郭思倩, 楊肇興, 姚 洋, 吐魯洪·托乎提, 李夢陽, 李夢卿, 杜雙奎,2

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1,楊凌 712100) (糧油功能化加工陜西省高校工程研究中心2,楊凌 712100)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld),又稱南美藜、印第安麥、奎藜等,最早發(fā)現(xiàn)于南美洲的安第斯山脈,是當(dāng)?shù)鼐用竦闹魇?。近幾?藜麥因其農(nóng)業(yè)潛力和營養(yǎng)特性吸引全球?qū)W者的關(guān)注。藜麥蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)12%～23%,且富含人體生長所需的9種必需氨基酸[1, 2],其精氨酸、蛋氨酸、賴氨酸含量高于小麥[3]、燕麥[4]、蕎麥[5]等谷物。藜麥蛋白屬于完全蛋白質(zhì),其氨基酸比例與聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)提出的理想比例接近,被公認(rèn)為是唯一一種可提供人體所需全部營養(yǎng)物質(zhì)的糧食單作物[6]。藜麥蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成,還含有較多的谷蛋白[7];其中清蛋白具有較好的溶解度、起泡性、乳化特性和抗氧化活性;球蛋白因其二硫鍵和特有的球狀結(jié)構(gòu),具有良好的凝膠能力,但溶解性較差[8]。

藜麥在食用前通常需要進(jìn)行加工,用擠壓、膨化、壓片等方式將其制成理想的商品[9]。近期有越來越多學(xué)者提出應(yīng)通過減少劇烈的熱加工和機(jī)械過程來保持谷物優(yōu)良的營養(yǎng)特性[10]。萌發(fā)因低成本、低耗能、成品風(fēng)味多樣化而被視為理想的谷物加工方法已并被廣泛應(yīng)用[11]。此外,有學(xué)者將萌發(fā)應(yīng)用于豆干制品加工,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過萌發(fā)處理,大豆中的蛋白質(zhì)、維生素C、大豆異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)含量顯著增加,豆干的感官品質(zhì)得到明顯改善[12]。高道葉[13]采用萌發(fā)的方式、利用冷水蒸汽提高發(fā)芽罐中的濕度,解決了傳統(tǒng)浸泡工藝制取發(fā)芽糙米過程爆腰率過高的問題,有效提升其食用品質(zhì)。將蕎麥[14]、青稞[15]萌發(fā)處理可制得富含γ-氨基丁酸的谷物粉,提升其營養(yǎng)價值。可見萌發(fā)在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價值。

籽粒萌發(fā)時,儲藏蛋白會在蛋白酶的催化作用下分解成氨基酸或小分子質(zhì)量多肽,使其具有更好的生物效用[16]。與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)及酶法改性相比,萌發(fā)具有安全性、環(huán)保、費(fèi)用低廉、易處理等優(yōu)點(diǎn),是一種理想的水解和合成新的蛋白質(zhì)(釋放小分子肽一起合成新的蛋白質(zhì))的方式[11,17,18]。目前國內(nèi)外關(guān)于萌發(fā)對藜麥蛋白質(zhì)的影響多數(shù)停留在藜麥總蛋白含量、蛋白質(zhì)組分含量以及氨基酸含量動態(tài)變化的研究上,涉及萌發(fā)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響研究較少,萌發(fā)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響有待進(jìn)一步探討。為此,研究以甘肅白藜麥為原料,對其進(jìn)行0～72 h的萌發(fā)處理,探討萌發(fā)過程中藜麥蛋白質(zhì)功能特性及結(jié)構(gòu)特性的變化,以期通過萌發(fā)提高藜麥蛋白質(zhì)的利用率,改善其營養(yǎng)價值和加工特性,為其在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

白藜麥原糧產(chǎn)自甘肅;大豆油為一級大豆油(900 mL);SDS-PAGE預(yù)制膠、蛋白質(zhì)Marker、考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液;氫氧化鈉、鹽酸、SDS、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉等均為分析純;溴化鉀為光譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

食品級PP加密格育苗盤,XHF-X型高速分散器,LGJ-10C型冷凍干燥機(jī),SC-2546型低速離心機(jī),KDC-40低速離心機(jī),L-530低速離心機(jī),PB-10酸度計(jì),BSA223S型電子天平,FA2004C型電子天平,FW100型高速粉碎機(jī),UV-1200型紫外可見分光光度計(jì),Ls55型熒光分光光度計(jì),Q2000型差示掃描量熱儀,Vetex-70型傅里葉變換紅外光譜儀,Power pac HC型電泳儀,GE1DOC XR+型凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

將新鮮藜麥挑揀、除雜后,清洗浸泡3 h,置于方形育苗盤中,于室內(nèi)通風(fēng)處萌發(fā),實(shí)驗(yàn)于3月開展,室內(nèi)平均溫度為20 ℃,每12 h用蒸餾水淋洗1次,在萌發(fā)0、24、48、72 h取樣,同時采用5點(diǎn)法取樣測定藜麥幼芽的長度,結(jié)果如表1。樣品于50 ℃干燥,粉碎、過60目篩得到萌發(fā)藜麥粉。

表1 萌發(fā)時間對藜麥芽長的影響

1.3.2 藜麥蛋白提取

采用堿溶酸沉法提取蛋白[19]。將萌發(fā)藜麥粉用石油醚進(jìn)行脫脂,將脫脂粉按料液質(zhì)量比1∶15添加蒸餾水,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0,3 800 r/min離心30 min收集上清液,重復(fù)提取2次;用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5,沉淀30 min,3 800 r/min離心30 min,收集沉淀。蛋白質(zhì)沉淀加少量蒸餾水復(fù)溶,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5,冷凍干燥,-20 ℃冷藏備用。

1.3.3 藜麥蛋白含量測定

參照GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法進(jìn)行測定。

1.3.4 結(jié)構(gòu)特性測定

1.3.4.1 熱學(xué)特性測定

稱取2 mg藜麥蛋白,加入6 μL蒸餾水,密封壓蓋。于-20 ℃靜置平衡過夜,用差示掃描量熱儀掃描:氮?dú)饬魉贋?0 mL/min,掃描溫度30～150 ℃,升溫速率為10 ℃/min,空白對照為空鋁盒。

1.3.4.2 內(nèi)源性熒光光譜測定

用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸緩沖液配制0.2 mg/mL樣品溶液。熒光分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置:激發(fā)波長λex=295 nm,掃描范圍300～400 nm,狹縫5 nm。

1.3.4.3 表面疏水性測定

采用ANS熒光探針法[19]。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制不同的質(zhì)量濃度梯度(0.0625～1.0 mg/mL)的樣品溶液。取各質(zhì)量濃度樣品溶液5 mL,加入25 μL 8 mmol/L的ANS溶液(磷酸緩沖液配制),振蕩混勻,避光靜置15 min。用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度:激發(fā)波長λex=390 nm,發(fā)射波長λem=470 nm,狹縫5 nm,掃描速度1 000 nm/min。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖,通過線性回歸分析計(jì)算初始段斜率,即為樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.3.4.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

取60 μL 1 mg/mL樣品溶液,加入20 μL上樣緩沖液,混勻,90 ℃金屬浴加熱10 min,冷卻。上樣量為30 μL,電壓110 V,時間70 min。用考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液染色后,洗凈背景,用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。

1.3.5 功能特性測定

1.3.5.1 溶解度測定

參照張文剛等[20]的方法,并稍作修改。配制1 mg/mL樣品溶液,測定蛋白質(zhì)含量C0,渦旋1 min,3 800 r/min離心15 min,測定上清液蛋白質(zhì)含量C。蛋白質(zhì)含量用紫外吸收法測定[19],分別測定蛋白質(zhì)溶液在280 nm和260 nm下的吸光值A(chǔ)280 nm和A260 nm,按公式計(jì)算:

C=1.45A280 nm-0.74A260 nm

式中:C為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/mg/mL;A280 nm為蛋白質(zhì)溶液在280 nm下的吸光值;A260 nm為蛋白質(zhì)溶液在260 nm下的吸光值;C0為樣品溶液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.3.5.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參考付嘉陽等[21]的方法。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液配制1 g/mL樣品溶液。取6 mL樣品溶液,加入2 mL大豆油,混合,在室溫下用高速分散機(jī)10 000 r/min高速剪切1 min,靜置,分別在0、10 min時迅速從容器底部取出50 μL樣品溶液,加入5 mL 0.1 g/mL SDS,混勻后于500 nm測吸光度A0、A10。空白對照為0.1 g/mL質(zhì)量濃度SDS。乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)按公式計(jì)算:

式中:EAI為乳化性/m2/g;ESI為乳化穩(wěn)定性/min;T為換算常數(shù)2.302;N為稀釋倍數(shù);C為蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/g/mL;ψ為大豆油的體積分?jǐn)?shù),0.25;Δt為靜置時間差,10 min。

1.3.5.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

參考付嘉陽等[21]的方法,并稍作修改。稱取0.15 g樣品于離心管中,加入15 mL蒸餾水,于10 000 r/min高速攪打2 min,采用刻度尺記錄攪打前、后分散液體積,靜置30 min再次記錄體積。起泡性(FC)及泡沫穩(wěn)定性(FS)按照公式計(jì)算:

式中:FC為起泡性/%;FS為泡沫穩(wěn)定性/%;V1、V2、V3分別為攪打前、后及靜置30min后的分散液體積/mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)時間對藜麥粉蛋白質(zhì)含量的影響

萌發(fā)時間對藜麥粉蛋白質(zhì)含量的影響見圖1。隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥粉的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增大趨勢,萌發(fā)處理后的藜麥粉的蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05),這與韓雅盟等[22]研究結(jié)果一致。分析原因,在萌發(fā)過程中,藜麥種子生長發(fā)育需要消耗供能物質(zhì)淀粉,新陳代謝提高,導(dǎo)致其總干基質(zhì)量降低,從而使得蛋白質(zhì)含量相對增加[22];新生長的芽中也會合成新的蛋白質(zhì)[23],同時蛋白質(zhì)作為儲能物質(zhì)也會被消耗,隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥蛋白質(zhì)含量在生成和分解的過程中不斷變化,且總體呈上升趨勢。所以,萌發(fā)處理可以提高藜麥的蛋白含量,并且在72 h內(nèi),萌發(fā)時間越長,蛋白質(zhì)含量越高。

注:圖中字母表示顯著性水平(P<0.05)。下同。

2.2 萌發(fā)時間對藜麥蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 熱學(xué)特性

表2為萌發(fā)藜麥蛋白質(zhì)的熱變性起始溫度T0、峰值溫度Tp、終止溫度Te和焓值ΔH。萌發(fā)后藜麥蛋白存在2個熱變性區(qū)間,峰值溫度分別為99～108、119～138 ℃,溫度范圍跨度較大,可能是由藜麥球蛋白和清蛋白的復(fù)雜組成引起的[24]。與未經(jīng)萌發(fā)處理(萌發(fā)0 h)的藜麥蛋白相比,萌發(fā)藜麥蛋白熱變性峰值溫度Tp顯著增大(P<0.05)。經(jīng)萌發(fā)處理后藜麥蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性顯著提高。較高的熱穩(wěn)定性有益于藜麥在需高溫加熱食品中的應(yīng)用。隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥蛋白的熱變性焓值ΔH快速下降,在萌發(fā)72 h時幾乎為0。說明在萌發(fā)過程中藜麥蛋白三級結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白質(zhì)發(fā)生變性,且萌發(fā)時間越長,變性蛋白質(zhì)占比越高。

表2 萌發(fā)時間對藜麥蛋白熱特性參數(shù)的影響

2.2.2 內(nèi)源性光譜

內(nèi)源性熒光光譜中的最大吸收波長(λmax)與蛋白中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境有關(guān),本研究掃描范圍為300～400 nm,主要以色氨酸(Trp)作為內(nèi)源探針觀測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化情況[25]。圖2為萌發(fā)藜麥蛋白的內(nèi)源性熒光光譜圖?？梢钥闯?萌發(fā)0 h時,藜麥蛋白的λmax為343 nm,此時Trp多分布在蛋白質(zhì)分子表面,其分子間的作用力限制了Trp與水分子的接觸[26];隨著萌發(fā)時間的延長,最大吸收波長發(fā)生紅移,λmax增大,這表明萌發(fā)處理后Trp逐漸暴露在極性環(huán)境中,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,疏水性降低[25];隨著萌發(fā)的繼續(xù)進(jìn)行,萌發(fā)藜麥蛋白質(zhì)的最大熒光強(qiáng)度逐漸降低,這可能與位于蛋白質(zhì)表面的Trp逐漸被氧化、數(shù)量減少有關(guān)[26]。

圖2 萌發(fā)藜麥蛋白的內(nèi)源性熒光光譜

2.2.3 表面疏水性

表面疏水性體現(xiàn)了蛋白質(zhì)表面氨基酸的疏水作用,對蛋白質(zhì)的功能特性有重要影響。萌發(fā)藜麥蛋白的表面疏水性指數(shù)變化如圖3所示,隨著萌發(fā)的進(jìn)行,藜麥蛋白的表面疏水性指數(shù)顯著降低(P<0.05)。在萌發(fā)過程中,為滿足植株生長發(fā)育的需求,部分藜麥蛋白質(zhì)將被酶水解,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,包埋在分子內(nèi)部的氨基酸殘基被暴露出來并發(fā)生氧化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的疏水性氨基酸殘基數(shù)量減少,使得ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合的數(shù)量降低,最終表現(xiàn)為表面疏水性的降低[5]。許英一等[27]研究發(fā)現(xiàn)熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水性和內(nèi)源性熒光強(qiáng)度呈極顯著的線性正相關(guān),許晶等[27]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的溶解性與表面疏水性呈顯著負(fù)相關(guān)。隨著萌發(fā)時間的增加,藜麥蛋白的表面疏水性與內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均呈下降趨勢,溶解度呈上升趨勢,這與許英一等[27]、許晶等[28]的研究結(jié)果一致。

圖3 萌發(fā)時間對藜麥蛋白表面疏水性指數(shù)的影響

2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

藜麥中儲存蛋白主要由2S清蛋白(35%)和11S球蛋白(37%)組成,均通過二硫鍵維持蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[29]。SDS-PAGE結(jié)果表明,在萌發(fā)48 h前,亞基條帶數(shù)目不變,但部分亞基條帶的強(qiáng)度(相對含量)卻有顯著的改變(圖4)。在未萌發(fā)的藜麥蛋白質(zhì)中,發(fā)現(xiàn)條帶中顯示出了A亞基(酸性亞基,32～39 ku)、B亞基(堿性亞基,22～23 ku)、清蛋白(108～9 ku)。其中,20～23 ku和32～39 ku的條帶最為顯著,即這2個亞基的相對含量最高,與張文剛等[20]報道分析結(jié)果一致。分子質(zhì)量為100、57、32～39 ku的亞基相對含量均呈下降趨勢,在萌發(fā)72 h時幾乎消失,而分子質(zhì)量為20～23、10～12 ku 的亞基相對含量較高。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)參與了藜麥的萌發(fā)過程,高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被蛋白質(zhì)分解酶分解為較低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)[5, 7]。也有可能是由于蛋白質(zhì)被分解成足夠小的碎片,逃逸出凝膠,考馬斯藍(lán)染色無法檢測到[30]。

圖4 萌發(fā)藜麥蛋白的SDS-PAGE分析圖譜

2.3 萌發(fā)時間對藜麥蛋白功能特性的影響

2.3.1 溶解度

由表3可知,藜麥蛋白質(zhì)的溶解度隨萌發(fā)時間的延長呈升高趨勢(P<0.05),在萌發(fā)72 h時,藜麥蛋白的溶解度達(dá)到最高(95.9%)。這是由于萌發(fā)處理后藜麥蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,其表面的疏水性氨基酸殘基數(shù)量減少、表面疏水性降低,故蛋白質(zhì)的溶解度升高。同時,在藜麥萌發(fā)過程中,由于種子呼吸代謝,在內(nèi)源酶作用下存在蛋白質(zhì)的分解和新蛋白的合成,而組成和結(jié)構(gòu)的改變可能使得蛋白質(zhì)具有更好的親水性,溶解度升高[19]。蛋白質(zhì)的溶解度是其發(fā)揮營養(yǎng)價值和功能特性的基礎(chǔ),萌發(fā)處理可改善藜麥蛋白的溶解度,有利于藜麥蛋白制品的開發(fā)。

表3 萌發(fā)時間對藜麥蛋白功能特性的影響

2.3.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性

乳化性是指將油相和水相混合形成乳化液的能力。利用蛋白的乳化性,可以將其用于生產(chǎn)冰淇淋類食物以及化妝品、包裝材料等某些化工產(chǎn)品[8]。從表3可以看出,萌發(fā)顯著提高了藜麥蛋白的乳化能力(P<0.05)。隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥蛋白的乳化性迅速增大,在萌發(fā)72 h時,達(dá)到最高(27.83 m2/g),比未萌發(fā)的藜麥蛋白提高了1.4倍。這是由于萌發(fā)過程中藜麥蛋白質(zhì)溶解度增加,能到達(dá)油-水界面的蛋白質(zhì)顆粒增多,乳化性提升[7];并且在萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,當(dāng)暴露高數(shù)量的疏水基團(tuán)時,乳液中乳化劑和油滴之間的結(jié)合能力變強(qiáng),疏水基團(tuán)的增加改善了油-水界面的分子排列,從而提高了加工過程中的乳化性[21]。

乳化穩(wěn)定性是表征乳濁液保持乳濁狀態(tài)的能力。由表3得知,隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥蛋白的乳化穩(wěn)定性迅速升高(P<0.05),萌發(fā)72 h時藜麥蛋白乳化穩(wěn)定性達(dá)到最高值68.59 min,比未萌發(fā)的藜麥蛋白提高了4.2倍。這可能是萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展,暴露更多疏水氨基酸,蛋白質(zhì)表面活性及柔性增強(qiáng),改善了乳化穩(wěn)定性[19]。同時,萌發(fā)藜麥蛋白在蛋白酶的作用下界面特性部分發(fā)生改變,并且伴隨著新蛋白的生成,一些新蛋白或蛋白亞基在油-水界面上相互作用更緊密,界面強(qiáng)度提高,使乳化穩(wěn)定性得以改善[7]。此外,酶解、去皂化以及其他成分(如糖蛋白)會影響蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)的表現(xiàn)[31]。

2.3.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性與其組成結(jié)構(gòu)、蛋白濃度、蛋白質(zhì)膜的流變性等有關(guān),可以賦予食品蓬松柔軟的質(zhì)感和良好的口感[19]。由表3可知,萌發(fā)處理對藜麥蛋白的起泡性及泡沫穩(wěn)定性有顯著影響(P<0.05)。隨著萌發(fā)時間的延長,藜麥蛋白的起泡性呈下降趨勢,泡沫穩(wěn)定性則先上升后下降,在萌發(fā)24 h時達(dá)到最大值(95.39%)。分析原因,隨著萌發(fā)的進(jìn)行,部分藜麥蛋白質(zhì)水解形成分子質(zhì)量較小的亞基結(jié)構(gòu),藜麥蛋白可溶性提高,使其在空氣-水界面具有更好的吸附能力,改善了藜麥蛋白的泡沫特性[19]。而藜麥蛋白起泡性呈逐漸下降的趨勢,可能是由于蛋白質(zhì)的起泡性與蛋白質(zhì)濃度有關(guān)。有研究表明,隨著蛋白質(zhì)濃度的增大,樣品溶液的黏度也增大,有利于泡沫的形成;但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度過大時,溶液黏度也過大,則不利于泡沫的形成,起泡性逐漸降低[32]。

3 結(jié)論

經(jīng)過萌發(fā)處理,藜麥粉的蛋白質(zhì)含量顯著提高,萌發(fā)藜麥蛋白的熱穩(wěn)定性提高,起泡性降低,可用于蛋糕、面包等食品加工,增加營養(yǎng)、豐富口感;溶解度、乳化性和乳化穩(wěn)定性增大,表面疏水性減弱,可更好地應(yīng)用于冰淇淋、乳制品等加工;萌發(fā)藜麥蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,萌發(fā)藜麥蛋白的大分子亞基數(shù)量減少而小分子亞基數(shù)量增加。萌發(fā)使得藜麥蛋白具有更好的加工性能,是一種值得推廣的加工方法。