陳 曉,邱峙嵩,蘇小燕,許 原,曹麗沙,楊振德,胡 平

(廣西大學(xué)林學(xué)院,南寧 530004)

桉蝙蛾EndoclitasigniferWalker(鱗翅目Lepidoptera蝙蝠蛾科Hepialidae)是桉樹(shù)上的一種重要蛀干性害蟲(chóng)之一。近年來(lái),隨著我國(guó)南方速生桉人工林大面積的規(guī)?；N植,桉蝙蛾危害范圍逐漸擴(kuò)大,已成為影響桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要鉆蛀性害蟲(chóng)(楊秀好等, 2021)。桉蝙蛾雌蟲(chóng)交配后,多將卵隨機(jī)散產(chǎn)于1～3年生的桉樹(shù)幼林內(nèi);幼蟲(chóng)3齡以前,營(yíng)地棲生活,3～5齡幼蟲(chóng)上樹(shù)蛀干,此后營(yíng)樹(shù)棲生活,直至12齡末期于所蛀孔洞內(nèi)化蛹(于永輝, 2012)。受桉蝙蛾危害的桉樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育減緩,材積減少、材質(zhì)下降,且易風(fēng)折、枯死(楊秀好, 2013)。目前,針對(duì)桉蝙蛾的研究主要集中在生物生態(tài)學(xué)特性(曹書(shū)閣等, 2011; 楊秀好等, 2012;Yangetal., 2013; Zhengetal., 2016; 胡平等, 2021)、生物防治(藍(lán)霞等, 2014; 鄒東霞等, 2016)以及遺傳與生理學(xué)(Yangetal., 2016; Zhangetal., 2021)等方面,而對(duì)桉蝙蛾幼蟲(chóng)內(nèi)參基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)是檢測(cè)生物體中基因表達(dá)差異常用的核酸定量檢測(cè)技術(shù)之一,而RT-qPCR結(jié)果的可靠與否,依賴于內(nèi)參基因這一重要因素。常用的內(nèi)參基因包括延伸因子(Elongation factors,EF)、肌動(dòng)蛋白基因(Actin,ACTIN)、核糖體蛋白基因(Ribosomal protein,RIB)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)等基因(Luetal., 2018)。內(nèi)參基因一般選擇參與細(xì)胞基本生命活動(dòng)、在生物體內(nèi)的各個(gè)部位和不同的實(shí)驗(yàn)處理下均能穩(wěn)定表達(dá)的基因。然而,研究表明內(nèi)參基因的穩(wěn)定是相對(duì)的,隨著實(shí)驗(yàn)處理的改變,在不同生理狀態(tài)下,內(nèi)參基因的表達(dá)存在差異(Zhangetal., 2014; Shakeeletal., 2018)。因此,在利用RT-qPCR進(jìn)行目的基因表達(dá)水平研究時(shí),必須使用合適的內(nèi)參基因?qū)T-qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理,以減少樣本之間由RNA提取、cDNA定量、轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增所帶來(lái)的誤差,從而得出正確的判斷(Gueninetal., 2009)。

本文通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期(3齡、5齡、9齡、12齡)、不同體節(jié)(頭、胸、腹)和全樣品處理下的候選內(nèi)參基因表達(dá)量,并利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等計(jì)算程序?qū)?個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估,為桉蝙蛾幼蟲(chóng)基因表達(dá)的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源及樣本采集

桉蝙蛾幼蟲(chóng)于2019年6月-2020年9月采自廣西壯族自治區(qū)國(guó)有高峰林場(chǎng)(N 22°941′, E 108°336′)的桉樹(shù)寄主上。將受害木段鋸下帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi),劈開(kāi)木段后取出幼蟲(chóng),于-80℃下冷凍保存。參考王緝健等(2015)的齡期劃分方法,取3齡和5齡(地棲或初轉(zhuǎn)樹(shù)棲,低齡幼蟲(chóng))、9齡(樹(shù)棲,中齡幼蟲(chóng))、12齡(越冬,老齡幼蟲(chóng))桉蝙蛾幼蟲(chóng),用解剖手術(shù)剪沿腹部中線剪開(kāi)幼蟲(chóng)胸腹部表皮,清除脂肪和腸道后,分別剪下頭、胸、腹,作為不同體節(jié)與不同齡期的樣品,所有樣品作為全樣品處理。每個(gè)齡期和體節(jié)各重復(fù)3次。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(No.74134; Qiagen, Hilden, Germany)提取所有樣本總RNA,具體步驟參照RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。取1 μL RNA樣品,使用NanoDrop 8000(Thermo, Waltham, MA, USA)測(cè)定OD260/OD280與OD260/OD230,當(dāng)各自的比值在1.8～2.1之間,且通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)能獲得清晰條帶的樣品用于cDNA合成。取1 μL RNA的量,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TranGen Biotech)的步驟合成cDNA。

1.3 內(nèi)參基因選擇及RT-qPCR引物設(shè)計(jì)

參考其他昆蟲(chóng)常用的內(nèi)參基因,選取桉蝙蛾幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組(Zhangetal., 2021)中鑒定的ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF作為候選內(nèi)參基因(表1)。利用引物設(shè)計(jì)工具Primer 3(https:// primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物(表1)。引物由北京TSINGKE公司合成。

表1 桉蝙蛾幼蟲(chóng)樣本中5個(gè)候選內(nèi)參基因的引物序列和擴(kuò)增子特征

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和RT-qPCR分析

將樣品cDNA模板梯度稀釋1/10、1/100、1/500、1/1 000、1/1 500進(jìn)行反應(yīng),在冰上進(jìn)行反應(yīng)體系的配制,RT-qPCR反應(yīng)體系(25 μL)如下:Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix(No ROX)(ABclonal Technology)12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA稀釋液2.0 μL,Nuclease-free H2O 8.5 μL,在Ligh Cycler 480 II(Roche,USA)上進(jìn)行反應(yīng)。PCR程序:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性5 s,60℃退火和延伸共30 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s形成熔解曲線。通過(guò)熔解曲線與梯度濃度擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)每對(duì)引物的擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)R2(表1)。每個(gè)cDNA樣品設(shè)置3次技術(shù)性重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

分別利用內(nèi)參基因評(píng)估軟件GeNorm、BestKeeper和NormFinder軟件及RefFinder在線網(wǎng)站(https://www.heartcure.com.au/reffinder)評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因在桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期與不同體節(jié)中的表達(dá)穩(wěn)定性。在利用GeNorm分析時(shí),表達(dá)穩(wěn)定值M<1.5且數(shù)值越小,表示該基因相較其他候選內(nèi)參基因更能在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)處理下穩(wěn)定表達(dá);而配對(duì)差異值Vn/(n+1)<0.15時(shí)則表示最佳的內(nèi)參基因數(shù)目為n個(gè),不需再增加其數(shù)量,否則加入新基因,直至Vn/(n+1)<0.15(Vandesompeleetal., 2002)。Normfinder通過(guò)計(jì)算不同樣本組內(nèi)和組間的變化來(lái)評(píng)估候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(Stability value,SV),該值越小表示基因越穩(wěn)定(Andersenetal., 2004)。BestKeeper直接使用Ct值進(jìn)行計(jì)算,主要通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation,SD)來(lái)評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,當(dāng)SD<1且SD數(shù)值越小時(shí),認(rèn)為該基因的表達(dá)越是穩(wěn)定(Pfaffletal., 2004)。最后,通過(guò)常用的RefFinder對(duì)3種軟件得出的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排名,即加權(quán)幾何平均值越小越穩(wěn)定(Xieetal., 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增效率及特異性

所有基因的擴(kuò)增條帶清晰而單一,且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期一致(圖1);同時(shí),基于候選內(nèi)參基因不同濃度的cDNA獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的回歸系數(shù)(R2>0.995),PCR擴(kuò)增效率在99.7%～108.4%之間(表1),表明各候選內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)合理,可用于相應(yīng)基因的定量檢測(cè)。

圖1 引物的PCR擴(kuò)增條帶Fig.1 PCR amplification bands of primers

2.2 不同候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)水平差異

RT-qPCR分析桉蝙蛾5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平顯示,在所有樣品中,各基因的Ct平均值在24.13～28.84之間,表明所有候選內(nèi)參基因在各處理中均有較高的表達(dá)量,且在不同處理的表達(dá)量均存在差異。其中,ACTIN的平均表達(dá)豐度最大(24.13)、表達(dá)水平差異最小(SD=2.40);而TUB的表達(dá)水平差異(SD=6.48)最大,其次為EF(SD=3.30)、GAPDH(SD=3.21)、RIB(SD=2.84)(圖2)。

圖2 不同候選內(nèi)參基因在桉蝙蛾幼蟲(chóng)樣本中的表達(dá)水平(Ct值)Fig.2 Expression levels of different candidate reference genes in the samples of Endoclita signifer larvae (Ct value)注:點(diǎn)為Ct平均值,中垂線的上下限為標(biāo)準(zhǔn)偏差。Note: The point represent the Ct mean value, and the upper and lower limits of the midline represent the standard deviation.

2.2 候選內(nèi)參基因在不同處理下的穩(wěn)定性分析

2.2.1BestKeeper軟件分析

在3齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,所有基因的SD值均大于1,均不適于作為內(nèi)參基因;RIB和EF在5齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中具有良好的表達(dá)穩(wěn)定性,而ACTIN、GAPDH和TUB的SD值均大于1,顯示較差的穩(wěn)定性;9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)镋F,其次為GAPDH、RIB,而ACTIN最不穩(wěn)定;相反,ACTIN在12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中的表達(dá)最穩(wěn)定,EF次之,而GAPDH、RIB和TUB不適于作為內(nèi)參基因(SD>1)。在不同齡期幼蟲(chóng)的胸部中僅GAPDH能穩(wěn)定表達(dá)(SD=0.688<1),其余4個(gè)候選內(nèi)參基因均不適于作為內(nèi)參基因(SD>1);所有基因在不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和腹部中的表達(dá)均不穩(wěn)定(SD>1)。沒(méi)有任何一個(gè)基因能在所有處理中穩(wěn)定表達(dá)。特別是TUB在所有處理中均被認(rèn)為是不穩(wěn)定的基因(SD>1)(表2)。

表2 不同處理下候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.2.2GeNorm軟件分析

在3齡、5齡、9齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,最穩(wěn)定的一對(duì)基因分別為ACTIN/RIB、RIB/EF、GAPDH/EF和GAPDH/RIB,其中ACTIN在9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中表達(dá)最不穩(wěn)定,TUB在3齡、5齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中均被認(rèn)為是最不穩(wěn)定的基因;在不同齡期幼蟲(chóng)的頭部中僅RIB和EF能穩(wěn)定表達(dá),而在不同齡期幼蟲(chóng)的胸部、腹部和全樣品處理中,所有基因的M值均大于1.5,認(rèn)為在這3個(gè)處理中無(wú)任一基因可作為內(nèi)參基因(表2)。

2.2.3NormFinder軟件分析

3齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中的基因穩(wěn)定性排序?yàn)镽IB>ACTIN>GAPDH>EF>TUB,RIB、TUB分別為最穩(wěn)定、最不穩(wěn)定的基因。5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,穩(wěn)定性較高的前3個(gè)基因同為GAPDH>EF>RIB,而ACTIN和TUB被認(rèn)為穩(wěn)定性較低;ACTIN在12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中穩(wěn)定性最高,TUB仍是穩(wěn)定性最低的基因;EF是不同齡期幼蟲(chóng)的頭部中表達(dá)最穩(wěn)定的基因,而RIB是不同齡期幼蟲(chóng)的胸部、腹部及全樣品處理中表達(dá)最穩(wěn)定的基因。同樣地,所有樣本中最不穩(wěn)定的基因均為T(mén)UB,這與BestKeeper的結(jié)果一致(表2)。

2.2.4RefFinder綜合分析

3齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的胸部以及全樣品中,RIB、ACTIN和GAPDH是穩(wěn)定性排序前3的基因,排序分別為RIB>ACTIN>GAPDH和ACTIN>RIB>GAPDH、RIB>GAPDH>ACTIN以及RIB>ACTIN>GAPDH;而EF和TUB

為穩(wěn)定性較低的一對(duì)基因,其中TUB在這些處理中均為最不穩(wěn)定的基因。5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,排列前3的基因同為EF、RIB、GAPDH,排序分別為EF>RIB>GAPDH、GAPDH>EF>RIB;而ACTIN和TUB的穩(wěn)定性較差,5齡、9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中最不穩(wěn)定的基因分別為T(mén)UB、ACTIN。不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和胸部中穩(wěn)定性排序均為EF>RIB>ACTIN>GAPDH>TUB(圖3)。

圖3 基于RefFinder軟件分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.3 Expression stability of the candidate reference genes was analyzed by RefFinder software注:A.、B、C、D分別為3齡、5齡、9齡、12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié);E、F、G分別為不同齡期幼蟲(chóng)的頭部、胸部、腹部;H為全樣品。Note: A, B, C and D represented the different segments of the 3rd, 5th, 9th and 12th instar larvae, respectively; E, F and G represented the head, thorax and abdomen of different instars; H was for all samples.

2.2.5最適內(nèi)參基因的確定

在8種處理中,各處理的Vn/(n+1)值均大于0.15(圖4),說(shuō)明通過(guò)配對(duì)變異值不能完全確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)目,但可根據(jù)Vn/(n+1)值的變化趨勢(shì),選擇表達(dá)穩(wěn)定性最好的2～3個(gè)基因作為最適內(nèi)參基因。在5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和胸部中,加入第3個(gè)內(nèi)參基因會(huì)使得Vn/(n+1)值增大,故這4個(gè)處理的內(nèi)參基因最佳數(shù)目均為2個(gè);相反,在3齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的腹部及全樣品處理中,引入第3個(gè)內(nèi)參基因會(huì)減小Vn/(n+1)值,因此這3個(gè)處理中的內(nèi)參基因最佳數(shù)目均為3個(gè)。

圖4 基于GeNorm軟件分析不同處理下所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目Fig.4 Optimal number of reference genes under different conditions was analyzed based on GeNorm software

結(jié)合RefFinder綜合排序的分析(圖3),3齡、12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)及全樣本中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合為ACTIN+RIB+GAPDH;5齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)和不同齡期幼蟲(chóng)的頭部中,EF+RIB為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合;在9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的胸部和腹部中,可分別選擇GAPDH+EF、RIB+GAPDH和EF+RIB+ACTIN作為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合(表3)。

表3 不同處理下最佳的內(nèi)參基因組合

3 結(jié)論與討論

RT-qPCR技術(shù)是基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄分析中最常用的技術(shù)手段之一,其中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性直接影響著RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇合適的內(nèi)參基因是保證RT-qPCR結(jié)果可靠性的重要基礎(chǔ)(Dundas and Ling, 2012)。迄今為止,沒(méi)有任何一個(gè)內(nèi)參基因在所有實(shí)驗(yàn)處理下保持恒定的表達(dá)水平,因此在進(jìn)行RT-qPCR前,有必要進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選(Shi and Zhang, 2016)。

候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)常采用多個(gè)方法依據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行綜合分析,并根據(jù)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性高低進(jìn)行排序。在單獨(dú)采用3種方法進(jìn)行排序的情況下,發(fā)現(xiàn)在桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期和不同體節(jié)中通過(guò)3種方法給出的最穩(wěn)定內(nèi)參基因及其排序并不完全一致。如在桉蝙蛾12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,BestKeeper認(rèn)為ACTIN是最穩(wěn)定的基因,其次為EF、RIB,GeNorm認(rèn)為穩(wěn)定性排序?yàn)镽IB=GAPDH>ACTIN>EF>TUB,而NormFinder則認(rèn)為ACTIN是最穩(wěn)定的基因,其次為RIB、GAPDH(表2)。在其他昆蟲(chóng)的內(nèi)參基因篩選中也存在類似情況(陳立華等, 2014; Yangetal., 2017),這可能與3種方法的計(jì)算方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)不同有關(guān)。因此,最終使用RefFinder對(duì)各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排序,以減少各軟件間的結(jié)果差異。

通常以GeNorm軟件給出的基因配對(duì)變異值Vn/(n+1)<0.15為參考,來(lái)確定所需內(nèi)參基因的數(shù)目。但在桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期與不同體節(jié)中,各處理的所有配對(duì)變異值Vn/(n+1)>0.15(圖4)。這種情況在許多研究中也有出現(xiàn),如在二化螟Chilosuppressalis的不同齡期、不同組織和混合樣品中(Xuetal., 2019),在柑橘大實(shí)蠅Bactroceraminax的不同蟲(chóng)體、成蟲(chóng)不同組織中(王佳等, 2014),在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的Bt毒素誘導(dǎo)處理中(符偉等, 2012)等。針對(duì)這種現(xiàn)象,GeNorm使用說(shuō)明中建議,當(dāng)配對(duì)變異值Vn/(n+1)>0.15時(shí),可根據(jù)配對(duì)變異值趨勢(shì)變化,選擇2～3個(gè)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因(Vandesompeleetal., 2002);同時(shí),過(guò)多地引入內(nèi)參基因會(huì)導(dǎo)致更多的不穩(wěn)定因素,因此最適內(nèi)參基因的數(shù)目不應(yīng)超過(guò)3個(gè)(Zhuetal., 2014)。據(jù)此,在桉蝙蛾5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和胸部中不應(yīng)引入第3個(gè)基因使得配對(duì)變異值Vn/(n+1)增大,故內(nèi)參基因的最佳數(shù)目為2;而在3齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的腹部及全樣本中,第3個(gè)內(nèi)參基因的引入能使Vn/(n+1)值減小,故內(nèi)參基因的最佳數(shù)目為3(圖4)。

桉蝙蛾3齡、12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)及全樣品處理中,RIB顯示出較好的穩(wěn)定性(表3)。RIB是調(diào)控細(xì)胞核糖體的合成、參與細(xì)胞翻譯過(guò)程的重要管家基因。與核糖體調(diào)控相關(guān)的基因在許多研究中被認(rèn)為是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,如桃蛀螟Conogethespunctiferails中,RP49在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中最穩(wěn)定(楊苓等, 2017);粘蟲(chóng)Mythimnaseparata幼蟲(chóng)不同組織中最穩(wěn)定的基因?yàn)镽PL12(Lietal., 2018);RPS15和RPL13可作為棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera幼蟲(chóng)不同組織中的一組內(nèi)參基因(Zhangetal., 2015)。在桉蝙蛾5齡幼蟲(chóng)不同體節(jié)和不同齡期幼蟲(chóng)的頭部、腹部中,EF有良好的表達(dá)穩(wěn)定性(表3)。EF在蟲(chóng)草鉤蝠蛾Thitarodesarmoricanus幼蟲(chóng)(Liuetal., 2016)和羽衣袖蝶Heliconiusnumata的不同組織與不同發(fā)育階段中也均可作為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因(Panetal., 2015),顯示EF對(duì)這些昆蟲(chóng)發(fā)育階段和組織的變化可能不敏感。在桉蝙蛾9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(表3)。GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)是調(diào)控糖酵解、糖異生等能量代謝過(guò)程中的一種關(guān)鍵酶。在大螟Sesamiainferens、甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura的不同發(fā)育階段中(Luetal., 2013; Zhuetal., 2014; Luetal., 2015),GAPDH是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。同樣地,GAPDH在桉蝙蛾不同齡期幼蟲(chóng)的腹部中具有較高的穩(wěn)定性,表明同一基因在不同昆蟲(chóng)同一實(shí)驗(yàn)處理下的研究結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。在桉蝙蛾12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,最佳的內(nèi)參基因是ACTIN(表3)。ACTIN(β-Actin)參與細(xì)胞分裂、染色體運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)流動(dòng)等幾乎所有的真核細(xì)胞生理過(guò)程,是常用的內(nèi)參基因(Chapman and Waldenstrom, 2015)。但是,ACTIN在桉蝙蛾幼蟲(chóng)3齡和9齡的不同體節(jié)中呈現(xiàn)不穩(wěn)定的基因表達(dá),這與草原毛蟲(chóng)屬Gynaephora種群在不同海拔處理(Zhangetal., 2017)、美國(guó)白蛾Hyphantriacunea在不同溫度處理(陶蓉等, 2019)下得出的結(jié)果一致,說(shuō)明內(nèi)參基因的使用率與內(nèi)參基因的穩(wěn)定性之間沒(méi)有絕對(duì)的因果關(guān)系,突出針對(duì)特定昆蟲(chóng)與具體的實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行內(nèi)參基因篩選的必要性。

TUB(Tubulin)編碼的微管蛋白參與包括構(gòu)建和維持細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)運(yùn)輸、染色體運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞分裂等許多生理過(guò)程,也常被認(rèn)為是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一。如在舞毒蛾Lymantriadispar的不同發(fā)育階段(Yinetal., 2020)、二化螟Chilosuppressalis幼蟲(chóng)(Xuetal., 2019)和朱紅毛斑蛾P(guān)haudaflammans(陳煉等, 2021)的不同組織中,TUB均是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。特別地,在桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期和不同體節(jié)中,TUB均被認(rèn)為是不穩(wěn)定的基因(表3),這支持在所有實(shí)驗(yàn)處理中任一內(nèi)參基因均不能恒定表達(dá)的觀點(diǎn)。

從桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期與不同體節(jié)中,即使在同一昆蟲(chóng)個(gè)體內(nèi),5個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性都隨著蟲(chóng)齡和體節(jié)的變化而變化(表2、圖3),并不存在絕對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。全樣品處理中的結(jié)果表明,當(dāng)綜合考慮桉蝙蛾幼蟲(chóng)的齡期與取樣部位2個(gè)因素的影響時(shí),可選擇RIB和ACTIN作為內(nèi)參基因。

在同一齡期不同體節(jié)中,ACTIN在12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中表達(dá)最穩(wěn)定,但在5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中卻不穩(wěn)定;同樣地,EF在不同齡期幼蟲(chóng)的腹部中表達(dá)不穩(wěn)定,但在不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和腹部中表達(dá)最穩(wěn)定(圖3)。這表明幼蟲(chóng)蟲(chóng)齡與取樣組織對(duì)內(nèi)參基因篩選的結(jié)果具有較大影響,須針對(duì)特定齡期和取樣組織選擇合適的內(nèi)參基因。桉蝙蛾幼蟲(chóng)的齡級(jí)較多(1～12齡),各齡期幼蟲(chóng)體型差異巨大,且生活史復(fù)雜,存在地棲(1～3齡或5齡,低齡幼蟲(chóng))與樹(shù)棲(5～12齡,中、老齡幼蟲(chóng))兩個(gè)截然不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段,并以幼蟲(chóng)形態(tài)(12齡,老熟幼蟲(chóng))越冬(王緝健等, 2015),推測(cè)桉蝙蛾不同齡期幼蟲(chóng)之間、不同幼蟲(chóng)體節(jié)之間的基因表達(dá)存在著較大差異,需區(qū)分特定的幼蟲(chóng)齡期與體節(jié)進(jìn)行研究,而本研究的結(jié)果也證明了其必要性。

當(dāng)然,本研究推薦了在桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期(3齡、5齡、9齡、12齡)與不同體節(jié)(頭、胸、腹)中適用的內(nèi)參基因組合,可為相似實(shí)驗(yàn)處理下桉蝙蛾幼蟲(chóng)基因表達(dá)的研究提供參考,但更多不同的實(shí)驗(yàn)處理未必符合這些設(shè)定,故仍需針對(duì)具體的實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行最適內(nèi)參基因的篩選;同時(shí),雖然在本研究中針對(duì)多種處理而篩選出了多組內(nèi)參基因,但也局限了各內(nèi)參基因的應(yīng)用范圍,后續(xù)可進(jìn)一步發(fā)掘在桉蝙蛾幼蟲(chóng)基因表達(dá)研究中更為廣譜的內(nèi)參基因。

本研究結(jié)果表明,桉蝙蛾5齡和9齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的頭部和胸部中選擇 2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因較為合適,而3齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)、不同齡期幼蟲(chóng)的腹部及全樣本中需選擇3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參。在3齡、5齡、9齡和12齡幼蟲(chóng)的不同體節(jié)中,可選擇ACTIN+RIB+GAPDH、EF+RIB、GAPDH+EF和ACTIN+RIB+GAPDH作為內(nèi)參;不同齡期幼蟲(chóng)頭部、胸部和腹部推薦的內(nèi)參基因組合分別為EF+RIB、RIB+GAPDH和EF+GAPDH+ACTIN;同時(shí)考慮桉蝙蛾幼蟲(chóng)不同齡期與不同體節(jié)的因素時(shí),推薦RIB、ACTIN和GAPDH作為內(nèi)參基因。