龍赤榮 張 露 彭 上 閔靜婷 李正紅

蚌埠醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤之一，是世界上第三大發(fā)病和第二大致命的癌癥[1］?；?、放療或手術(shù)是大多數(shù)癌癥患者的治療選擇[2］，然而，傳統(tǒng)療法沒有表現(xiàn)出很好的治療效果。嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）療法是目前有效的血液惡性腫瘤治療方式之一[3-5］，其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的療效已經(jīng)得到證實。然而，對于包括CRC在內(nèi)的實體腫瘤，由于缺乏腫瘤特異性抗原、靶向非腫瘤效應(yīng)、CAR-T對腫瘤的浸潤水平較低和免疫抑制腫瘤微環(huán)境的存在等因素，難以達(dá)到如同血液瘤那樣的治療效果。因此，了解近年來CAR-T療法在結(jié)腸癌方面的研究是非常重要的，為未來應(yīng)對結(jié)腸癌治療提供參考。

1 CAR-T細(xì)胞療法

1.1 CAR-T細(xì)胞療法的概述

Gross 等[6］最早提出嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的概念。CAR 包括1 個賦予抗原特異性的靶結(jié)合細(xì)胞外區(qū)域，包括單鏈抗體（single-chain Fv，ScFv）片段、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)，以及1 個主要通過CD3ζ 信號鏈介導(dǎo)T 細(xì)胞激活的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域[7-8］。

目前，CAR 的發(fā)展可分為4 代。已經(jīng)使用的初級刺激信號鏈，例如Fc受體γ鏈（Fc receptor gamma chain，F(xiàn)cεRIγ 鏈）、CD3 分子ζ 鏈（zeta chain of the CD3 molecule，CD3ζ）、DNAX 相關(guān)蛋白10（DNAXassociated protein 10，DAP10）、ζ 鏈 相 關(guān) 蛋 白-70（zata chain associated protein-70，ZAP70）、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte specific protein tyrosine kinase，LCK）和Src 家族酪氨酸激酶（src family tyrosine kinases，F(xiàn)YN），它們是第1 代CAR[9］。第2 代在胞內(nèi)區(qū)域有1 個共刺激域，如CD28 分子、CD137 分子等。這些結(jié)構(gòu)域加強(qiáng)了CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、細(xì)胞毒性、持續(xù)反應(yīng)和持久性。在第3代中，CAR受體包含2個共刺激域，以增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗腫瘤作用[10］。在第4代中，將CAR 與細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）等結(jié)合在一起[11］。這一代能夠增加T 細(xì)胞的活化，招募和激活腫瘤的內(nèi)源性固有免疫細(xì)胞，改變腫瘤微環(huán)境并增加T 細(xì)胞持久性[12］。

1.2 CAR-T細(xì)胞療法的作用機(jī)制及優(yōu)勢

當(dāng)單鏈抗體與抗原結(jié)合時，CAR-T細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域啟動細(xì)胞破壞機(jī)制。CAR-T 細(xì)胞通過3條主要途徑使腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡[13］：（1）快速反應(yīng)釋放穿孔素和顆粒酶，是腫瘤細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[14］。當(dāng)激活的CAR-T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的刺激下，會釋放出含有穿孔素的細(xì)胞毒性顆粒，這些顆粒能夠溶解腫瘤細(xì)胞并使腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡；（2）動作緩慢的Fas-FasL 途徑，F(xiàn)asL 在CAR-T 細(xì)胞高表達(dá)，而Fas 在腫瘤細(xì)胞表達(dá)，F(xiàn)asL 與Fas 相互識別后，活化了它們之間連接的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡；（3）細(xì)胞因子，活化的CAR-T產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，起到抗腫瘤的作用。由于先天免疫的激活，這些細(xì)胞因子的激活將觸發(fā)CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤[15］。

CAR-T 細(xì)胞是在T 細(xì)胞的基礎(chǔ)上改造而成的，T 細(xì)胞是人體內(nèi)消滅腫瘤細(xì)胞的主力軍。具體而言，從患者自己的血液或健康提供者的血液中獲取的T細(xì)胞，通過基因工程技術(shù)，使T細(xì)胞表達(dá)腫瘤特異性識別的CAR，將抗原抗體結(jié)合機(jī)制和T 細(xì)胞的殺傷作用結(jié)合，從而讓患者具有抗腫瘤的能力[16］。CAR-T 細(xì)胞療法在抗腫瘤活性方面顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢。作為一種以主要組織相容性復(fù)合體抑制的方式引導(dǎo)T 細(xì)胞特異性的方法，它最近被應(yīng)用于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)在自然反應(yīng)失敗時對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)[17］。CAR-T表達(dá)工程受體和嵌合結(jié)構(gòu)，以主要組織相容性復(fù)合體獨立的方式識別癌抗原，并能對其產(chǎn)生特異性反應(yīng)[18］。

1.3 CAR-T療法的局限性

使用CAR-T 細(xì)胞也存在一些局限性。（1）細(xì)胞因子釋放綜合征。在接受CD19 CAR-T細(xì)胞治療的患者中，在輸注后的第1 周，發(fā)生了細(xì)胞因子釋放綜合征[19］。這種效應(yīng)是CAR-T 細(xì)胞在受到刺激后引起過度激活的免疫反應(yīng)的結(jié)果，它與給藥劑量無關(guān)，而是與治療反應(yīng)和腫瘤負(fù)擔(dān)相關(guān)[20］。（2）神經(jīng)毒性。腦病患者在輸注CD19 CAR-T 細(xì)胞治療后的5 ～ 7 d，可能會出現(xiàn)定向障礙、局部神經(jīng)功能缺損和癲癇發(fā)作[21］。但神經(jīng)毒性僅在靶向CD19 和CD20的CAR-T細(xì)胞治療中被報道，到目前為止，沒有證據(jù)表明其在實體腫瘤治療中產(chǎn)生神經(jīng)毒性。（3）靶向非腫瘤效應(yīng)。這是指CAR-T細(xì)胞可以被表達(dá)靶向抗原的正常組織激活，從而破壞非腫瘤細(xì)胞。如CD19在B 細(xì)胞中廣泛表達(dá)[22］，使用CD19靶向CAR-T細(xì)胞不僅會破壞CD19+的腫瘤細(xì)胞，還會破壞正常的B 細(xì)胞，從而導(dǎo)致B 細(xì)胞再生障礙[23］。（4）CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量。生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞需要大量T 細(xì)胞的供應(yīng)。不幸的是，CAR-T 細(xì)胞目前僅被批準(zhǔn)用于血液惡性腫瘤，而一些患者缺乏足夠數(shù)量的T 細(xì)胞來制造CAR-T。此外，許多患者之前接受過化療，導(dǎo)致CAR-T 細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量較低[24］。

2 CAR-T治療CRC的靶點

CAR-T 細(xì)胞治療癌癥的一個關(guān)鍵問題是識別特定于每種癌癥類型的靶抗原。在腫瘤細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）過度表達(dá)，這些TAA很容易識別，并且被許多患者共享，但是使用CAR-T細(xì)胞靶向TAA，可能會由于其低特異性而產(chǎn)生副作用。對于TAA，CAR-T細(xì)胞治療CRC常見的靶點有癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、腫瘤相關(guān)糖蛋白-72（tumor-associated glycoprotein-72，TAG-72）和鳥苷酸環(huán)化酶C（guanylate cyclase C，GUCY2C）。

CEA在98.8%的CRC組織中過表達(dá)，它不僅可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，同時也是一種有希望的CRC治療的新靶點[25］。

HER-2 常與人表皮生長因子受體-3（human epidermal growth factor receptor-3，HER-3）組成異源二聚體，通過與配體結(jié)合被激活[26］。研究表明，HER-2 過表達(dá)約占所有CRC 的2%，其過表達(dá)通常由基因擴(kuò)增引起，HER-2可能成為CRC靶向治療的潛在預(yù)測生物標(biāo)志物[27］。

TAG-72在大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，與正常黏膜相比，80%的CRC中TAG-72過表達(dá)，CRC患者血清中發(fā)現(xiàn)TAG-72 表達(dá)升高[28］。關(guān)于靶向TAG-72的CAR-T細(xì)胞治療CRC的研究中結(jié)果證明了CART細(xì)胞的相對安全性[29］。

GUCY2C 屬于黏膜環(huán)化酶受體家族，GUCY2C在近95%的CRC中過度表達(dá)，該受體催化三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），觸 發(fā)cGMP 相關(guān)信號通路的激活，從而調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程，如上皮細(xì)胞增殖、分化和凋亡[30］。信號軸的失調(diào)將會出現(xiàn)炎癥性腸病和腸道運(yùn)輸障礙，并促進(jìn)癌癥的發(fā)展。在腫瘤發(fā)生的早期階段，GUCY2C 結(jié)合配體的丟失，導(dǎo)致信號通路沉默并促進(jìn)腸道轉(zhuǎn)化[31］。

除了以上靶點，CAR-T細(xì)胞治療CRC的靶點還有上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）、造血干細(xì)胞抗原CD133和細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）等，這些靶點都有可能成為CAR-T治療的選擇。

3 CAR-T細(xì)胞療法的應(yīng)用

3.1 臨床前研究

體外研究結(jié)果顯示，靶向不同CRC 抗原的CAR-T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)已被證明針對多種人類CRC 細(xì)胞系，包括LoVo、SW620、HT-29 和DLD-1等。Zhang 等[32］研究表明，針對特定類型的CAR-T細(xì)胞，每個細(xì)胞系表達(dá)不同的抗原與不同的抗原密度將影響抗腫瘤的效果。

Ang 等[33］于2017 年發(fā)表了在異種移植模型方面的第1項臨床前研究，重點研究了EpCAM靶向的CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。該研究表明，通過信使RNA（messenger RNA，mRNA）電穿孔產(chǎn)生的抗EpCAM CAR-T 細(xì)胞的多次重復(fù)輸注延緩了攜帶CRC 異種移植物的免疫缺陷小鼠的疾病進(jìn)展。此外，關(guān)于結(jié)腸癌患者來源的異種移植小鼠模型，已經(jīng)被證明反映了患者的臨床和分子異質(zhì)性，并重建了腫瘤免疫抑制微環(huán)境[34］，并被用于抗CRC CAR-T細(xì)胞的2個臨床前研究。其中1種在使用以間皮素（mesothelin，MSLN）為靶點的第3代CAR-T治療后，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，并且在給藥后至少10 d細(xì)胞持續(xù)存在[35］。另1 項研究表明，HER-2 CAR-T細(xì)胞能夠在CRC 人來源腫瘤異種移植于免疫缺陷小鼠模型中誘導(dǎo)腫瘤消退甚至消除，并保護(hù)治療動物免受腫瘤再次攻擊[36］。

作為CAR-T 細(xì)胞治療CRC 研究最多靶點之一的CEA，靶向CEA 的第2代CAR-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)均顯示出良好的抗腫瘤效果，當(dāng)與IL-12結(jié)合時，抗腫瘤效果增強(qiáng)[37］。

由于在臨床前研究中獲得了有希望的結(jié)果，許多CAR-T 細(xì)胞治療CRC 已經(jīng)在臨床試驗中進(jìn)行了抗腫瘤療效和安全性評估。

3.2 臨床試驗

在臨床試驗中，CAR-T療法在癌癥方面的應(yīng)用逐漸增加，提供了許多臨床證據(jù)。尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得良好的效果。美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）在2017年至2021年間批準(zhǔn)上市的靶向CD19的CAR-T細(xì)胞療法共有4 種[38-39］，分別是Kymriah、Yescarta、Tecartus 和Breyanzi，它們被用于治療B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。

關(guān)于CRC，一些針對各種腫瘤抗原的臨床試驗已被批準(zhǔn)。在2014年，開始了第1個CRC的CAR-T臨床試驗（NCT02349724），研究第2 代CEA CAR-T細(xì)胞在CRC 患者中的安全性和有效性。在接受CAR-T細(xì)胞后，觀察到10例先前接受治療的進(jìn)行性疾病患者中有7 例病情穩(wěn)定，2 例病情持續(xù)超過30 周，并顯示腫瘤縮小。此外，大多數(shù)患者的血清CEA 水平降低。關(guān)于安全性，發(fā)熱被認(rèn)為是與CAR-T 細(xì)胞輸注相關(guān)的最重要事件。10 例接受治療的患者中有2例在CAR-T細(xì)胞治療后數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)高熱（39 ～ 40 ℃），并且在細(xì)胞注射后的1 ～ 4 d內(nèi)再次出現(xiàn)高燒。同樣類型的抗CEA CAR-T 細(xì)胞已經(jīng)在CEA 陽性腺癌伴肝轉(zhuǎn)移患者中進(jìn)行了研究（NCT02416466 和NCT02850536 試驗），通過肝動脈灌注來改善CAR-T 細(xì)胞向肝轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)。在NCT02416466 試驗中，所有患者中觀察到不同的癥狀，但是這些患者均未出現(xiàn)與CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件[40］。在NCT02850536試驗中，通過使用壓力驅(qū)動的藥物輸送系統(tǒng)，該裝置旨在克服腫瘤內(nèi)壓力，將CAR-T 細(xì)胞向肝轉(zhuǎn)移的輸送提高5.2倍，研究者報道了1名患者的治療情況，顯示總生存期增加和完全代謝反應(yīng)，與之前的試驗一樣，CAR-T輸注與任何嚴(yán)重不良事件無關(guān)[41］。

4 展 望

CAR-T 細(xì)胞免疫療法是一種非常有前途的腫瘤治療方法，特別是對B細(xì)胞等血液惡性腫瘤的治療。CAR-T 細(xì)胞在治療CRC 的臨床研究中取得了較好的療效，未來的CAR-T 細(xì)胞治療的方向是研究個性化的CAR-T 細(xì)胞治療產(chǎn)品。由于患者具有個體差異性，在使用CAR-T 細(xì)胞免疫療法治療腫瘤時，CAR-T細(xì)胞的劑量和輸液方式以及合適的治療方案是需要進(jìn)一步探討的問題。此外，通過改變和優(yōu)化CAR-T 自身的結(jié)構(gòu)，尋找合適的腫瘤特異性抗原等策略，可使CAR-T 細(xì)胞達(dá)到精準(zhǔn)靶向殺傷腫瘤的目的。相信未來的CAR-T 細(xì)胞免疫療法在治療CRC 方面將邁出新的步伐，其在臨床實踐的應(yīng)用將會達(dá)到更加高效和安全的水平，最終將會延長CRC 患者的生命和提高患者的生存質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突