康 奎,張 杰,萬思景,龔 俊,張道偉

(遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院/貴州省赤水河流域動物資源保護(hù)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遵義 563002)

白背飛虱Sogatellafurcifera屬半翅目飛虱科,是危害水稻且所涉范圍較大的遷飛性害蟲之一,同時也是我國和東南亞水稻產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一。白背飛虱的成蟲和若蟲經(jīng)常群集于水稻叢的下部刺吸水稻汁液,或雌蟲用產(chǎn)卵器刺破葉鞘和葉片(金劍雪, 2011),白背飛虱也能夠進(jìn)行病毒的傳播,如南方水稻黑條矮縮病毒(劉丹鳳, 2016)。長期以來,對于白背飛虱的防治手段都是利用化學(xué)藥物來進(jìn)行防治,但是長時間的使用化學(xué)農(nóng)藥,不僅會導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生一定的抗藥性,而且對于環(huán)境也有著嚴(yán)重的破壞和污染。

化學(xué)殺蟲劑的應(yīng)用通常被認(rèn)為是一種廉價和容易獲得的抑制害蟲數(shù)量的方法,在過去的50年里,它一直是害蟲防治的主要形式(Liangetal., 2015)?，F(xiàn)在大部分的研究都偏向?qū)ふ疫m合的生物藥劑來進(jìn)行防治白背飛虱,但由于其應(yīng)用成本較高且防治效果比化學(xué)藥劑見效慢,所以目前大部分的地區(qū)依舊使用的是化學(xué)農(nóng)藥(汪勇等, 2017)。在我國對于農(nóng)藥的使用有較為嚴(yán)重的浪費(fèi)現(xiàn)象并且農(nóng)藥的有效利用率很低,僅為20%,所浪費(fèi)的農(nóng)藥會對環(huán)境造成一定的破壞和污染(屠豫欽等, 2003)。為了降低對生態(tài)環(huán)境的危害,農(nóng)藥的高效利用就顯得尤為重要,如何高效的使用農(nóng)藥,降低環(huán)境污染及白背飛虱產(chǎn)生抗藥性的速率仍然是一項(xiàng)長期研究目標(biāo)。研究表明,殺蟲劑氯氰菊酯在斜紋夜蛾3齡幼蟲中暴露于3種不同光周期的毒性有不同的結(jié)果,在不同的時間,不同的光周期,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性發(fā)生了顯著變化。在此期間,特定的解毒酶的活性會波動,對于特定的殺蟲劑,導(dǎo)致50%死亡率的濃度在不同的光周期中會發(fā)生顯著變化(Karthi and Shivakumar, 2016)。

生物鐘是生物體生命活動的內(nèi)在節(jié)律性,它會影響著動物許多的生理活動和行為,能夠表現(xiàn)出一定的節(jié)律性,動物中存在著許多的節(jié)律基因。晝夜節(jié)律所產(chǎn)生的每日節(jié)律能夠調(diào)節(jié)許多的生命功能,在果蠅中也證明了晝夜節(jié)律系統(tǒng)在調(diào)節(jié)異種生物毒性方面具有保守作用(Michelleetal., 2010)。根據(jù)研究果蠅突變體發(fā)現(xiàn),clock基因能在脂肪體中影響淀粉向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變的過程,從而使昆蟲更具有饑餓感,進(jìn)一步影響到昆蟲的取食行為(Chatterjeeetal., 2010),在果蠅的味覺器官中cycle和period基因也通過影響味覺受體神經(jīng)元的表達(dá)來影響它的取食行為(Xuetal., 2008)。在褐飛虱Nilaparvatalugens中干涉Nlcycle節(jié)律基因能夠影響其對吡蟲啉農(nóng)藥的抗性(Kangetal., 2017)。在沙漠蝗蟲Schistocercagregaria中,利用RNAi的方法也發(fā)現(xiàn)period和timeless基因不僅能夠影響雄蟲精子的運(yùn)輸與釋放,還能夠影響雌蟲卵巢內(nèi)卵的發(fā)育(Tobbacketal., 2011; Tobbacketal., 2012)。

本研究擬結(jié)合昆蟲生物節(jié)律,在一天不同時間點(diǎn)探索噻蟲嗪、噻嗪酮對白背飛虱的防治效率,并利用RNAi方法探索白背飛虱節(jié)律基因Sfcycle在兩種農(nóng)藥防控中的作用,研究結(jié)果可為農(nóng)藥的高效使用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用白背飛虱來采自于遵義市,昆蟲飼養(yǎng)溫室中混合飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫室溫度為28±1℃,相對濕度為80%±10%,光周期為L∶D=16 h∶8 h。噻蟲嗪(30%懸浮劑)購至山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司,噻嗪酮(50%懸浮劑)購至上海悅聯(lián)生物科技有限公司,配置溶劑為水。

1.2 農(nóng)藥室內(nèi)致死效率檢測

配制田間推薦使用的濃度為0.27 g/L噻蟲嗪、5 mL/L噻嗪酮,利用稻莖浸漬法(宋江波, 2017),將準(zhǔn)備好的水稻莖在0.27 g/L噻蟲嗪或5 mL/L噻嗪酮藥液中浸漬30 s,晾干,用棉花包住水稻根部使其處于濕潤狀態(tài),置于培養(yǎng)管中。將成蟲第1天的白背飛虱用吸蟲器移入培養(yǎng)管中,每個培養(yǎng)管放置20頭試蟲,管口處用紗布罩住,每個時間點(diǎn)3個重復(fù)組,以水處理為對照。處理組及對照組都置于相同條件下的昆蟲飼養(yǎng)溫室中觀察,每隔3 h統(tǒng)計(jì)死亡率,統(tǒng)計(jì)12 h。采用校正死亡率計(jì)算,公式如下:

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100

1.3 白背飛虱Sfcycle序列的克隆

在網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)上搜索昆蟲cycle基因,選擇褐飛虱、果蠅、蚜蟲等與白背飛虱相近或模式昆蟲物種,利用本地Blast在白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中查找序列。設(shè)計(jì)全長引物克隆并測序后,在NCBI進(jìn)行Blastx驗(yàn)證克隆序列,獲得其部分序列。設(shè)計(jì)引物見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.4 節(jié)律基因Sfcycle的RNA干涉

根據(jù)擴(kuò)增得到的序列,避開定量區(qū)域,設(shè)計(jì)dsRNA引物(見表1)。dsRNA合成使用Promega T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒進(jìn)行。所合成的dsRNA分別進(jìn)行凝膠電泳檢測其完整性和微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。按照Kang等方法進(jìn)行RNA干涉,注射量為150 ng/頭,注射同等量的dsGFP作為對照。注射后將白背飛虱放于新鮮水稻上,并放回溫室繼續(xù)飼養(yǎng),在干涉24 h、48 h、72 h后取樣,每管3頭,共取9管,檢測其干涉效率。同一批注射的白背飛虱使用1.2方法進(jìn)行農(nóng)藥致死效率檢測。

1.5 定量PCR檢測

白背飛虱蟲體或組織樣品總RNA的提取采用Trizol試劑(Invitrogen公司)。將所提取的總RNA用凝膠成像系統(tǒng)分析其完整性,RNA濃度的測定在NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀上進(jìn)行,并通過OD260/OD280驗(yàn)證純度。然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)將1 μg Total RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

使用PCR多孔板按下列組分配置定量PCR反應(yīng)體系(10 μL反應(yīng)體系):SYBR premix Ex Taq,5 μL;cDNA模板,1 μL;PCR Forward Primer(F),0.2 μL;PCR Reverse Primer(R),0.2 μL;ddH2O,3.6 μL;共10 μL。每個處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),引物序列如表1所示,q-PCR反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性10 s;95℃變性5 s;58℃退火15 s;72℃延伸20 s;共40個循環(huán)。使用β-Actin基因作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法進(jìn)行運(yùn)算,用白背飛虱注射dsGFP組的Ct值為對照組。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,并使用SPSS 17.0軟件對所統(tǒng)計(jì)的具體數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用One-Way ANOVA法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05為差異顯著,用*表示;P<0.01為差異極顯著,用**表示),數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。處理后的數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間點(diǎn)白背飛虱對兩種農(nóng)藥的敏感性檢測

利用0.27 g/L噻蟲嗪、5 ml/L噻嗪酮處理白背飛虱在72 h內(nèi)的死亡率如圖1。噻蟲嗪、噻嗪酮處理的白背飛虱統(tǒng)計(jì)至72 h時,在7∶00時校正死亡率均較低,分別為54%、13.9%,16∶00時校正死亡率均較高,分別為89.8%、44.9%。

圖1 0.27 g/L噻蟲嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同時間點(diǎn)對白背飛虱的致死率檢測Fig.1 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points注:數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同字母表示差異顯著(P<0.05,t檢驗(yàn))。Note: Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, t-test).

2.2 白背飛虱節(jié)律基因Sfcycle的克隆及表達(dá)分析

通過對Sfcycle基因的克隆獲得其全長為5 042 bp。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示Sfcycle基因在各組織中均有表達(dá),且發(fā)現(xiàn)其在卵巢中的表達(dá)量最低,中腸表達(dá)量最高。4齡和5齡若蟲期在蛻皮前Sfcycle表達(dá)量較之蛻皮后高,成蟲期表達(dá)量相對穩(wěn)定(圖2)。

圖2 Sfcycle基因在不同組織和發(fā)育齡期中的表達(dá)量Fig.2 Relative mRNA expression of Sfcycle in different tissues of one-day-old brachypterous females and different development stage注:Ov, 卵巢; Mg, 中腸; Ep, 表皮; Fb, 脂肪體; He, 頭。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同字母表示差異顯著(P<0.05, Tukey’s 檢驗(yàn))。Note: Ov, Ovary; Mg, Midgut; Ep, Epidermis; Fb, Fat body; He, Head. Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, Tukey’s test).

2.3 Sfcycle基因干涉效果檢測

與注射dsGFP相比在注射了150 ng的dsSfcycle后,SfcyclemRNA的相對表達(dá)水平在3個檢測時間點(diǎn)與dsGFP相比均有顯著性下調(diào)(圖3-A)。干涉24 h后分別在7∶00和16∶00檢測SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2的基因表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,2個P450基因的表達(dá)量在2個檢測時間點(diǎn)均顯著降低。

圖3 白背飛虱節(jié)律基因Sfcycle干涉效率(A)及其對P450基因的影響(B, C)Fig.3 Efficiency of RNA interference (A) and affects of the expression levels of P450 genes (B, C)注:數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,柱上星號表示差異極顯著(P<0.01, t檢驗(yàn))。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (P<0.01, t-test).

2.4 干涉后噻蟲嗪、噻嗪酮在一天不同時間處理白背飛虱后死亡率統(tǒng)計(jì)情況

為了更好的驗(yàn)證節(jié)律基因是否影響白背飛虱對噻蟲嗪、噻嗪酮的耐性,利用RNAi方法處理白背飛虱,并分別在7∶00和16∶00利用噻蟲嗪、噻嗪酮處理白背飛虱。在干涉節(jié)律基因后,利用噻蟲嗪、噻嗪酮處理白背飛虱的死亡率并沒有顯著差異,對照組注射了dsGFP之后的兩個時間點(diǎn)仍有顯著差異。這表明Sfcycle基因的表達(dá)量影響著白背飛虱對噻蟲嗪、噻嗪酮的耐性,即影響了噻蟲嗪、噻嗪酮對白背飛虱的防治效果(圖4)。

圖4 干涉Sfcycle后0.27 g/L噻蟲嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同時間點(diǎn)對白背飛虱的致死率檢測Fig.4 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points injection of dsGFP and dsSfcycle注:數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,柱上星號表示差異顯著(*P<0.05,**P<0.01,t檢驗(yàn)),ns表示沒有顯著性差異。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (*P<0.05, **P<0.01, t-test). ns indicated no significant difference.

3 結(jié)論與討論

生物鐘存在于所有的生物體中,包括細(xì)菌、植物和動物。迄今,已經(jīng)有多個時鐘基因以及時鐘相關(guān)基因被鑒定,這一些時鐘基因會和它們的相應(yīng)產(chǎn)物組成兩個互相依賴的轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋環(huán)路,從而來調(diào)節(jié)行為和生理的晝夜節(jié)律(周先舉等, 2005)。生物的節(jié)律也會受到光和溫度的影響,在24 h之內(nèi)會呈現(xiàn)有規(guī)律的變化,它們通常在不同的組織中會有不同的下游基因來調(diào)控組織內(nèi)基因的節(jié)律(Cerianietal., 2002)。據(jù)報(bào)道,殺蟲劑,如有機(jī)磷和有機(jī)氯等,對各種害蟲昆蟲的作用也會隨著一天中不同的時間而變化(Hoovenetal., 2009)。如,埃及伊蚊Aedesaegypti和家蠶Bombyxmori在同一天的不同時間內(nèi)對綠菊酯的抗性不同(Yangetal., 2010),褐飛虱在ZT20和ZT16這兩個時間點(diǎn)對吡蟲啉的抗性也不同(Kangetal., 2017),本研究也發(fā)現(xiàn),兩種不同農(nóng)藥在一天不同時間內(nèi)對白背飛虱的致死效率也有顯著性的差異。

抗性代謝相關(guān)的酶的表達(dá)具有一定的節(jié)律現(xiàn)象,這在多個昆蟲中均有報(bào)道。例如,許多已經(jīng)確定或即將確定功能的基因如細(xì)胞色素P450蛋白,細(xì)胞色素P450氧化還原伴侶,酯酶,谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶。據(jù)報(bào)道,尿苷5′-二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)或尿苷5′ -二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶有節(jié)律地表達(dá)(Claridge-Changetal., 2001; McDonald and Rosbash, 2001; Cerianietal., 2002; Linetal., 2002; Uedaetal., 2002)。在果蠅中至少有5個與農(nóng)藥代謝相關(guān)P450基因CYP4E2、CYP6A2、CYP6G1、CYP6W1、CYP12A4的表達(dá)具有節(jié)律(Hoovenetal., 2009),褐飛虱的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6AX1等(Kangetal., 2017)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中,通過組學(xué)的測定發(fā)現(xiàn)至少有2 000以上的基因具有節(jié)律性表達(dá),而這其中就包括了與擬除蟲菊酯和DDT代謝能力相關(guān)基因,包括CYP6M2、CYP6P3、CYP6Z1和GSTE2,這些基因的表達(dá)最高值在一天不同的時間,都是受節(jié)律調(diào)控的(Balmertetal., 2014)。殺蟲劑氯氰菊酯在斜紋夜蛾Spodopteralitura3齡幼蟲中暴露于3種不同光周期的毒性有不同的結(jié)果,在不同的時間、不同的光周期,谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性發(fā)生了顯著變化(Wangetal., 2020)。褐飛虱體內(nèi)節(jié)律基因Nlcycle的表達(dá)情況影響了其抗藥性基因的表達(dá),最終表現(xiàn)出其對農(nóng)藥吡蟲啉的抗性降低(Kangetal., 2017)。本研究在降低了Sfcycle基因表達(dá)后,顯著影響了參與白背飛虱對殺蟲劑響應(yīng)的2個細(xì)胞色素P450基因SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2(賈澤艷等, 2020)的表達(dá),通過對其進(jìn)行農(nóng)藥浸染的水稻處理后,白背飛虱的死亡率顯著性的增加。

由于在農(nóng)藥方面存在高度的適應(yīng)性,導(dǎo)致就算使用特效的化學(xué)農(nóng)藥也不能夠?qū)崿F(xiàn)稻飛虱可持續(xù)治理的目標(biāo)(Pangetal., 2015)。本試驗(yàn)將白背飛虱在一天之內(nèi)對噻蟲嗪、噻嗪酮的敏感性做了分析,以求達(dá)到高效率的使用化學(xué)農(nóng)藥防治,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用來改善農(nóng)藥的使用和提高田間農(nóng)藥使用效率。