官月嬋，馬鑫宇，肖紅劍，王東寶，王學(xué)付，李嬌春，譚銀珍，李智華，寸韡

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

破傷風(fēng)（tetanus）是破傷風(fēng)梭菌經(jīng)由皮膚或黏膜傷口侵入人體，在缺氧環(huán)境下生長繁殖，產(chǎn)生破傷風(fēng)神經(jīng)毒素（tetanus neurotoxin，TT）而引起肌痙攣的一種特異性感染。TT 主要侵襲神經(jīng)系統(tǒng)中的運動神經(jīng)元［1-2］。破傷風(fēng)是一種急性、致命性傳染病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，病死率高達40%［3］。

經(jīng)典的破傷風(fēng)疫苗是由TT 經(jīng)甲醛滅活后獲得無毒性的TT 制備，破傷風(fēng)梭菌可形成抵抗力強大的芽孢，且TT 毒力較強，制備工藝較為嚴苛，同時甲醛處理類毒素還容易形成環(huán)境污染，因此現(xiàn)有工藝具有進一步改進的空間。

通過基因重組的方式表達突變的無毒性毒素蛋白或毒素片段，可省卻復(fù)雜的滅活過程，同時保留毒素蛋白的免疫原性。TT 由1 條相對分子質(zhì)量約150 000 的單一多肽鏈構(gòu)成，隨后多肽鏈可被切成2 條由單一二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成AB 型毒素，輕鏈具有蛋白酶功能，而重鏈負責(zé)受體結(jié)合，單獨的2 條肽鏈均無毒性，但其作為抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可有效中和TT。前期實驗結(jié)果顯示，TT 重鏈片段C（tetanus toxin heavy chain C-fragment，TTHc）相對分子質(zhì)量約50 000，負責(zé)神經(jīng)痙攣結(jié)合和逆行傳輸［4-5］，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表達量較高，具有誘導(dǎo)抗毒素中和抗體的能力［6］。因此，重組亞單位疫苗成為一種更加安全有效的替代疫苗。TTHc 保留了許多特性［4，7］，是開發(fā)破傷風(fēng)人用疫苗的一個很有前途的候選分子。

為了篩選高效表達重組TTHc（rTTHc）的原核表達系統(tǒng)，使目的蛋白在大腸埃希菌中獲得高表達的可溶性產(chǎn)物，本研究采用3種原核表達載體在不同溫度條件下對rTTHc 進行了表達，以表達量及可溶性為檢測指標(biāo)，確定最適表達載體及其最佳誘導(dǎo)條件。

1 材料與方法

1.1菌株、載體及基因 感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；pET30a、pBV220、pColdⅡ載體保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所寸韡實驗室；密碼子優(yōu)化后的rTTHc基因片段（1 359 bp）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ等購自NEB（北京）公司；T4 DNA 連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；2×GoldStar Best Master Mix（Dye）購自北京康為世紀科技有限公司；通用性DNA 純化試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；Biosafer 細胞破碎機購自賽飛（中國）有限公司；AKTAexplorer 100 蛋白分析儀購自美國GE 公司；HPLC色譜儀購自安捷倫科技有限公司；G3000SWXL 色譜柱購自日本TOSOH。

1.3重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 以rTTHc基因合成片段為模板，按照2×GoldStar Best Master Mix（Dye）標(biāo)準(zhǔn)條件進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pET30a載體經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切處理后，將基因片段和載體經(jīng)T4 DNA 連接酶16 ℃水浴連接10 h，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET30a-rTTHc。以rTTHc基因合成片段為模板，按照2×GoldStar Best Master Mix（Dye）標(biāo)準(zhǔn)條件進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物和pBV220 載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切處理后，將基因片段和載體經(jīng)T4 DNA 連接酶16 ℃水浴連接10 h，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pBV220-rTTHc。以rTTHc基因合成片段為模板，按照2×Gold-Star Best Master Mix（Dye）標(biāo)準(zhǔn)條件進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物和pColdⅡ載體經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切處理后，將基因片段和載體經(jīng)T4 DNA 連接酶16 ℃水浴連接10 h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-rTTHc。將3 種表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37 ℃平板培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，pET30a-rTTHc和pCold-rTTHc進行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，pBV220-rTTHc進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

1.4.1培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，調(diào)pH為7.0后定容到1 L，經(jīng)121 ℃，20 min高壓滅菌后使用。質(zhì)粒pBV220-rTTHc和pColdrTTHc所用培養(yǎng)基加入氨芐青霉素至100 μg／mL，質(zhì)粒pET30a-rTTHc所用培養(yǎng)基加入卡那霉素至50 μg／mL。

1.4.2質(zhì)粒pET30a-rTTHc的表達 將pET30a-rTTHc甘油菌以劃線的方式涂布LB 固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落至3 mL LB 培養(yǎng)基（含卡那霉素100 mg／mL）管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h；按1%接種量接種至30 mL LB 培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至A600達0.4 ～0. 6 時，加入2 mg／mL IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h；收集菌液，13 500 ×g離心2 min，棄上清，每1 mL 沉淀中加入1 mL PBS緩沖液重懸，冰浴條件下超聲破碎菌體，至菌懸液澄清；將超聲后裂解液13 500×g離心5 min，收集上清，保存至新的離心管中，再用PBS 緩沖液洗滌沉淀2 次，每1 mL 沉淀以0. 5 mL PBS 緩沖液重懸。收集未誘導(dǎo)全菌蛋白以及誘導(dǎo)后全菌蛋白、誘導(dǎo)后全菌液超聲后上清和沉淀，分別進行非還原10%SDS-PAGE分析。

1.4.3質(zhì)粒pBV220-rTTHc的表達 挑取單菌落接種至LB 培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50 mg／mL），無需IPTG誘導(dǎo)表達，直接升溫至42 ℃，誘導(dǎo)4 h。具體步驟同1.4.2項。

1.4.4質(zhì)粒pCold-rTTHc的表達 挑取單菌落接種至LB 培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50 mg／mL），A600達0. 4 ～0. 6 時，15 ℃靜置30 min 后再加入2 mg／mL IPTG，隨后振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，誘導(dǎo)溫度為15 ℃。具體步驟同1.4.2項。

1. 5質(zhì)粒pET30a-rTTHc誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化 在其他條件不變的情況下，將誘導(dǎo)溫度從37 ℃降至28 ℃誘導(dǎo)4 h。具體步驟同1.4.2項。

1.6目的蛋白的純化 收集28 ℃2 mg／mL IPTG誘導(dǎo)表達4 h的pET30a-rTTHc菌液1 L，經(jīng)13 500×g離心5 min，棄上清，PBS 重懸菌體沉淀，用ATS 細胞專用破碎機以55 Mpa壓力將菌液破碎3次，再經(jīng)9 000×g離心20 min，收集上清，用AKTAexplorer 100 蛋白分析儀進行純化，純化產(chǎn)物進行非還原10%SDS-PAGE及HPLC分析。

2 結(jié)果

2.1rTTHc基因片段的鑒定 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 365 bp 的目的基因片段，見圖1。

圖1 rTTHc基因片段PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR product of rTTHc gene fragment

2.2重組質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒pET30a-rTTHc的雙酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見5 230 bp的載體片段和1 404 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果與設(shè)計的目標(biāo)序列完全一致，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒pBV220-rTTHc的雙酶切（EcoRⅠ／BamHⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見3 656 bp 的載體片段和1 365 bp的目的基因片段，大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果與設(shè)計的目標(biāo)序列完全一致，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒pCold-rTTHc的雙酶切（NdeⅠ／XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見5 341 bp 的載體片段和1 391 bp 的目的基因片段，大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果與設(shè)計的目標(biāo)序列完全一致，表明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖2和圖3。

圖2 質(zhì)粒pET30a-rTTHc（A）、pBV220-rTTHc（B）和pColdrTTHc（C）的雙酶切鑒定Fig.2RestrictionmapofrecombinantplasmidspET30a-rTTHc（A），pBV220-rTTHc（B）and pCold-rTTHc（C）

圖3 質(zhì)粒pET30a-rTTHc（A）、pBV220-rTTHc（B）和pColdrTTHc（C）構(gòu)建圖譜示意圖Fig. 3 Construction of plasmids pET30a-rTTHc（A），pBV220-rTTHc（B）and pCold-rTTHc（C）

2. 3rTTHc蛋白表達產(chǎn)物的鑒定 10%SDS-PAGE分析顯示，質(zhì)粒pET30a-rTTHc和pBV220-rTTHc在IPTG誘導(dǎo)后4 h 即可達到表達峰值，而pCold-rTTHc在IPTG誘導(dǎo)后8 h才達到表達峰值。見圖4。

圖4 rTTHc蛋白表達的SDS-PAGE鑒定Fig.4 SDS-PAGE profile of expressed rTTHc

2.4rTTHc蛋白的可溶性表達分析 10%SDS-PAGE分析顯示，pET30a-rTTHc誘導(dǎo)4 h 和pCold-rTTHc誘導(dǎo)8 h 后表達的目的蛋白大部分存在于菌裂解液上清中，少量存在于沉淀中，但pET30a-rTTHc的可溶性表達量略低于pCold-rTTHc；pBV220-rTTHc誘導(dǎo)4 h后表達的目的蛋白量較少，可溶性也較低。見圖5和圖6。

圖5 rTTHc蛋白可溶性表達的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of solubility of rTTHc by SDS-PAGE

圖6 rTTHc蛋白可溶性表達的比較Fig.6 Comparison of soluble expression of rTTHc protein

2. 5質(zhì)粒pET30a-rTTHc的最佳誘導(dǎo)表達條件 10%SDS-PAGE 分析顯示，在蛋白表達量保持不變的情況下，28 ℃誘導(dǎo)的可溶性表達較37 ℃有所提高。見圖7和圖8。

圖7 兩種溫度條件下rTTHc蛋白可溶性表達的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE profile of rTTHc protein expressed in a soluble form at two temperatures

圖8 兩種溫度條件下rTTHc蛋白可溶性表達的比較Fig. 8 Comparison of soluble expression of rTTHc protein at two temperatures

2.6純化的rTTHc蛋白的純度 10%SDS-PAGE分析顯示，rTTHc 蛋白條帶單一，純度較好，見圖9；經(jīng)HPLC 分析其純度可達97%，見圖10。表明該誘導(dǎo)條件可用于后續(xù)實驗。

圖9 純化后rTTHc蛋白的SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE profile of purified rTTHc protein

圖10 純化后rTTHc蛋白的HPLC色譜圖Fig.10 HPLC profile of purified rTTHc protein

3 討論

TT 作為致死率極高的一種細菌蛋白質(zhì)，其中和性抗體及疫苗研發(fā)一直備受關(guān)注。雖然TT 在其中和毒性作用及主動免疫中有較好表現(xiàn)［8］，但其脫毒工藝復(fù)雜，使用實驗動物制備中和性抗體具有多種不穩(wěn)定性，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)［9-10］，且破傷風(fēng)梭菌制備TT 的培養(yǎng)條件苛刻［11］，對廠房要求較高，增加了疫苗生產(chǎn)成本，因此，需要研發(fā)更優(yōu)的疫苗種類及其制備方式［12-13］。TT 由相對分子質(zhì)量約150 000 的3 個片段組成，C-端結(jié)構(gòu)域是TT與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合部位，是具有重要功能的活性部位［14］。TT 的C 端結(jié)構(gòu)域不僅具有較高的免疫原性，安全性也較好，并且TT可被針對C-端的單抗中和，因此，rTTHc 蛋白的表達及免疫效果可為基因工程疫苗的研發(fā)提供參考［15-16］。1980 年，白喉類毒素共價結(jié)合b 型流感桿菌莢膜多糖（Hib）的疫苗就取得了可觀的免疫效果［17］。因此rTTHc也可作為結(jié)合疫苗的載體蛋白使用［18］。

本研究將rTTHc片段基因克隆至3 種不同載體上，成功構(gòu)建了不同溫度條件下誘導(dǎo)表達的原核表達載體，最終獲得較多的可溶性表達，以利于純化及后期的免疫實驗。本文對不同條件下的原核表達進行了優(yōu)化，以期找到最合適的表達系統(tǒng)。結(jié)果顯示，不同的載體表達效果也不同。對于pBV220 這類啟動子的工程菌，熱誘導(dǎo)程序?qū)μ岣咄庠吹鞍椎谋磉_至關(guān)重要［19］，適合用于大規(guī)模表達。但其與pET30a和pColdⅡ載體相比，在rTTHc 蛋白的表達上不具優(yōu)勢。pColdⅡ是一種冷休克表達載體，帶有大腸埃希菌冷休克基因CspA 啟動子序列，并在CspA 啟動子下游插入了乳糖操縱子lac operator，可嚴格調(diào)控目的基因表達。15 ℃低溫誘導(dǎo)使大腸埃希菌自身的蛋白質(zhì)合成受到抑制，從而使目的蛋白獲得高效表達。本實驗中，pCold-rTTHc在表達量上與pET30a-rTTHc相當(dāng)，但可溶性表達上略高于pET30a-rTTHc，而pColdrTTHc需在低溫表達且表達飽和時間較長，因此不太適于大量基因工程產(chǎn)品的生產(chǎn)需求。

pET30a-rTTHc在所有表達載體中的表達量和表達效率均較高，但可溶性表達略低于pCold-rTTHc。高可溶性蛋白利于高效純化和生產(chǎn)，pColdⅡ使rTTHc蛋白高可溶性表達的優(yōu)勢可能在于蛋白低溫時的緩慢釋放。因此，本研究將pET30a-rTTHc在28 ℃室溫進行誘導(dǎo)表達，結(jié)果顯示，該誘導(dǎo)溫度下，不僅保留了蛋白表達量，還提高了蛋白的可溶性表達。

綜上所述，pET30a-rTTHc室溫28 ℃2 mg／mL IPTG 表達系統(tǒng)是表達rTTHc 蛋白的最優(yōu)選擇，也適用于工業(yè)化的大批量蛋白表達及疫苗生產(chǎn)的需要。