文 柏金霞* 張彩雯 王蕓芳 陳莉 宋燕華 .浙江索契壹營養(yǎng)科技有限公司；.浙江省疾病預(yù)防控制中心

本文目的為探討復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠免疫力功能的影響。參照《保健食品檢驗評價技術(shù)規(guī)范（2003版）》的方法，設(shè)置空白對照組（去離子水），持續(xù)30d，分別用0.5、1.0、3.0g/kg體重3個劑量的濃縮乳清蛋白粉對小白鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃。對小鼠進(jìn)行細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能試驗和NK細(xì)胞活性測定。結(jié)果顯示，各劑量組對小鼠體重增長、臟器/體重比值、ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、血清溶血素水平、抗體生成細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞活性均無顯著性影響。足跖增厚實驗中，中、高劑量組小鼠足跖厚度差值較陰性對照組增高（P<0.05）。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗中，高劑量組的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)較陰性對照組顯著增加（P<0.05）；中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率比陰性對照組有升高（P<0.05）。復(fù)方濃縮乳清蛋白供試樣品對細(xì)胞免疫功能以及單核巨噬細(xì)胞功能均具有顯著的提升作用，研究表明復(fù)方濃縮乳清蛋白粉具有提高小鼠免疫力的作用。

先天性免疫與后天性免疫的共同作用，形成宿主免疫功能。前者對病原體反應(yīng)迅速且非特異性，而后者反應(yīng)較慢但特異性強(qiáng)，產(chǎn)生長期免疫記憶。人體通過免疫系統(tǒng)的作用進(jìn)行防御。當(dāng)免疫力下降時，機(jī)體的反應(yīng)能力下降，不能快速的發(fā)現(xiàn)、排除、消除“異己”，從而引發(fā)疾病。機(jī)體免疫功能會隨著環(huán)境的變化而改變，并且免疫力低下的人群也在逐年增加。

乳清蛋白目前可通過現(xiàn)代化技術(shù)從牛奶中獲得，其氨基酸比例較完美，且易被消化和吸收。不僅如此，它還能在消化過程中生成多種肽類物質(zhì)，具有生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，它能幫助人體生長發(fā)育，還具有提高免疫力、緩解疲勞等功能。乳清蛋白還富含免疫球蛋白、乳鐵蛋白（LF）。免疫球蛋白也是母乳中常見的免疫成分之一，目前，僅有IgG形式能通過胎盤，是幫助新生兒對抗外界病毒、細(xì)菌入侵的主要活性物質(zhì)。LF是參與血清鐵轉(zhuǎn)運的鐵結(jié)合蛋白，約占全部蛋白質(zhì)的1/5，是母乳中重要的乳清蛋白成分。LF在人和牛乳中均可發(fā)現(xiàn)，主要由中性粒細(xì)胞和幾種粘膜細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并有防御病毒侵染的作用。

唾液酸自身的衍生物高達(dá)50多種，N-乙酰神經(jīng)氨酸是其中最重要的一種，是大部分高等脊椎動物組織存在的形式，因此，它被廣泛認(rèn)為是唾液酸的主要成分。N-乙酰神經(jīng)氨酸的運用非常廣泛，在食品領(lǐng)域中可作為提高記憶力和智力、預(yù)防阿茲海默癥、維持腸道的健康、提升機(jī)體免疫能力等功效的原料。

基于上述考慮，參照評價技術(shù)規(guī)范的試驗要求，本研究以濃縮乳清蛋白粉、N-乙酰神經(jīng)氨酸、低聚半乳糖為原料制備的復(fù)方濃縮乳清蛋白粉為對象對小鼠進(jìn)行了免疫力功能影響的研究，為其在免疫力功能相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 試驗樣品

復(fù)方濃縮乳清蛋白粉由本公司自主研發(fā)，主要活性成分為N-乙酰神經(jīng)氨酸、免疫球蛋白IgG、LF（來自于濃縮乳清蛋白粉）。復(fù)方濃縮乳清蛋白粉的人群推薦量如下：8-20kg幼兒及兒童為2g/d，20-40kg兒童及青少年為4g/d，40kg以上青少年及成人為6g/d。本實驗采用最低人推薦服用量0.1g/kg/d進(jìn)行劑量設(shè)置。試驗前將樣品溶于去離子水，并配制成不同濃度的溶液，在混合均勻后使用。

1.2 動物篩選和檢驗條件

實驗動物使用許可證號：SYXK(浙）2013-0190。上海喜普-必凱實驗動物有限公司提供ICR小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬）2013-0016，SPF級，均為雌性，小鼠體重18-22g。飼料來源于浙江省實驗動物中心，符合《浙江省實驗動物中心飼料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。小鼠試驗環(huán)境為屏障環(huán)境，確保實驗室的環(huán)境控制在20-24℃的恒定溫度和40-70%的恒定相對濕度，動物需提前4天適應(yīng)。

1.3 劑量設(shè)計

低劑量組：0.5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的5倍；中劑量組：1.0g/kg標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的10倍；高劑量組：3.0g/kg標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的30倍。各劑量組分別稱取待試產(chǎn)品2.5g、5.0g和15.0g，加入去離子水配制成濃度為0.05、0.10和0.30g/mL的三種溶液，作為試樣從口灌入小鼠胃中，灌入胃的量按0.1mL/10g計算。

1.4 主要儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡；CO2培養(yǎng)箱；721分光光度計；酶標(biāo)儀；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；小牛血清；Hank’s液；YAC-1細(xì)胞；碳酸鈉；氯化鈉；印度墨汁；去離子水。

1.5 實驗方法

臟器/體重值的測試方法：受試樣品灌入各組小鼠胃中，每天一次，持續(xù)30d后處死小鼠，從中取出胸腺和脾臟，并進(jìn)行稱重，確定胸腺與體重的比值以及脾臟與體重的比值。

其他免疫指標(biāo)測定：按照評價技術(shù)規(guī)范進(jìn)行以下實驗：采用MTT法進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗、采用足跖增厚法進(jìn)行綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘導(dǎo)小鼠DTH實驗、采用血凝法進(jìn)行小鼠血清溶血素測定、采用Jerne改良玻片法進(jìn)行抗體生成細(xì)胞測定、采用半體內(nèi)法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗、小鼠碳廓清實驗、采用LDH測定法進(jìn)行NK細(xì)胞活性測定。

1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.結(jié)果

2.1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠體重的影響

結(jié)果顯示，各劑量組小鼠體重在整個實驗過程中與陰性對照組對比均無顯著差異（方差分析，P>0.05）。表明不同劑量的樣品對小鼠體重?zé)o影響。

2.2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠臟器與體重比值的影響

結(jié)果顯示，各劑量組小鼠胸腺與體重的比值以及脾臟與體重的比值均與陰性對照組無顯著差異（方差分析，P>0.05）。表明各濃度樣品不改變小鼠的免疫器官體重比值。

2.3 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

由實驗可知，各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力光密度差值較陰性對照組相比均無顯著性（方差分析，P>0.05）。但中、高劑量組小鼠左后足跖部厚度較陰性對照組顯著增加（q檢驗，P<0.05）。

表1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S）

表1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S）

注：q檢驗：與陰性對照（去離子水）比較，＊.P<0.05。

組別 動物數(shù)（只） 光密度差值 左后足跖部厚度差（mm）24小時陰性對照 10 0.475±0.041 0.32±0.10低劑量組 10 0.453±0.067 0.39±0.09中劑量組 10 0.451±0.081 0.46±0.17＊高劑量組 10 0.494±0.069 0.51±0.15＊P值 0.428 0.015

2.4 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠體液免疫功能的影響

由實驗可知，與陰性對照組比較，各劑量組小鼠溶血素抗體積數(shù)值、溶血空斑數(shù)均無顯著性（方差分析或秩和檢驗，P>0.05）。

2.5 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠單核－巨噬細(xì)胞功能的影響

為符合方差齊性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2對吞噬百分率的結(jié)果進(jìn)行變換。由試驗數(shù)據(jù)可知，與陰性對照組比較，在半體內(nèi)法實驗中，中、高劑量組的吞噬百分率和高劑量組吞噬指數(shù)均顯著升高（q檢驗，P<0.05）。在小鼠碳廓清實驗中，各劑量組的吞噬指數(shù)與陰性對照組相比，無顯著差異（方差分析，P>0.05）。

2.6 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

為符合方差齊性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2對NK細(xì)胞活性的結(jié)果進(jìn)行變換。結(jié)果顯示，較陰性對照組，各劑量組小鼠NK細(xì)胞活性無顯著差異（方差分析，P>0.05）。

表2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)的影響（±S）

表2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和小鼠碳廓清試驗吞噬指數(shù)的影響（±S）

注：q檢驗：與陰性對照（去離子水）比較，＊.P<0.05。

吞噬指數(shù)（碳廓清試驗）陰性對照 10 21.6±8.8 0.33±0.09 6.95±0.57低劑量組 10 21.4±3.8 0.30±0.06 6.85±0.85中劑量組 10 30.2±8.1＊ 0.42±0.10 6.86±0.95高劑量組 10 32.6±9.2＊ 0.51±0.18＊ 6.96±0.51 P值 0.003 0.002 0.980組別 動物數(shù)（只）吞噬百分率（%）吞噬指數(shù)（巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞）

總結(jié)與展望

人體免疫系統(tǒng)是由三道屏障組成的保護(hù)機(jī)體免受疾病原菌侵害的重要防御系統(tǒng)。身體抵御病原侵襲的第一道屏障是能有效阻止大多數(shù)細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒侵襲的皮膚和粘膜；第二道屏障由體液中的溶菌酶等殺菌物質(zhì)和具有吞噬、防衛(wèi)功能的細(xì)胞群體組成；第三道屏障抗體主要來源于免疫細(xì)胞。第一道屏障和第二道屏障是每個人與生俱來的，這是長期進(jìn)化產(chǎn)生的結(jié)果，可防御大多數(shù)入侵的病原微生物，這種保護(hù)性生理功能稱為非特異性免疫。第三道屏障是指體內(nèi)的T、B細(xì)胞在接受“非自身”的物質(zhì)侵入后，經(jīng)過感應(yīng)、反應(yīng)和效應(yīng)幾個不同的應(yīng)答階段，從而進(jìn)行抗原清除的一系列過程，這個過程又叫免疫特異性。人體免疫系統(tǒng)需要相互協(xié)調(diào)、相互配合，2種免疫方式缺一不可。研究表明，N-乙酰神經(jīng)氨酸可在黏膜表面與流感病毒、冠狀病毒等競爭性結(jié)合，減少病毒與黏膜上的受體結(jié)合，從而保護(hù)宿主細(xì)胞，增強(qiáng)黏膜防御系統(tǒng)。乳鐵蛋白可通過鐵依賴和鐵不依賴的機(jī)制與細(xì)菌競爭鐵營養(yǎng)，抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長達(dá)到廣譜抑菌作用；同時，乳鐵蛋白通過不同機(jī)制與病毒受體結(jié)合阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞?！疤禺愋钥贵w”通常被稱作“免疫球蛋白”，它們通過B細(xì)胞分化形成，具有特異性免疫功能，它們通過與抗原進(jìn)行特定反應(yīng)，來抵御疾病。免疫球蛋白IgG作為人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在血清及其他組織的分泌水平都較高，并具可進(jìn)行重復(fù)免疫應(yīng)答，且目前僅其可通過胎盤。

研究結(jié)果表明，不同劑量的復(fù)方濃縮乳清蛋白粉經(jīng)口給予小鼠30d，不會引起各組間小鼠體重增長差異，各組間小鼠脾臟與體重的比值以及胸腺與體重的比值也均無差異。在足跖增厚試驗中，中、高劑量組小鼠足跖厚度差值較陰性對照組顯著增高（P<0.05）。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗中，與陰性對照組相比，高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高（P<0.05）；中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率升高（P<0.05），表明復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠細(xì)胞免疫及單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能陽性。依據(jù)評價技術(shù)規(guī)范中增強(qiáng)免疫功能的評價規(guī)定：在體液免疫功能、細(xì)胞免疫功能、NK細(xì)胞活力、單核-巨噬細(xì)胞功能中，任意2項檢測結(jié)果為陽性，均可表明樣品具有此功能。因此，結(jié)論提示，復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對小鼠具有增強(qiáng)免疫力的功能，具備一定的開發(fā)的價值。