崔靖，王靖宇，韋薇

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

近年來嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimericantigen receptor T-cell，CAR-T）產(chǎn)品在腫瘤治療領(lǐng)域呈現(xiàn)較突出的優(yōu)勢，且已經(jīng)成為細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域商業(yè)化進(jìn)展較為快速的一類產(chǎn)品。截至2023 年7 月，全球共有9個(gè)CAR-T產(chǎn)品獲批上市，其中國外批準(zhǔn)上市的6個(gè)CAR-T產(chǎn)品包括：NovartisPharmaceuticals Corporation 的Kymriah［1］、Kite Pharma 的Yescarta［1］、Kite Pharma的Tecartus［1］、Bristol-Myers Squibb Company的Breyanzi［1］、Celgene Corporation／Bristol-Myers Squibb Company 的Abecma［1］、傳奇生物的Carvykti［2］。國內(nèi)批準(zhǔn)上市的3 個(gè)CAR-T 產(chǎn)品包括：復(fù)星凱特生物科技有限公司的阿基侖賽注射液（奕凱達(dá)）［3］、藥明巨諾生物科技有限公司的瑞基奧侖賽注射液（倍諾達(dá)）［4］、南京馴鹿生物醫(yī)藥有限公司的伊基奧侖賽注射液（?？商K）。另外，國內(nèi)目前還有多個(gè)CAR-T 產(chǎn)品在上市審評中。

CAR-T 是不同于傳統(tǒng)小分子和成熟生物制品的一類個(gè)體化細(xì)胞治療產(chǎn)品，有效成分為經(jīng)過體外基因修飾／編輯的活細(xì)胞，其生產(chǎn)工藝較復(fù)雜，生產(chǎn)設(shè)備自動(dòng)化水平有限，生產(chǎn)過程中諸多環(huán)節(jié)可能存在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，且其無法采用終端滅菌或除菌過濾實(shí)現(xiàn)無菌保障。目前CAR-T產(chǎn)品的微生物安全主要通過對生產(chǎn)用原材料的檢測和控制、生產(chǎn)過程嚴(yán)格按照《生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關(guān)要求以及對工藝中間體和／或終產(chǎn)品進(jìn)行微生物檢測予以保證。無菌檢查作為微生物安全的一個(gè)質(zhì)量項(xiàng)目，對于確保產(chǎn)品安全性至關(guān)重要，因此有必要開展全面研究和檢測。目前《中國藥典》三部（2020 版）“1101 無菌檢查法”規(guī)定的無菌檢測方法有薄膜過濾法和直接接種法兩種，檢測周期通常需14 d，且對檢驗(yàn)取樣量有一定要求，但由于CAR-T產(chǎn)品批量較小，且大部分產(chǎn)品作為新鮮制劑供人體使用，采用傳統(tǒng)的藥典方法可能存在一定局限性。因此越來越多的產(chǎn)品采用無菌快速放行檢測方法用于工藝中間體和／或終產(chǎn)品檢測，但采用快速檢查法是否能與藥典方法具有相同的靈敏度是監(jiān)管機(jī)構(gòu)非常關(guān)注的問題。

本文簡述了中國、美國、歐洲監(jiān)管機(jī)構(gòu)對無菌快速檢查法的要求，并基于個(gè)人理解分析了不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于無菌快速檢查法相關(guān)要求的差異。同時(shí)結(jié)合個(gè)人審評實(shí)踐總結(jié)了無菌快速檢查法用于CAR-T產(chǎn)品工藝中間體和／或終產(chǎn)品檢測的常見問題，結(jié)合審評思考提出一般性技術(shù)要求，以供研發(fā)者借鑒及參考。

1 國內(nèi)外監(jiān)管技術(shù)要求

《中國藥典》三部（2020 版）“1101 無菌檢查法”、《美國藥典》“71 sterility tests”和《歐洲藥典》“2.6.1 sterility”均對基于培養(yǎng)法的無菌檢測方法提出了相應(yīng)的技術(shù)要求，從選擇方法、供試品檢驗(yàn)量及結(jié)果判定時(shí)間方面未見明顯差異［5-7］。但考慮到CAR-T 產(chǎn)品的特殊性，比如有效期短、批量小、臨床使用急迫性等，采用以上檢測方法可能具有一定局限性，因此國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)陸續(xù)更新了一些新的指南。以下將針對不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)目前在征求意見或已試行的指南情況和具體技術(shù)要求進(jìn)行闡述［8-14］。不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)的技術(shù)指南情況見表1。

表1 不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)技術(shù)指南

2021 年10 月國家藥典委員會(huì)公示了《中國細(xì)胞類制品微生物檢查法草案》，2022 年12 月國家藥典委員會(huì)再次針對《細(xì)胞類制品微生物檢查指導(dǎo)原則草案》（以下簡稱草案）對外公開征求意見。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，兩輪意見針對基于呼吸信號(hào)法的技術(shù)要求基本一致，內(nèi)容方面增加了關(guān)于細(xì)胞類制品定義、無菌快速替代方法必要性以及不同原理檢測方法的簡單概述，另外將原公示稿中細(xì)胞類制品微生物檢查風(fēng)險(xiǎn)評估內(nèi)容進(jìn)行調(diào)整，并納入到一般原則中，并且還增加了檢驗(yàn)環(huán)境的要求以及制品出現(xiàn)污染菌、結(jié)果爭議時(shí)的處理原則等［8-9］。另外，原公示稿與草案在供試品檢驗(yàn)量的要求上略有差異，原公示稿要求取樣量為接入每種培養(yǎng)基的最少量應(yīng)按照總體積的1%取樣，按照要求應(yīng)至少有2 種適宜培養(yǎng)基用于檢測真菌、需氧菌和厭氧菌，但草案關(guān)于供試品檢測量要求進(jìn)行了修改，要求按照總體積的1%取樣，分別接種至需氧培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基。

雖然目前草案尚未正式實(shí)施，但其技術(shù)要求為CAR-T 產(chǎn)品的無菌快速放行提供了一定依據(jù)。首先，從供試品選擇和檢驗(yàn)量上提出要求，供試品應(yīng)能代表細(xì)胞產(chǎn)品的所有組分，并從成品中取樣，如果成品取樣不適用情況下可采用替代取樣，如選擇在處理細(xì)胞最后接觸的液體中取樣，并且采用本法進(jìn)行生產(chǎn)過程的中間質(zhì)控時(shí)需從相應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)取樣。該草案明確提出供試品的檢驗(yàn)量應(yīng)不低于表2，不同于傳統(tǒng)的無菌檢測方法取樣量的要求，該取樣量降低了終產(chǎn)品的消耗。其次，該草案對培養(yǎng)基選擇、方法適用性試驗(yàn)（樣品批次、重復(fù)試驗(yàn)數(shù)量、菌種及菌液制備）、接種培養(yǎng)、結(jié)果判斷等均進(jìn)行了詳細(xì)的要求。第三，該草案明確指出，采用快速微生物檢查法應(yīng)按照《9201 藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)》（以下簡稱＜9201＞）［10］進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并在應(yīng)用于具體品種前進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，用以考察方法是否適用于該制品的檢查。而且，該草案明確指出，采用本指導(dǎo)原則所述的呼吸信號(hào)法時(shí)，可直接進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。根據(jù)＜9201＞要求，目前將微生物檢驗(yàn)替代方法分成2 類，包括定性和定量試驗(yàn)，并明確了定性和定量試驗(yàn)的驗(yàn)證項(xiàng)目和驗(yàn)證要求。

表2 供試品的最少檢測量

＜1071＞對于有效期短或需要立即使用的產(chǎn)品的無菌快速方法提出了一般性技術(shù)要求［11］，其適用產(chǎn)品類型包括復(fù)合無菌制劑、正電子發(fā)射斷層掃描產(chǎn)品以及細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品等。該指南主要是針對無菌快速放行檢測方法基于風(fēng)險(xiǎn)控制的理念進(jìn)行闡述，同時(shí)概述了目前不同原理的無菌快速檢查法，如ATP 生物發(fā)光、流式細(xì)胞術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、呼吸、固相細(xì)胞術(shù)等方法原理、檢測靈敏度、檢測時(shí)間等。該指南未對采用無菌快速檢查法時(shí)的取樣量、方法驗(yàn)證提出具體要求，但對于取樣量的要求引用了＜2.6.27＞的相關(guān)要求。＜1223＞是針對替代微生物檢測方法驗(yàn)證要求的技術(shù)指南［12］，其從微生物檢測儀器設(shè)備要求、替代方法的驗(yàn)證要求以及方法適用性均提出了較為廣泛和充分的建議。

＜2.6.27＞是針對有效期短、批量小，采用傳統(tǒng)的無菌檢測方法無法滿足放行檢測要求的細(xì)胞類產(chǎn)品無菌檢測制定的技術(shù)指南［13］，但不適用于人血或人血液制品的微生物檢查。該指南對檢測樣品的選擇、檢驗(yàn)量、檢測方法驗(yàn)證等提出了相應(yīng)建議。檢測樣品選擇應(yīng)來自終產(chǎn)品且必須能代表制品的所有成分，當(dāng)不能實(shí)現(xiàn)時(shí)，需進(jìn)行替代品測試，如與被處理細(xì)胞持續(xù)接觸的液體，但應(yīng)證明替代物的代表性。檢驗(yàn)量的要求見表2。另外，指南中對于基于微生物生長的自動(dòng)化檢查方法的驗(yàn)證內(nèi)容提出了較為詳細(xì)的建議，如促生長試驗(yàn)的要求，方法適用性要求，供試品檢驗(yàn)量要求，結(jié)果判定等。＜2.6.27＞同時(shí)也對于基于非生長的替代方法進(jìn)行了簡單列舉，并指出替代方法驗(yàn)證的要求可參考＜5.1.6＞。＜5.1.6＞詳細(xì)闡述了不同的替代檢測方法的原理、方法優(yōu)缺點(diǎn)以及驗(yàn)證的要求［14］，常見方法分為3 類，基于微生物生長的測定方法（如電化學(xué)法、氣體消耗和產(chǎn)生的測量、生物發(fā)光法、比濁法、選擇性和／或指示性培養(yǎng)基法）、直接測定法（如固相細(xì)胞術(shù)、流式細(xì)胞儀法、直接熒光過濾技術(shù)、自身熒光法）、細(xì)胞成分分析（如根據(jù)微生物表型和基因型特點(diǎn)開發(fā)的方法）。方法驗(yàn)證方面針對定性和定量方法的驗(yàn)證項(xiàng)目提出了要求。

綜合以上指南情況，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對無菌快速檢查法適用的范圍要求基本一致，均是針對有效期短、批量小，采用傳統(tǒng)藥典方法無法在使用前滿足放行檢測要求的產(chǎn)品。供試品的檢驗(yàn)量方面，草案和＜2.6.27＞均予以明確，但＜1071＞未提出具體要求，該指南中引用了＜2.6.27＞取樣量的要求。綜合以上情況認(rèn)為，目前各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)于無菌快速檢查法要求的檢測量基本保持一致。檢測方法方面，草案和＜2.6.27＞均提出了較為詳細(xì)的要求，如檢測樣品、重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)、陽性菌選擇、接種量、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，但＜1071＞僅列舉了幾種方法的原理和優(yōu)缺點(diǎn)等，未提出具體的檢測要求。另外，草案相比＜2.6.27＞在培養(yǎng)基的適用性確認(rèn)方面選擇的陽性菌種類不完全一致，草案中針對需氧菌種類相比＜2.6.27＞增加了大腸埃希菌，其他陽性菌要求基本一致。微生物檢測替代方法驗(yàn)證方面，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)均是針對定性和定量方法的驗(yàn)證項(xiàng)目提出了相應(yīng)的要求，雖然在驗(yàn)證項(xiàng)目的要求上略有不同，內(nèi)容詳略程度略有不同，但整體理念未見較大差異。

2 存在問題和基本考慮

CAR-T 產(chǎn)品的微生物控制主要通過對生產(chǎn)用原材料的檢測和控制、生產(chǎn)過程檢測和／或終產(chǎn)品放行檢測，以及按照《生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關(guān)要求進(jìn)行生產(chǎn)等一系列控制措施予以保障。我們在這類產(chǎn)品審評中發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)過程檢測和／或終產(chǎn)品放行檢測的無菌檢查存在諸多問題，以下針對目前存在的一些共性問題及基本考慮進(jìn)行闡述。

2.1檢測樣品選擇 CAR-T 生產(chǎn)過程比較復(fù)雜，通常包括單采血采集、T細(xì)胞分選和激活、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增、細(xì)胞收獲及制劑制備等一系列操作，且CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的有效成份為活細(xì)胞，產(chǎn)品為無菌制劑但不能采用終端滅菌工藝及除菌過濾工藝，因此采用過程控制和終產(chǎn)品放行檢測相結(jié)合的控制策略對確保這類產(chǎn)品的微生物安全性至關(guān)重要。

目前普遍存在的問題是僅在最終CAR-T產(chǎn)品階段進(jìn)行無菌檢測，生產(chǎn)工藝過程中缺少必要的無菌檢測和控制?？紤]到CAR-T 產(chǎn)品的特殊性，僅采用終產(chǎn)品進(jìn)行無菌檢測可能存在一定風(fēng)險(xiǎn)，一方面，CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)中可能使用動(dòng)物／人源性材料，且產(chǎn)品本身屬于活細(xì)胞，其生產(chǎn)過程微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)相對較高，因此單純的采用終點(diǎn)無菌檢測放行的控制策略可能存在一定風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，由于CAR-T終產(chǎn)品難以采用傳統(tǒng)藥典方法獲得檢測結(jié)果后再用于臨床受試者，通常需采用經(jīng)過驗(yàn)證的無菌快速檢查法，但由于無菌快速檢查法的成熟程度比較有限，因此為了確保臨床使用樣品的安全性，建議除了對原材料進(jìn)行嚴(yán)格的審核和基于風(fēng)險(xiǎn)制定合理的企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)外，還需在CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過程中進(jìn)行取樣和檢測，取樣點(diǎn)的設(shè)定需要根據(jù)工藝特點(diǎn)及工藝驗(yàn)證的結(jié)果確定。通常情況下，應(yīng)結(jié)合起始物料的來源和微生物控制情況、生產(chǎn)工藝的自動(dòng)化水平和密閉操作情況、細(xì)胞培養(yǎng)工藝復(fù)雜程度和培養(yǎng)時(shí)間、其他與生產(chǎn)或物料相關(guān)的因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，選擇適宜的工藝中間體進(jìn)行無菌檢測，基于常規(guī)的CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝建議在如下階段考慮進(jìn)行無菌檢測，如單采血階段、外周血單個(gè)核細(xì)胞復(fù)蘇階段、細(xì)胞收獲液階段（如適用）和／或終產(chǎn)品階段進(jìn)行無菌檢測。

2.2無菌快速檢測方法驗(yàn)證 目前大部分的CAR-T

產(chǎn)品的無菌快速檢測方法主要是基于微生物生長原理的方法，其中檢測微生物呼吸信號(hào)的方法較為常見，如BacT／ALERT 30 全自動(dòng)微生物檢測系統(tǒng)，該方法通常作為微生物檢測的定性方法，在使用該方法前需進(jìn)行驗(yàn)證，以確保無菌快速檢查法的效果優(yōu)于或等同于藥典方法。驗(yàn)證項(xiàng)目的選擇可參照＜9201＞關(guān)于定性和定量方法的一般驗(yàn)證要求，通常情況下定性方法驗(yàn)證項(xiàng)目包括專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性等。

目前在無菌快速驗(yàn)證方法中存在的問題包括以下幾個(gè)方面：①方法驗(yàn)證項(xiàng)目不全面；②方法檢測限驗(yàn)證中陽性菌種類不全，或加入陽性菌的濃度未進(jìn)行充分研究和驗(yàn)證，直接采用某一特定濃度陽性菌進(jìn)行試驗(yàn)并作為方法的檢測限；③方法中未設(shè)置合理的陰性對照；④無菌快速方法驗(yàn)證時(shí)未與藥典方法進(jìn)行等效性對比等。針對以上問題，方法學(xué)驗(yàn)證項(xiàng)目的不完善可能無法證明替代方法的可行性，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的可信性受影響，建議參照＜9201＞對定性和定量試驗(yàn)方法驗(yàn)證項(xiàng)目和驗(yàn)證目的的要求開展規(guī)范的驗(yàn)證，同時(shí)也可參考＜1223＞和＜5.1.6＞相關(guān)要求。如針對定性方法的專屬性驗(yàn)證一方面需要開展培養(yǎng)基的促生長試驗(yàn)以確保培養(yǎng)瓶中加入的培養(yǎng)基適宜與微生物生長；另一方面還需考慮供試品對檢測結(jié)果的干擾作用（微生物的生長抑制）。檢測限驗(yàn)證方面僅采用1 個(gè)較高濃度的試驗(yàn)菌進(jìn)行驗(yàn)證很難反映出替代方法的檢測靈敏度，更無法證明替代方法與藥典方法等效或優(yōu)于藥典方法，一般情況下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定接種量并采用較低濃度的試驗(yàn)菌接種，然后分別采用藥典方法和替代方法對試驗(yàn)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，以證明替代方法檢測限不大于藥典方法檢測限。雖然草案提出采用指導(dǎo)原則中呼吸信號(hào)法進(jìn)行無菌檢測時(shí)，可直接進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，但由于該草案尚未正式實(shí)施，因此目前階段仍建議進(jìn)行替代方法和藥典方法的等效性對比。目前＜9201＞和＜5.1.6＞中雖然提及可采用較低濃度的試驗(yàn)菌如每單位不超過5 CFU 進(jìn)行檢測限的驗(yàn)證，但該數(shù)值并不是一個(gè)固定的驗(yàn)證限度值，還需結(jié)合方法的檢測靈敏度以及微生物生長特性情況予以綜合考慮。另外，檢測限驗(yàn)證試驗(yàn)需考慮采用足夠數(shù)量的獨(dú)立試驗(yàn)和重復(fù)次數(shù)以證明方法的可靠性。方法驗(yàn)證試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)置合理的陽性對照、陰性對照，陽性對照的選擇種類和加入量可參照《中國藥典》和／或草案相關(guān)要求，陰性對照可考慮采用培養(yǎng)基、凍存液、稀釋液等。等效性驗(yàn)證在＜1223＞和＜5.1.6＞均有提及，雖然＜9201＞中未作為1 個(gè)驗(yàn)證項(xiàng)目單獨(dú)列出，但在檢測限和重現(xiàn)性驗(yàn)證項(xiàng)目中明確提出需采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評價(jià)兩種方法是否存在差異。因此，在開展無菌快速檢測方法驗(yàn)證時(shí)，需特別關(guān)注藥典方法和替代方法的等效性對比，確保替代方法檢測能力不低于或優(yōu)于藥典方法；另外，還需開展多次重復(fù)試驗(yàn)以確保獲得的試驗(yàn)結(jié)果滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

3 技術(shù)要求

無菌快速檢查法的應(yīng)用為CAR-T產(chǎn)品的快速放行提供了便利，但在其廣泛應(yīng)用的同時(shí)也帶來了監(jiān)管方面的擔(dān)憂，一方面是由于整個(gè)工藝過程控制和／或終產(chǎn)品放行僅采用無菌快速檢測法進(jìn)行檢測和控制，而缺少基于整體風(fēng)險(xiǎn)的控制策略，如未進(jìn)行留樣并增加藥典方法的復(fù)核，未結(jié)合工藝特點(diǎn)和產(chǎn)品特點(diǎn)充分評估無菌檢測策略的全面性和完整性；另一方面，不同原理的替代方法可能均存在一定局限性，且在未開展充分和全面的方法驗(yàn)證時(shí)直接作為藥典方法的替代可能存在一定安全性風(fēng)險(xiǎn)。因此為確保受試者安全性，建議在可行的情況下，首選藥典方法用于無菌檢查，但考慮到CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的特殊性，也鼓勵(lì)研究者開發(fā)快速無菌檢查法作為中間過程監(jiān)測或放行檢測方法，且在開展臨床試驗(yàn)前按照《中國藥典》要求以及參考其他監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求對無菌快速檢查法進(jìn)行充分驗(yàn)證／確認(rèn)?？焖贌o菌檢查法在完成替代方法學(xué)驗(yàn)證后，可采用該方法進(jìn)行產(chǎn)品檢驗(yàn)，但仍建議同步實(shí)施藥典方法檢測，持續(xù)積累數(shù)據(jù)。同時(shí)一旦發(fā)現(xiàn)藥典方法和快速無菌檢查法檢驗(yàn)結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)對檢驗(yàn)過程予以充分的調(diào)查，分析造成無菌檢查結(jié)果不一致的原因，以藥典檢測結(jié)果作為最終判定依據(jù)。同時(shí)針對結(jié)果不一致的情況，還需鑒定檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的污染微生物種類，并建立相應(yīng)的控制策略。而且在臨床使用時(shí)做好微生物污染的臨床應(yīng)急處理方案，一旦出現(xiàn)無菌檢測陽性結(jié)果，建議及時(shí)通知臨床醫(yī)生進(jìn)行后續(xù)應(yīng)急處理和治療。

4 結(jié)語

無菌檢查是CAR-T產(chǎn)品質(zhì)量控制項(xiàng)目中非常重要的安全性控制指標(biāo)，越來越多的基于不同原理的替代方法在該類產(chǎn)品的檢測中得到應(yīng)用。雖然不同國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)為替代方法的應(yīng)用和驗(yàn)證要求提出了一些要求，但由于這些替代方法通常依賴于供應(yīng)商提供的自動(dòng)化的儀器設(shè)備，且目前沒有一種國際上公認(rèn)的可替代傳統(tǒng)的無菌檢測方法的無菌快速檢查法。因此，采用替代方法用于無菌檢測時(shí)，建議申請人按照《中國藥典》和國際相關(guān)指南的要求規(guī)范開展替代方法的驗(yàn)證，在前期研究階段采用藥典方法和替代方法進(jìn)行并行檢測，持續(xù)積累兩種方法檢測一致性的數(shù)據(jù)。另外，希望申請人加強(qiáng)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的溝通，在采用新型的替代方法用于無菌檢查時(shí)，需提供充分的研究數(shù)據(jù)和資料，以確保替代方法的可靠性和準(zhǔn)確性。