的芯片中Asp和Tau的流速較快,有一定的分離現(xiàn)象。在相同條件下,動/靜態(tài)涂層結(jié)合芯片加快了Asp和Tau的移動速度,減小了峰展寬,實(shí)現(xiàn)了Asp和Tau的完全分離,有最好的分離性能。將動/靜態(tài)涂層結(jié)合改性微芯片用于后續(xù)分析,將Asp和Tau混合物進(jìn)樣,研究分離距離與電場強(qiáng)度對Asp和Tau分離度的影響。以含有0.005%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HPMC以及0.015%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS的0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將0.10 mmol/L NBD-F標(biāo)記Asp和0.05 mmol/L NBD-F標(biāo)記Tau混合物進(jìn)樣,分離電壓設(shè)置為800 V,在不同分離距離處檢測。隨著分離距離增加,Asp和Tau的Rs先增加后降低,在1.5 cm處取得Rs最大值(如圖9b)。研究了電場強(qiáng)度對Rs的影響。如圖9c, Asp和Tau在800 V分離電壓下獲得了最大Rs值2.59。將1.5 cm分離距離與800 V分離電壓用于后續(xù)分析,在此優(yōu)化條件下,每次分離只需60 s即可完成。

圖9 (a)涂層類型對Asp和Tau分離的影響和(b)不同分離距離、(c)不同分離電壓下測得的Asp和Tau的分離度

2.2.3MCE分析Asp和Tau的方法學(xué)考察

在800 V分離電壓下,以含有0.005%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))HPMC和0.015%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS的0.1 mmol/L硼砂緩沖液作為BGE,將NBD-F標(biāo)記Asp和Tau進(jìn)樣,建立Asp和Tau分析方法。結(jié)果表明,在1.33～111 mg/L(對應(yīng)樣品中含量為1.33～111 mg/kg)范圍內(nèi),NBD-F標(biāo)記Asp的峰面積線性增加,線性方程為A=7.25×10-5c+5.38×10-4,r為0.996 8; Tau的線性方程在0.42～20.9 mg/kg范圍內(nèi)為A=7.39×10-4c+5.48×10-4,r為0.998 6;在20.9～104 mg/L(對應(yīng)樣品中含量20.9～104 mg/kg)范圍為A=6.28×10-4c+3.09×10-3,r為0.998 9。Asp和Tau的LOD分別為0.35和0.09 mg/kg, 測得含量的RSD均小于5.6% (n=5)。

將具有動/靜態(tài)涂層結(jié)合改性通道的MCE-LIF方法用于運(yùn)動飲料中Asp和Tau的分析。加標(biāo)前后運(yùn)動飲料電泳圖如圖10。Asp和Tau測得含量和回收率列于表2中。在運(yùn)動飲料中,檢測到(9.89±0.55) mg/kg Asp和(15.9±0.8) mg/kg Tau, Asp和Tau的回收率分別為97.5%～105%和101%～118%, RSD≤6.4%(n=3)。作為參考,通過HPLC方法分析運(yùn)動飲料,在0.13～13.3 mg/kg范圍內(nèi),Asp的線性方程為A=1.41×104c-2.03×102,r為0.999 6; Tau的線性方程在0.12～12.2 mg/kg范圍內(nèi)為A=8.12×103c+3.06×102,r為0.999 9。表2中,MCE方法與HPLC方法測定結(jié)果的相對誤差分別為1.4%和9.4%。表明該方法在保健品天冬氨酸和?；撬岱蛛x分析中準(zhǔn)確可靠。

表2 運(yùn)動飲料中Asp和Tau的分析(n=3)

圖10 運(yùn)動飲料及8.00 mg/kg加標(biāo)樣品的電泳圖

3 結(jié)論

本文建立了表面改性微芯片電泳分離檢測保健品中功效成分的方法,采用負(fù)電荷涂層的COC通道實(shí)現(xiàn)了Lys和GABA的分離,Rs為2.82,正電荷涂層的COC通道實(shí)現(xiàn)了Asp與Tau的分離,Rs為2.59。將該方法用于保健品中氨基酸的測定,回收率為84.8%～118%, RSD≤7.2%。分析結(jié)果與HPLC方法測定結(jié)果一致,該方法具有良好的應(yīng)用前景,適用于兒童保健品中Lys和GABA以及運(yùn)動飲料中Asp和Tau的檢測。