呂甫晉 孔大慶 屈敬之 劉熙瑾 李曉玉 潘國軍

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016

泰山白首烏（cynanchum bungeidecne）為“泰山四大名藥”之首，具有養(yǎng)血益肝、固精益腎及抗衰老等作用[1］。白首烏生長過程中，根系會(huì)對根際土壤微生物產(chǎn)生重要影響[2］，其次級代謝產(chǎn)物具有顯著的藥理活性。

吲哚是重要的含氮化合物，許多天然化合物和合成藥物的結(jié)構(gòu)中都包含有這類雜環(huán)骨架[3］。吲哚生物堿天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，研究發(fā)現(xiàn)其具有降脂、抗糖尿病、抗癌、抗菌等多種生物活性，是開發(fā)新型藥物的重要來源[4-9］。萜類天然產(chǎn)物生物活性顯著，是許多藥用植物的活性成分，并為創(chuàng)新藥物研發(fā)提供了大量重要源頭分子或先導(dǎo)化合物，其中許多化合物或其衍生物已被開發(fā)成藥物[10］。萜類化合物往往結(jié)構(gòu)復(fù)雜、手性中心較多，利用化學(xué)合成方法工業(yè)化生產(chǎn)比較困難，因此需要解決萜類化合物來源及高效、低毒新型抗菌先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)問題[11］。

本研究從泰山白首烏中篩選獲得的根際真菌，選擇最適培養(yǎng)條件，批量發(fā)酵獲得次級代謝產(chǎn)物，分離鑒定單體化合物結(jié)構(gòu)并評價(jià)其生物活性，為新型抗菌藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 白首烏根際土壤樣品于2021年10 月13 日采自山東省泰安市的泰山（36°19′120.84′′N，117°13′40.53.54′′E），地下5～20 cm白首烏根莖表面土壤。

1.1.2 分離培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基；孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 真菌Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基、真菌Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基、真菌Ⅲ號(hào)培養(yǎng)基、真菌Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基、ISP2培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）。

1.1.4 分析培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)菌株 抑菌活性實(shí)驗(yàn)采用2 種敏感菌株：金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureusATCC33591）、大腸桿菌（Escherichia coliATCC25922）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理與菌株的分離純化 無菌條件下，配置泰山白首烏根際土壤懸液（1.0 g/L），并通過倍數(shù)稀釋法稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的濃度，各取100 μL分別涂布于PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基，于28 ℃倒置培養(yǎng)2～7 d，通過平板劃線法分離直至獲得單菌落。

1.2.2 篩選活性菌株 對分離得到的單菌落進(jìn)行大米培養(yǎng)基固體發(fā)酵25 d，等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得粗浸膏，并配置成1.0 g/L甲醇溶液。采用藥敏紙片法檢測次級代謝產(chǎn)物粗提物（10 μL）的抑菌活性：選用敏感菌株大腸桿菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，陽性對照藥為環(huán)丙沙星（0.1 g·L-1），倒置于27 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后觀察并測量抑菌圈大小。通過篩選獲得具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性的4株菌株（抑菌圈直徑 ＞ 5 mm），見表1。

并通過篩選不同類型培養(yǎng)基（圖1），富集次級代謝產(chǎn)物后，分析次級代謝產(chǎn)物化學(xué)豐富度，最終確定發(fā)酵菌株為XYR-9，最終發(fā)酵條件為大米培養(yǎng)基28 ℃靜置發(fā)酵。

圖1 Penicillium sp. XYR-9在不同培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)

1.2.3 菌株發(fā)酵與粗提物的富集 無菌條件下，挑取單菌落至PDB培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)3 d；隨后按1%接種量，接種至大米固體培養(yǎng)基80 g （共發(fā)酵20 瓶），28 ℃靜置發(fā)酵30 d；發(fā)酵結(jié)束用100 mL 乙酸乙酯浸泡菌絲體過夜，重復(fù)3次后合并濾液，減壓濃縮獲得粗提物。

1.2.4 單體化合物分離純化 采用不同極性的石油醚∶乙酸乙酯（V/V） 10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0∶1各800 mL，獲得不同極性段組分，通過薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）和高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜分析，合并相同的組分，獲得5 個(gè)組分F1 ～ F5。其中，組分F3、F4 和F5 利用甲醇∶水（V/V）70%、80%、90%、95%、100%各500 mL 進(jìn)行洗脫，獲得亞組分F3.1-F3.4、F4.1-F4.3 和F5.1-F5.6。采用半制備高效液相甲醇∶水（V/V）90%等度洗脫，通過分離純化亞組分F3.3 得到化合物1（28 mg，tR= 12.450 min）；分離純化亞組分F3.4后得到化合物2（20 mg，tR= 15.500 min）；分離純化亞組分F4.2后得到化合物3（21 mg，tR= 6.450 min）；分離純化亞組分F3.2后得到化合物4 （21 mg，tR= 8.650 min）；分離純化亞組分F6.1后得到化合物5（21 mg，tR= 6.600 min）。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的鑒定

通過真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）保守序列擴(kuò)增，對Penicilliumsp. XYR-9菌株進(jìn)行了分析鑒定。根據(jù)測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對，搜索同源系列，選取有代表性菌株序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），XYR-9菌株與Penicilliumfructuariae同源性較高，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)（圖3）分析，XYR-9鑒定為青霉素屬真菌。

圖2 根據(jù)XYR-9序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 4株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用的菌株形態(tài)照片

2.2 活性代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

化 合 物1 ～ 5 經(jīng) 核磁 共振（1H-NMR 和13CNMR）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）等進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

化合物1：淡黃色固體，ESIMS m/z 421.29 [M+H］+。其13C NMR 和1H NMR 譜圖預(yù)測結(jié)構(gòu)中具有1個(gè) 吲 哚 環(huán)（δ 150.86， 139.98， 130.25， 127.92，125.00，120.42， 119.54， 118.39， 111.45）（表2），5個(gè)甲基、8個(gè)芳香或雙鍵碳（包括4個(gè)次甲基和4個(gè)季碳）和1 個(gè)醇羥基?；衔? 被鑒定為paspaline 3[12］。

表2 化合物1 ～ 5 13C NMR（100 MHz）在CDCl3中的數(shù)據(jù)

化合物2：淡黃色固體，ESIMS m/z 569.35 [M+H］+。根據(jù)13C 和1H NMR 譜圖分析其同樣含有吲哚環(huán)，同時(shí)具有二萜結(jié)構(gòu)（δ 129.75， 129.39， 129.32，129.00， 125.09， 125.02， 24.55， 24.46， 22.43，20.91， 16.91， 16.58）（表2），8 個(gè)甲基、10 個(gè)芳香或雙鍵碳（包括3 個(gè)次甲基和7 個(gè)季碳）和1 個(gè)醇羥基。化合物1被鑒定為shearinine F[13］。

化合物3：淡黃色固體，ESIMS m/z 421.26 [M+H］+。與化合物1的紫外吸收譜圖非常相似，提示它們?yōu)橄嗨苹衔铩Ｆ?3C 和1H NMR 譜圖顯示有一個(gè)雙鍵碳（δ 121.31）（表2）?；衔? 被鑒定為PC-M6-2[14］。

化合物4：淡黃色固體，ESIMS m/z 584.34 [M+H］+。根據(jù)13C和1H NMR譜圖分析其同樣含有吲哚環(huán)，具有1 個(gè)酮羰基、7 個(gè)甲基、12 個(gè)芳香或雙鍵碳（包括3 個(gè)次甲基和9 個(gè)季碳）和1 個(gè)醇羥基?；衔?被鑒定為shearinines D[13］。

化合物5：淡黃色固體，ESIMS m/z 420.25 [M+H］+。與化合物1和3的紫外吸收譜圖非常相似，提示它們?yōu)橄嗨苹衔?。對?H NMR譜圖發(fā)現(xiàn)化合物5 中羥基被氧化為羰基。化合物5 被鑒定為13-desoxypaxilline[15］?；衔? ～ 5的結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 化合物1 ～ 5的結(jié)構(gòu)

2.3 化合物的抗菌活性評價(jià)

對化合物1 ～ 5進(jìn)行抗菌活性評價(jià)，指示菌株為大腸桿菌（E. coliATCC25922）和金黃色葡萄球菌（S. aureusATCC33591），陽性對照藥為環(huán)丙沙星（0.1 g·L-1）[16］。結(jié)果顯示，化合物1 ～ 5對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC 值如表3所示。

表3 5種化合物抗菌活性評價(jià)

3 討 論

本研究從泰山白首烏中篩選獲得次級代謝產(chǎn)物化學(xué)豐富度高的根際真菌，鑒定并命名為Penicillium sp. XYR-9。通過選擇最適培養(yǎng)條件，確定大米培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，綜合利用正/反相硅膠柱層析、半制備高效液相色譜和波譜檢測，分離鑒定5 個(gè)吲哚二萜類化合物，通過波譜檢測闡明并確定其結(jié)構(gòu)為已知化合物paspaline 3、shearinine F、PC-M6-2、shearinines D 和13-desoxypaxilline[17］。在抗菌活性評價(jià)中化合物1、3和5對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均有一定的抑菌活性，從結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，縮酮基團(tuán)的存在對抗菌活性具有不利影響。

由此可見，泰山白首烏根際真菌具有豐富的新型活性天然產(chǎn)物。從中發(fā)現(xiàn)的吲哚二萜類等活性天然產(chǎn)物，可為新型治療藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)提供新的研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突