郭曉潔，劉鵬暉，龍 子，李佳威，涂永梅，李文麗，*，劉啟玲*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032)

光氣是一種劇毒氣體，問(wèn)世已有200 余年，在第一次世界大戰(zhàn)期間曾被作為化學(xué)武器使用[1-2]。雖然光氣的毒性非常強(qiáng)，但它在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，光氣被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，如農(nóng)藥、塑料、染料、聚氨酯的合成以及冶金行業(yè)，并且在制藥生產(chǎn)過(guò)程中同樣是一種不可或缺的中間體[3]。近年來(lái)，在工業(yè)生產(chǎn)中因操作不當(dāng)導(dǎo)致光氣泄漏事故頻發(fā)，最終造成職業(yè)人員的傷亡。例如在2021年河南宇銳化工科技有限公司三車間發(fā)生光氣和氯化氫混合氣體泄漏，造成2人死亡、13人住院治療，直接經(jīng)濟(jì)損失300.93萬(wàn)元。然而，現(xiàn)有研究對(duì)于光氣暴露的毒性機(jī)制仍不清楚，并且缺乏特效救治手段[4-5]。因此，研究光氣的毒性機(jī)制并確定有效的治療策略是目前亟須解決的重大科學(xué)問(wèn)題。

光氣暴露主要損害呼吸系統(tǒng)。光氣引起的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)通常與短時(shí)間內(nèi)吸入大量光氣有關(guān)[6-7]。而長(zhǎng)期、低劑量接觸可引起慢性通氣不足、難治性肺水腫及其他相關(guān)肺部損傷，最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的發(fā)生[8-9]。在呼吸道接觸光氣后，初期主要癥狀為輕度干咳，早期還會(huì)伴有黏膜刺激癥狀[10]。如果暴露者仍長(zhǎng)時(shí)間處于致病環(huán)境中，呼吸道刺激癥狀會(huì)在幾小時(shí)內(nèi)迅速發(fā)展，通常表現(xiàn)為劇烈咳嗽、胸悶以及喘息[7]。在大量或長(zhǎng)時(shí)間吸入光氣后，會(huì)出現(xiàn)典型ALI 的臨床癥狀，包括肺水腫、呼吸困難和低氧血癥，嚴(yán)重時(shí)可能發(fā)展為ARDS[11]。在ALI的晚期，患者往往會(huì)出現(xiàn)慢性肺部疾病，包括氣流受阻、纖維化[12]、氣道高反應(yīng)性以及氣體交換障礙等[13-14]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類性質(zhì)非?；顫姷姆肿?，在機(jī)體內(nèi)過(guò)量蓄積時(shí)會(huì)通過(guò)攻擊關(guān)鍵的生物大分子，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷。在生理?xiàng)l件下，通過(guò)保持氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡，肺組織中的ROS 含量始終保持在一個(gè)較低的水平[15]。已有研究表明，過(guò)量ROS 會(huì)引起肺內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷[16]，同時(shí)伴有肺毛細(xì)血管通透性的增加和肺泡表面活性物質(zhì)的減少，導(dǎo)致肺水腫和肺不張，最終發(fā)展為ALI[17]。研究表明，這些受損細(xì)胞會(huì)激活自噬以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18-19]，但過(guò)度自噬也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。既往研究顯示，ROS介導(dǎo)的大分子和細(xì)胞器氧化或輕度氧化應(yīng)激激活自噬通路，清除受損的大分子和蛋白聚集物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬是受ROS和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的最重要的生物反應(yīng)之一[20]。

由于氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)的破壞在光氣暴露誘導(dǎo)的ALI 中具有重要的調(diào)控作用，因此提示我們，過(guò)量ROS在肺組織中蓄積可能是光氣發(fā)揮其毒作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。但目前光氣暴露是否能夠誘導(dǎo)肺組織ROS水平上升，以及ROS 水平上升后誘導(dǎo)ALI 發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。本研究旨在闡明大鼠光氣暴露模型中肺組織ROS水平的變化，并將自噬作為研究的新方向，初步明確氧化應(yīng)激是否調(diào)控自噬緩解光氣誘導(dǎo)的ALI，為光氣肺損傷的救治提供潛在干預(yù)靶點(diǎn)和策略。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及其飼養(yǎng)

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將所有大鼠圈養(yǎng)在環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對(duì)濕度為(55±5)%的動(dòng)物籠里，自由攝入水和飼料，12 h/12 h明暗交替。每日定時(shí)觀察動(dòng)物一般狀況，經(jīng)過(guò)4～5 d 的適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑光氣(氣瓶規(guī)格：體積10 L、氣壓150 bar)購(gòu)于德國(guó)林德公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)試劑盒購(gòu)于TIANGEN 公司；雷帕霉素(rapamycin，RPM)、乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購(gòu)于中國(guó)MCE 公 司(AY-22989，HY-B0215)；NF-E2 相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase1，HO-1)、SOD 和CAT抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity 公司；LC3II/LC3I、Beclin-1 和P62 抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；β-actin 抗體購(gòu)于Bioworld公司。

1.2.2 主要儀器光氣鼻吸入染毒設(shè)備，購(gòu)于德國(guó)拜耳公司；全身體積描記檢測(cè)系統(tǒng)，購(gòu)于Whole Body Plethsmography 公 司；Nikon ECLIPSE Ni-U 正置熒 光顯微鏡、FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀、蛋白電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)裝置及凝膠成像與分析系統(tǒng)、T100 梯度PCR 儀、實(shí)時(shí)定量PCR 儀，均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司；超微量分光光度計(jì)，購(gòu)于美國(guó)Denovix公司。

1.3 方 法

1.3.1 動(dòng)物分組和處理為探討光氣暴露動(dòng)物模型最適濃度，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、染毒后6、12、24和48 h組，每組10只。自適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，對(duì)照組大鼠鼻吸入空氣，光氣染毒組大鼠鼻吸入41 mg/m3的光氣，動(dòng)態(tài)染毒30 min。染毒結(jié)束后，分別在6、12、24和48 h時(shí)測(cè)定大鼠肺功能，隨后使用戊巴比妥鈉(50 g/L)麻醉并處死大鼠，取大鼠肺組織和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，后選擇染毒后12 h組作為本研究動(dòng)物模型(后稱光氣組)。為探討自噬在光氣誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用，將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、光氣組、RPM處理組和RPM對(duì)照組，每組10 只。RPM 處理組和RPM 對(duì)照組在光氣暴露和空氣

暴露后立即給予自噬激動(dòng)劑RPM(5 mg/kg)，腹腔注射處理，對(duì)照組和光氣組注射相同體積的生理鹽水。為探討氧化應(yīng)激對(duì)自噬的調(diào)控作用，另取40只大鼠分為對(duì)照組、光氣組、NAC處理組和NAC對(duì)照組，每組10只。NAC處理組和NAC對(duì)照組在光氣暴露和空氣暴露后立即給予抗氧化劑NAC(200 mg/kg)，腹腔注射處理。對(duì)照組和光氣組處理如前所述。光氣暴露后12 h麻醉大鼠收集肺組織和BALF。

1.3.2 肺濕質(zhì)量與肺系數(shù)檢測(cè)肺濕質(zhì)量與肺系數(shù)是肺水腫的重要指標(biāo)。取下肺組織，擦干表面血液，立即稱取質(zhì)量。肺系數(shù)為每只大鼠的肺濕質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。

1.3.3 肺泡灌洗液總蛋白濃度測(cè)定大鼠處死后，取出完整的雙肺進(jìn)行心肺分離，將大鼠右主支氣管結(jié)扎，使用5 mL注射器經(jīng)灌胃針將3 mL生理鹽水緩慢注入左肺，停留30 s 后吸出收集于EP 管內(nèi)。重復(fù)以上步驟一次，將兩次收集的BALF 在4 ℃條件下，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清使用BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。

1.3.4 組織病理學(xué)檢測(cè)選擇未行BALF 收集的大鼠右肺組織，使用預(yù)冷的PBS 洗滌，再用4% PMO 固定，連續(xù)梯度濃度的乙醇脫水，石蠟包埋，切成5 μm 切片，蘇木精、伊紅染色。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.3.5 全身體積描記系統(tǒng)檢測(cè)大鼠肺功能光氣染毒后6、12、24 和48 h，將大鼠放入全身體積描記檢測(cè)倉(cāng)，大鼠適應(yīng)5 min 后，進(jìn)入15 min 的正式監(jiān)測(cè)程序，獲取大鼠支氣管收縮系數(shù)，呼氣末暫停和呼吸暫停指標(biāo)。

1.3.6 DHE 染色檢測(cè)ROS 含量取新鮮的肺組織放置在自制凹槽內(nèi)，立即加入適量的OCT包埋劑浸沒(méi)組織，液氮速凍10～20 s 后置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片，厚度為5 μm，組織固定液固定30 min 后蒸餾水洗凈待用。將50 μL濃度為10 mol/L的DHE溶液滴入切片中，在37 ℃下孵化30 min。PBS清洗3遍后滴加封閉液，使用熒光顯微鏡觀察圖像，最后使用ImageJ軟件進(jìn)行量化分析。

1.3.7 組織免疫熒光染色法檢測(cè)肺組織4HNE 的表達(dá)將肺組織切片脫蠟后經(jīng)過(guò)高溫抗原修復(fù)，用含0.3% Triton X-100 透膜后，血清封閉。切片與兔抗4HNE 在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌后，滴加二抗，室溫下避光孵育30 min，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核10 min，觀察細(xì)胞核。PBS 充分洗滌后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件進(jìn)行量化分析。

1.3.8 肺勻漿抗氧化酶活性檢測(cè)稱取所需質(zhì)量的肺組織，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例，加入生理鹽水制成組織勻漿。采用SOD、CAT和GSH檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定肺勻漿中SOD、CAT 的活力和GSH 含量，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書操作。

1.3.9 Western blot檢測(cè)氧化還原及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平用組織研磨機(jī)將標(biāo)本放入組織溶解緩沖液中勻漿，制備肺組織蛋白提取物。裂解液經(jīng)離心取上清，用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)所需的分子質(zhì)量分離范圍，在10%或12%的SDS-PAGE 凝膠中，加入30 μg 蛋白樣品，電泳結(jié)束后，并將其均勻地分布在PVDF 膜表面，以便進(jìn)一步的分析。使用以下一抗Nrf2、HO-1、SOD、CAT(均按1∶1 000 稀釋)，Beclin-1(1∶2 000稀釋)，P62(1∶10 000稀釋)和LC3II/LC3I(1∶2 000稀釋)在4 ℃條件下封閉過(guò)夜。洗滌后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合抗體室溫下孵育1 h。再次洗膜后使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)蛋白可視化，以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件進(jìn)行量化。

1.3.10 RNA 提取和定量PCR按照說(shuō)明書使用TRIzol法提取每只大鼠的肺組織總RNA。根據(jù)260 nm波長(zhǎng)下的吸光度值計(jì)算RNA含量，通過(guò)A260/A280比值來(lái)確定RNA 純度。用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄總RNA。以β-actin為內(nèi)源性對(duì)照，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，qPCR引物見表1。循環(huán)條件為95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s。采用2-ΔΔCT法計(jì)算Nrf2、HO-1、SOD 和CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qPCR引物序列信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用GraphPad Prim 9.0 軟件進(jìn)行分析，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光氣暴露對(duì)大鼠肺組織的損傷效應(yīng)

為了明確光氣暴露對(duì)大鼠肺組織的損傷效應(yīng)，我們使用41 mg/m3光氣經(jīng)呼吸道動(dòng)態(tài)暴露30 min后，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，光氣暴露后不同時(shí)間點(diǎn)均產(chǎn)生了一定損傷效應(yīng)。與對(duì)照組相比，暴露后6 h，肺泡內(nèi)有明顯炎性滲出，肺泡壁部分?jǐn)嗔?，但基本能夠維持肺泡正常結(jié)構(gòu)。暴露后12 h，肺泡融合，肺間質(zhì)增厚，炎性細(xì)胞增多。而暴露后24和48 h，肺組織的病理結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎性滲出有所減輕。肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有變化，但暴露后12 h 組變化最為顯著。此外，大鼠BALF 總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停以及呼吸暫停等指標(biāo)均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果。由此可見，使用41 mg/m3光氣經(jīng)呼吸道暴露30 min能夠誘導(dǎo)大鼠發(fā)生ALI，并且在暴露后12 h 時(shí)損傷效應(yīng)最為顯著。

圖1 光氣染毒后不同時(shí)間對(duì)大鼠肺組織的損傷效應(yīng)

2.2 光氣暴露對(duì)大鼠肺組織氧化還原平衡的影響

在光氣暴露的大鼠肺組織中，我們觀察到了活性氧水平的變化。如圖2 所示，與對(duì)照組相比，在光氣暴露的大鼠肺組織中，不同時(shí)間點(diǎn)DHE染色的熒光強(qiáng)度均升高，其中暴露后12 h 組熒光強(qiáng)度變化最為顯著。4HNE 染色結(jié)果表現(xiàn)出了與DHE 染色結(jié)果相同的變化趨勢(shì)，表明肺組織的脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高。檢測(cè)一系列抗氧化酶的表達(dá)水平及酶活力，如圖3 所示，發(fā)現(xiàn)光氣暴露后，Nrf2 和HO-1 的轉(zhuǎn)錄水平升高，SOD和CAT的轉(zhuǎn)錄水平降低?？寡趸傅牡鞍妆磉_(dá)水平趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)基本一致。SOD及CAT的酶活力結(jié)果顯示，光氣暴露后，與對(duì)照組相比，抗氧化酶活性降低，其中暴露后12 h 組的變化最為明顯。同時(shí)，光氣暴露組的肺組織GSH含量顯著降低。以上表明，光氣暴露后肺組織氧化還原平衡發(fā)生紊亂。

圖2 光氣染毒后不同時(shí)間大鼠ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化水平變化

圖3 光氣染毒后不同時(shí)間大鼠抗氧化酶表達(dá)水平和活性變化(n=3)

2.3 光氣誘導(dǎo)的ALI與自噬的關(guān)系

除ROS 的變化外，在光氣暴露的大鼠肺組織中，我們還觀察到了自噬的變化，結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比，光氣暴露后大鼠肺組織中Beclin-1 和LC3II/LC3I蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，而P62蛋白的表達(dá)水平升高，說(shuō)明自噬程度明顯降低。使用自噬激動(dòng)劑RPM 處理后，上述分子的表達(dá)水平明顯恢復(fù)，說(shuō)明RPM緩解了光氣抑制的自噬(圖4A～D)。我們觀察RPM處理后肺組織ALI情況，HE染色顯示，肺組織的病理結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎性滲出有所減輕(圖4E)。并且使用RPM提高自噬水平后，肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)有所恢復(fù)(圖4F～G)。大鼠BALF總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停時(shí)間以及呼吸暫停等指標(biāo)均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果(圖4H～K)。以上結(jié)果表明，自噬激動(dòng)劑RPM能夠緩解光氣誘導(dǎo)的ALI。

圖4 RPM處理的光氣暴露大鼠自噬水平變化及ALI程度

2.4 ROS對(duì)自噬的調(diào)控在光氣誘導(dǎo)ALI中的作用

結(jié)果見圖5，使用抗氧化劑NAC 處理光氣暴露的大鼠，DHE 的熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.01)，說(shuō)明NAC緩解了光氣誘導(dǎo)的ROS 升高(P<0.01)。由于我們已經(jīng)證實(shí)了ROS 和自噬在光氣暴露誘導(dǎo)的ALI 中發(fā)揮重要作用，為了探討二者之間的調(diào)控方式，我們檢測(cè)NAC處理后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Beclin-1 和P62 在經(jīng)抗氧化劑處理后蛋白表達(dá)水平均有所恢復(fù)，說(shuō)明ROS與自噬存在相關(guān)關(guān)系，并且在光氣暴露誘導(dǎo)的ALI 中，自噬程度的變化能夠由ROS 水平調(diào)控。進(jìn)一步研究NAC 處理后肺組織ALI 情況，HE 染色顯示，肺組織的病理結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎性滲出有所減輕(圖6A)。并且使用NAC清除活性氧后，肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)結(jié)果有所恢復(fù)(圖6B、C)。大鼠BALF總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停以及呼吸暫停等指標(biāo)均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果(圖6D～G)。綜上所述，使用NAC處理后促進(jìn)自噬水平的恢復(fù)，從而緩解了光氣誘導(dǎo)的ALI。

圖5 NAC處理的光氣暴露大鼠ROS及自噬水平變化

圖6 NAC處理的光氣暴露大鼠ALI程度

3 討論

ALI 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的病理生理變化就是肺水腫，并且其產(chǎn)生原因包含多方面因素[21]。一方面，吸入光氣后會(huì)迅速與肺泡表面活性物質(zhì)發(fā)生作用[22]。在表面活性物質(zhì)耗盡后，剩余的光氣開始與肺組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)膜受損，進(jìn)而破壞肺血?dú)馄琳?，最終導(dǎo)致肺水腫[23]。同時(shí)，這一過(guò)程伴隨著大量的炎性介質(zhì)和ROS 的釋放，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性的增加，加重了肺水腫的癥狀[24-25]。現(xiàn)有的研究大部分集中在案例研究或人群的回顧性研究，使用動(dòng)物模型深入研究其作用機(jī)制的數(shù)量相對(duì)較少，并且并未得出一致性的結(jié)論。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)光氣染毒后不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠肺組織肺泡完整性受損，可見明顯出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫。肺濕質(zhì)量，肺系數(shù)及BALF 明顯增加，肺功能下降，以暴露后12 h最顯著。以上指標(biāo)表明我們成功建立了光氣暴露誘導(dǎo)SD大鼠ALI的動(dòng)物模型，并且觀察到ALI 的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)的機(jī)制研究打下了基礎(chǔ)。

此外，我們還在光氣暴露動(dòng)物模型的肺組織中觀察到活性氧水平的明顯升高、抗氧化酶活性的明顯降低以及抗氧化酶表達(dá)水平的明顯變化，并且與ALI 的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系變化趨勢(shì)基本一致。結(jié)果表明，光氣暴露能夠誘導(dǎo)肺組織中大量ROS的產(chǎn)生以及抗氧化酶系統(tǒng)的激活。與一些研究相似，光氣誘導(dǎo)ALI 的過(guò)程通常伴隨著CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和SOD 等抗氧化酶的異常表達(dá)[26]。Nrf2是一個(gè)在細(xì)胞中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體處于氧化-抗氧化狀態(tài)失衡時(shí)，細(xì)胞核外的Nrf2 被激活，同時(shí)調(diào)控下游的抗氧化酶HO-1 表達(dá)增高，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[27]。研究表明，抑制Nrf2 會(huì)導(dǎo)致Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，引起氧化應(yīng)激，進(jìn)一步加重肺部損傷[28]。在本實(shí)驗(yàn)中，qPCR 和Western blot 顯示，光氣組大鼠Nrf2 和HO-1 水平升高，而SOD和CAT的水平降低，我們猜測(cè)這種結(jié)果可能與不同抗氧化酶對(duì)光氣的敏感性不同有關(guān)。同時(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn)，給予抗氧化劑NAC可以改善光氣暴露導(dǎo)致的氧化損傷以及肺水腫的癥狀，表明氧化損傷在光氣誘導(dǎo)的肺水腫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們證明了氧化還原平衡紊亂可能是導(dǎo)致光氣誘導(dǎo)的ALI 早期階段一個(gè)不可或缺的環(huán)節(jié)。

大量研究表明，ROS 是營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致自噬的早期誘導(dǎo)因素[29]。Zhang等[30]的一項(xiàng)研究提出，是參與葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸或血清剝奪后誘導(dǎo)的自噬的主要ROS。而其他研究結(jié)果表明，H2O2是饑餓狀態(tài)下首先產(chǎn)生的分子。本研究發(fā)現(xiàn)，光氣暴露后大鼠肺組織中自噬水平降低，使用NAC 處理后其程度有所恢復(fù)，與使用自噬激動(dòng)劑RPM處理后結(jié)果相似，對(duì)光氣誘導(dǎo)的ALI 有明顯的緩解作用。因此，本研究證實(shí)，ROS能夠調(diào)控自噬程度，并且通過(guò)抑制自噬，在光氣誘導(dǎo)的肺水腫中發(fā)揮損傷作用。同時(shí)，我們還提出抗氧化劑治療可能是預(yù)防或改善ALI 的潛在治療策略，而在已經(jīng)產(chǎn)生ALI 時(shí)可以使用雷帕霉素等能夠激活自噬過(guò)程的藥物進(jìn)行處理，以緩解光氣誘導(dǎo)的ALI。