扎 桑, 旺 姆

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院,拉薩 850000)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumhook. f),因其內(nèi)外穎片與穎果分離,故又稱無殼大麥或裸大麥,是禾本科、小麥族、大麥屬一年生草本植物,在我國主要生長在西藏自治區(qū)、青海、四川(甘孜藏族自治區(qū))、甘肅(甘南藏族自治區(qū))、云南(迪慶藏族自治區(qū)),種植面積約27萬ha2[1,2]。青稞作為我國青藏高原最主要的糧食作物,富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)(脂質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)等),也是燃料、牲畜飼料、啤酒、醫(yī)藥和保健品生產(chǎn)的原料,具有比普通谷物更高的營養(yǎng)價值,已成為一種具有廣闊應(yīng)用前景的經(jīng)濟(jì)作物[3]。研究報道發(fā)現(xiàn),青稞與許多谷類作物相比具有更高的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、纖維素和維生素含量[4,5]。此外,青稞還富含β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和多酚等多種生物活性成分[6],具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌能力[7,8],因此也被認(rèn)為是一種具有豐富保健和藥用價值的營養(yǎng)食品。

青稞富含多種對人體健康有益的多種脂類和不飽和脂肪酸,尤其是必需脂肪酸,如亞油酸、亞麻酸、油酸、卵磷脂、腦磷脂等[5]。據(jù)報道,青稞中不飽和脂肪酸有許多對人體有益的生理功能,可降低一些慢性和代謝性疾病的風(fēng)險,包括抗炎、降低膽固醇和心血管疾病等[5,7,8]。青稞中脂肪酸的組成和比例有成為降血糖保健食品的潛力[9]。研究表明,青稞的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.18%～3.09%,顯著高于多種谷類種子[2,10,11]。青稞籽粒中含有4種飽和脂肪酸和6種不飽和脂肪酸,其中不飽和脂肪酸占青稞總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)77%以上,主要由亞油酸(53.74%)、棕櫚酸(20.58%)、油酸(16.99%)和亞麻酸(5.04%)組成[5,12,13],其中亞油酸和棕櫚酸是青稞中的2種主要脂肪酸[14]。青稞中富含的脂肪酸對人體健康大有益處,但對青稞脂質(zhì)的研究卻十分有限。

禾谷種子中脂類變化與儲藏關(guān)系存在顯著的相關(guān)性[15,16]。在種子儲藏過程中,脂類會發(fā)生顯著變化,且可與蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生共氧化,從而影響種子的營養(yǎng)價值和食用品質(zhì)[17,18]。例如,游離脂肪酸含量、脂肪酶的活力隨著小麥、稻谷儲藏時間和儲藏溫度的增加而顯著變化[19,20]。脂類的變化與谷物中含量較多的蛋白和淀粉相比更容易促使禾谷類種子的變質(zhì),也是導(dǎo)致種子陳化的最主要因素[21]。脂質(zhì)可能是種子品質(zhì)評價的重要指標(biāo),研究儲藏過程中禾谷類種子脂質(zhì)組成和脂質(zhì)代謝具有重要的意義。目前缺乏較為系統(tǒng)的關(guān)于不同品種青稞種子及儲藏后脂質(zhì)代謝物比較和其對品質(zhì)影響的研究和報道。因此,本實(shí)驗(yàn)以7個青稞育成品種為材料,通過脂質(zhì)組學(xué)分析其在不同品種之間的差異,并且比較了在儲藏前后各品種青稞中脂質(zhì)的代謝情況,為青稞品質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和樣品處理

選取7個青稞品種進(jìn)行脂質(zhì)代謝研究(表1),包括4個廣適應(yīng)性的育成品種:zangqing2000(ZQ2000)、zangqing320(ZQ320)、zangqing148 (ZQ148)和13-5171-7。3個地方品種:喜拉19(XL22,日喀則農(nóng)科所育成的地方品種)、拉薩紫青稞(LSZ,地方品種-紫色)和藏0697(Z0697,藍(lán)色品種)。7個品種青稞種子分為儲存1年(A)和新收獲(B)2類,共14組(2×7),每組樣品均為3個生物學(xué)重復(fù)。青稞種子裝在鐵皮箱內(nèi)置于西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室內(nèi)存放1年,室溫(18～23 ℃)、相對濕度為20%～40%。將樣本研磨并稱取200 mg左右,加入1.5 mL甲醇沉淀蛋白,-20 ℃過夜,加入1.5 mL二氯甲烷,再加入D7-PLs內(nèi)標(biāo)10 μL(100 μg/mL),渦旋30 min后加入1.5 mL二氯甲烷和1.2 mL超純水,離心,取下清。重復(fù)提取1次,合并下清,氮吹干,用1 mL異丙醇,過0.22 μm 有機(jī)濾膜,準(zhǔn)備上機(jī)檢測。

表1 用于脂質(zhì)組檢測的青稞材料和分組信息

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜系統(tǒng)為shimadzu UPLC LC-30A,用Phenomenex Kinete C18 column (100 mm×2.1 mm,2.6 μm)色譜柱,柱溫為60 ℃,1 μL進(jìn)樣量,流速為0.4 mL/min,樣品室溫度為4 ℃。A相中VH2O∶VMEOH∶VCAN=1∶1∶1含(5 mmol CH3COONH4);B相中VIPA∶VCAN=5∶1(含5 mmol CH3COONH4),梯度洗脫條件為0.5 min,20% B相;1.5 min 40% B相;3 min 60% B相;13 min 98% B相, 13.1 min 20% B相, 17 min 20% B相。

質(zhì)譜系統(tǒng)為AB SciexTripleTOF?6600,ESI離子源,正模式,質(zhì)譜采集的質(zhì)量數(shù)范圍為m/z100～1 200,質(zhì)譜條件如下:簾氣: 35.000 psi;離子源Gas1: 50.000; 離子源Gas2: 50.00;離子噴霧電壓: 5 500.00 V; 溫度: 600 ℃。

1.3 脂質(zhì)代謝物定性定量和質(zhì)控分析

基于公共數(shù)據(jù)庫,對樣本的代謝物進(jìn)行了質(zhì)譜定性定量分析?；诟叻直媛实腝TOF質(zhì)譜,得到樣本中的特征峰的精確分子質(zhì)量,與數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行比對,得到代謝物的定性結(jié)果。根據(jù)質(zhì)譜中特征峰的離子信號強(qiáng)度(CPS),得到代謝物的相對定量結(jié)果。

質(zhì)控樣本(QC)由樣本提取物混合制備而成,用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中,每10個檢測分析樣本中插入1個質(zhì)控樣本,以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。通過對不同質(zhì)控QC樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖(TIC圖)進(jìn)行重疊展示分析,可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性,即技術(shù)重復(fù)。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了重要的保障。

1.4 主成分分析和聚類分析及相關(guān)性分析

主成分分析(PCA)是無監(jiān)督模式識別的多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法。PCA用R軟件(www.r-project.org/)的內(nèi)置統(tǒng)計(jì)prcomp函數(shù),設(shè)置prcomp函數(shù)參數(shù)scale=True,表示對數(shù)據(jù)進(jìn)行unit variance scaling(UV)歸一化。

聚類分析(Cluster Analysis)是分類的多元統(tǒng)計(jì)分析方法。代謝物含量數(shù)據(jù)采用UV歸一化處理,通過R軟件pheatmap包的cor函數(shù)計(jì)算并繪制熱圖,對代謝物在不同樣本間的積累模式進(jìn)行聚類分析(HCA),結(jié)果以樹狀圖的形式呈現(xiàn)。

1.5 差異代謝物的篩選

結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元統(tǒng)計(jì)分析的方法,最終準(zhǔn)確地挖掘差異代謝物?；贠PLS-DA結(jié)果,從獲得的多變量分析OPLS-DA 模型的變量重要性投影(VIP),初步篩選出不同青稞品種間差異的代謝物。同時結(jié)合單變量分析fold change值進(jìn)行差異篩選,即篩選標(biāo)準(zhǔn)為:VIP≥1且|log2FC|≥1。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞樣本的脂質(zhì)組檢測和質(zhì)控分析

選擇儲存1年和新收獲的青稞育成品種和地方品種7個,共14組材料進(jìn)行脂質(zhì)代謝組研究(表1)?；赨PLC-QTOF-MS檢測平臺和數(shù)據(jù)庫的檢索,14組青稞種子中共檢測到174個脂類代謝物。首先,為保證此次實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)的可靠性,本實(shí)驗(yàn)對檢測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)控分析,QC樣本的TIC圖能夠很好的重疊在一起,表明青稞種子中脂類代謝物的提取和檢測結(jié)果的重復(fù)性良好、數(shù)據(jù)可靠,可用于后續(xù)分析。

2.2 青稞籽粒中脂質(zhì)的分布

分析青稞種子中脂質(zhì)的分布情況發(fā)現(xiàn),青稞中檢測到174種脂質(zhì),主要包括64種甘油三酯(TAG),20種磷脂酰膽堿(PC)、17種脂肪酸(FFA)、7種甘油二酯(DAG)、15種磷脂酰乙醇胺(PE,腦磷脂)、9種磷脂酰甘油(PG)、8種磷脂酰肌醇(PI)、8種雙半乳糖甘油二脂(DGDG)、7種單半乳糖甘油二脂(MGDG)、8種血磷脂酰膽堿(LPC)、和11種其他類物質(zhì)(圖1)。青稞中含有的TAG種類最多,其次是PC,與其他種子中脂質(zhì)組成相似。對其含量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),在7種青稞材料中含量最高的3個脂質(zhì)均為磷脂酰膽堿,即PC 36∶4(PC 18∶2～18∶2),PC 34∶2(PC 16∶0～18∶2),PC 36∶3(PC 18∶1～18∶2)。除了PC以外,青稞中LPC(LPC 18∶2;LPC 16∶0)和TAG(TAG 52∶4;TAG 16∶0～18∶2～18∶2;TAG 54∶6;TAG 18∶1～18∶2～18∶3)的含量也很高,其在新收獲的青稞種子中含量顯著高于儲藏1年的種子。LPC 18∶2和LPC 16∶0含量在LSZ-B中最高,TAG 52∶4和TAG 54∶6含量在Z0697-B中最高。

圖1 青稞材料中脂質(zhì)代謝物的種類及數(shù)量分布情況

2.3 不同品種以及儲存前后青稞脂質(zhì)的PCA分析

對青稞種子中檢測到的所有脂類物質(zhì)在各組中的變化進(jìn)行PCA分析。分析結(jié)果如圖2所示。從圖2可知,ZQ2000-A與其他組別明顯分離開,而其他組別則聚集在一起,不能很好地分離,這說明ZQ2000-A組中脂質(zhì)分布與其他6種青稞品種之間存在顯著差異。ZQ2000-A組為青稞品種ZQ2000儲存1年之后的樣本,與該品種新收獲種子ZQ2000-B相比,存在顯著分離。表明ZQ2000品種青稞種子在儲存前后脂質(zhì)出現(xiàn)顯著變化,而其他品種在儲存前后并未出現(xiàn)明顯分離。PCA的分析結(jié)果初步表明,不同品種的青稞籽粒中脂質(zhì)差異不顯著,而儲存對于青稞籽粒中脂質(zhì)的影響可能與品種不同有關(guān)。不同品種的青稞種子在儲存前(即,新種子,B組)脂質(zhì)差異不顯著,而儲存后(儲存1年,A組)青稞籽粒中脂質(zhì)變化與品種有關(guān)。

圖2 青稞品種及儲存前后脂質(zhì)代謝物的主成分分析(PCA)

2.4 儲存前后對ZQ2000脂質(zhì)含量的影響

對ZQ2000品種在儲存前后的脂質(zhì)變化進(jìn)行分析。首先采用OPLS-DA建模處理,在判斷模型可靠后(Q2>0.9),利用VIP>1,以及FC>2或<0.5閾值進(jìn)行差異脂類代謝物的篩選,篩選結(jié)果如圖3所示。ZQ2000品種在儲存1年之后,下調(diào)的脂類物質(zhì)有24種,上調(diào)的脂類物質(zhì)16種,134種差異不顯著。詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn),其中上調(diào)的脂類物質(zhì)主要包括FFA(11種)、DAG(4種)。青稞種子在儲存過程中,游離脂肪酸含量增加,從而導(dǎo)致種子的品質(zhì)降低。此外,在種子的儲存過程中含量減少的脂質(zhì)類物質(zhì)主要包括TAG(10)、DGDG(6)、PE(3)和PC(3)等。由此可以推測,除了FFA以外,TAG、DGDG的變化可能也是引起種子陳化變質(zhì)的重要因素,其中含量變化顯著的FFA、TAG和DGDG的具體信息見表2。

表2 ZQ2000儲存前后差異脂質(zhì)類FFA、TAG和DGDG的具體信息

2.5 其他品種青稞在儲存前后對脂質(zhì)含量的影響

除了ZQ2000品種以外,也對另外6個品種青稞的脂質(zhì)類物質(zhì)做了差異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了ZQ320品種外,其他品種在儲存前后差異代謝物均不超過4個,其中13-5171-7-A中僅有1個(PE 18∶2～22∶5),LSZ中有4個(TAG 54∶9、TAG 18∶3～18∶3～18∶3、FFA 20∶1、PI 34∶3、PI 16∶0～18∶3、PI 36∶4、PI 18∶2～18∶2),XL22中有4個(DGDG 36∶3、DGDG 18∶1～18∶2、PC 40∶2、PC 22∶0～18∶2、PE 40∶7、PE 18∶2～22∶5、FFA 18∶1),Z0697中有3個(PC 34∶0、PC 16∶0～18∶0、FFA 20∶1、PE 40∶7、PE 18∶2～22∶5),ZQ148中1個(FFA 20∶1),這也與PCA分析的結(jié)果一致。另外,從ZQ320 中篩選到10種差異脂質(zhì)類物質(zhì),這些物質(zhì)與ZQ2000中的差異脂質(zhì)類物質(zhì)有部分的重疊。

3 討論

世界上有大約70%的食物來源于種子和以種子為食的動物,因此種子的儲存對人類的生存至關(guān)重要[22]。種子是植物中主要的儲存器官,主要儲存淀粉、脂類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[23]。研究表明,青稞籽粒中含有多種脂肪酸,主要包括亞油酸、棕櫚酸、油酸和亞麻酸等[5,12,13]。水稻種子中的脂肪酸主要為棕櫚酸、油酸和亞油酸,同時還存在有少量肉豆蔻酸、硬脂酸、亞麻酸[24]。研究人員對5個小麥品種麩皮的脂質(zhì)成分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)其主要包括TAG(80.6%～86.0%)、FFA(4.2%～9.0%)和磷脂(5.5%～6.7%),PL中包括磷脂酰膽堿(31.8%～46.8%)、磷脂酰乙醇胺(25.0%～38.9%)和磷脂酰肌醇(20.2%～23.2%),不同品種間FFA的分布差異不顯著(P>0.05)[25]。Fisher等[26]也研究報道了小麥籽粒中的脂肪酸組成,發(fā)現(xiàn)其在不同品種之間不存在差異。本研究的結(jié)果與前人的結(jié)果相似,通過UPLC-QTOF-MS檢測平臺檢測到7個品種青稞籽粒中的脂質(zhì)類主要包括TAG、PC、FFA、DAG和PE等。水稻種子中脂質(zhì)和脂肪酸組成在品種上也不存在差異[24]。結(jié)果還發(fā)現(xiàn),在7個不同品種的青稞中脂質(zhì)的種類也無顯著差異,與前人的報道結(jié)果相一致。因此推測,來自不同物種的籽粒或種子中脂質(zhì)的組成存在部分相似,而來自同一種物種的籽粒、種子的脂質(zhì)或脂肪酸的組成相同。

脂類與籽粒品質(zhì)密切相關(guān),脂質(zhì)含量的變化與籽粒的品種和儲藏時間在顯著的相關(guān)性[16]。禾谷類種子在儲藏過程中不可避免地會發(fā)生變質(zhì),其中脂質(zhì)降解是種子儲藏過程中變質(zhì)的主要原因[27]。與谷物中含量較多的蛋白和淀粉相比,脂類的變化更容易促使種子的陳化變質(zhì)[21]。在種子儲藏過程中,脂類易與蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生共氧化,進(jìn)而影響種子的營養(yǎng)價值和食用品質(zhì)[17,18]。因此,近年來谷類儲藏過程中的品質(zhì)劣化問題越來越受到人們的重視。通過對脂質(zhì)代謝組的分析發(fā)現(xiàn),青稞種子在儲存前后的脂質(zhì)變化也與品種有關(guān),一些品種在儲存后其籽粒中脂質(zhì)變化差異顯著,如ZQ2000-A與其他6個品種相比,在儲存前后其脂質(zhì)變化就存在顯著的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,脂類含量變化明顯,如FFA、DAG、TAG、DGDG、PE和PC等,特別是FFA的含量與新收獲青稞種子相比,其含量在儲存1年后顯著增加。

游離脂肪酸和其他有毒的細(xì)胞代謝物含量在種子儲存過程中的變化是導(dǎo)致種子品質(zhì)惡化的主要因素[28,29]。谷物在儲藏過程中游離脂肪酸含量普遍增加,如小麥、水稻等[30]。由于游離脂肪酸含量與儲藏種子的品質(zhì)密切相關(guān),因此,谷物中游離脂肪酸含量的變化也常被用來衡量其儲藏質(zhì)量的指標(biāo)之一,將游離脂肪酸含量與儲藏時間相結(jié)合可以有效地判定儲藏種子的品質(zhì)[31]。本實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果與之相符,青稞種子在儲存后游離脂肪酸(FFA)含量顯著增加(P<0.05)。游離脂肪酸是脂肪氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一,而脂肪氧化是種子老化過程中一個重要的生化反應(yīng)。有報道稱,自由基的形成和脂質(zhì)氧化是影響種子品質(zhì)的主要因素[32]。由中性脂肪酸分解形成的游離脂肪酸可以刺激活性氧和活性氮的增加,從而激活細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制,并在細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮作用[33]。由自由基引起的脂質(zhì)過氧化是儲藏過程中細(xì)胞膜退化的主要過程[34]。種子儲藏過程中,蛋白質(zhì)變質(zhì)就是通過與游離脂肪酸氧化產(chǎn)生的醛類反應(yīng)發(fā)生的[31,35]。研究結(jié)果推測,青稞種子在儲藏過程中籽粒FFA含量顯著增加,過量的FFA會引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致籽粒中的蛋白變質(zhì)等一系列生化反應(yīng)的發(fā)生,嚴(yán)重影響其品質(zhì)。

在儲藏過程中,收獲后的谷物繼續(xù)消耗種子中的營養(yǎng)物質(zhì)以產(chǎn)生能量,維持新陳代謝[36],從而影響其加工質(zhì)量和口感[37]。儲存穩(wěn)定性對保證優(yōu)質(zhì)谷物的持續(xù)供應(yīng)和穩(wěn)定谷物類品質(zhì)具有重要意義[25]。種子植物中普遍存在以TAG的形式來儲存能量,即便是在以淀粉形式儲存的谷物中也是如此。研究表明,在擬南芥等的種子發(fā)育過程中,淀粉只會短暫積累,最終會將其轉(zhuǎn)化為TAG并儲存在脂質(zhì)體等細(xì)胞器中[38]。TAG還可儲存在種子胚、糊粉層細(xì)胞及少數(shù)淀粉胚乳中,其總脂質(zhì)含量約占籽粒干重的3%[39]。在本實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了FFA與青稞種子陳化顯著相關(guān)之外,還發(fā)現(xiàn)甘油三酯、雙半乳糖甘油二脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿可能也與青稞種子儲藏過程中品質(zhì)降低相關(guān)。TAG、DGDG、PE和PC的含量和種類在青稞籽粒儲存前后存在顯著的差異,其含量顯著減少?？赡苁莾Υ孢^程中籽粒為了維持自身新陳代謝而將其分解提供能量。

4 結(jié)論

對儲藏前后不同品種青稞種子中脂質(zhì)代謝物的變化進(jìn)行了檢測和分析,在7個品種青稞籽粒中檢測到的脂質(zhì)物質(zhì)主要為64種甘油三酯、20種磷脂酰膽堿、17種脂肪酸和15種磷脂酰乙醇胺。不同品種的青稞籽粒在儲藏前的脂質(zhì)種類差異不顯著,而儲藏后對于不同品種青稞籽粒中脂質(zhì)含量具有顯著影響,且含量變化與不同的品種特性有關(guān)。青稞籽粒在儲存過程中,FFA含量顯著增加。然而,儲藏1年后籽粒中TAG(10)、雙半乳糖甘油二脂(6)、PC(3)和PE(3)的含量顯著降低。這些結(jié)果導(dǎo)致了青稞種子在儲藏過程中品質(zhì)的降低和種子陳化。結(jié)果表明,儲藏過程中脂類物質(zhì),如FFA、TAG、PC、PE和DGDG含量的變化可能是引起青稞籽粒營養(yǎng)成分改變和種子陳化的主要原因。