鐘其恩,岑永杰,馬 康,彭亞楠,鄭思春

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院昆蟲科學(xué)與技術(shù)研究所,廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631;梅州市華師昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣梅園研發(fā)中心,廣東梅州514779)

1993年,Ambros和Lee等人在線蟲Caenorhabditidelegans中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA(lin-4),它通過調(diào)控胚胎后期的發(fā)育基因lin-14從而調(diào)控了線蟲幼蟲從L1期到L2期的轉(zhuǎn)換。在此后的一年中,又相繼發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)有關(guān)人類細(xì)胞、果蠅drosophilid以及線蟲的非編碼小分子RNA,掀起了miRNA研究的浪潮(Leeetal., 1993; Reinhartetal., 2000; Chenetal., 2004; Zhouetal., 2009)。而miRNA的生物合成受到嚴(yán)格的調(diào)控,其表達(dá)具有組織和時(shí)空特異性的特點(diǎn)。一個(gè)miRNA成熟體的形成主要經(jīng)歷4個(gè)階段:miRNA基因首先在RNA聚合酶II的作用下形成約為1 000 bp左右的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA,該產(chǎn)物具有帽子結(jié)構(gòu)和Poly A尾巴,二級(jí)結(jié)構(gòu)呈長(zhǎng)發(fā)卡結(jié)構(gòu)(Cullen, 2004; Leeetal., 2004; Kimetal., 2005)。接著pri-miRNA在Drosha酶作用下,形成具有70 bp左右不完全互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)(Lundetal., 2004; Lucas and Raikhel, 2013)。細(xì)胞核內(nèi)的pre-miRNA經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)后,由Dicer酶識(shí)別并剪切形成長(zhǎng)度22 bp左右的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA分子中較穩(wěn)定的一條鏈通過與基因沉默復(fù)合體RISC結(jié)合,最終組裝成與靶基因結(jié)合的miRNP復(fù)合物(Martinezetal., 2002; Yietal., 2003; Miskaetal., 2005; Bartel, 2009; Marcoetal., 2010)。

在生物體內(nèi),miRNA與靶基因之間的關(guān)系并非簡(jiǎn)單的專一關(guān)系,靶基因和miRNA相互結(jié)合的位點(diǎn)可以是單個(gè)也可以是多個(gè),兩者的調(diào)控關(guān)系復(fù)雜且精密(Shenetal., 2008; Formanetal., 2008; Duursmaetal., 2008; Brodersen and Voinnet, 2009; Shinetal., 2010)。研究表明,miRNA 5′端可以通過完全和不完全的配對(duì)方式,結(jié)合到靶基因mRNA的非編碼區(qū)(UTR)或者編碼區(qū)(CDS),從而發(fā)揮其對(duì)基因調(diào)控的功能(Wightmanetal., 1993; Leeetal., 1993; Lytleetal., 2007; Orometal., 2008; Shenetal., 2008)。一般認(rèn)為,當(dāng)以完全互補(bǔ)配對(duì)的形式結(jié)合時(shí),miRNA通過降解mRNA而下調(diào)靶基因的表達(dá);當(dāng)以不完全互補(bǔ)配對(duì)的形式結(jié)合時(shí),miRNA則通過抑制mRNA翻譯而抑制基因表達(dá)(Buchan and Parker, 2007; Lelandaisetal., 2010)。此外,miRNA調(diào)控基因表達(dá)的方式可以是正調(diào)控或負(fù)調(diào)控,在不同的細(xì)胞周期,這種調(diào)控具有不同的效應(yīng)。如在G1/G0阻滯期,miRNA啟動(dòng)基因的表達(dá);而在細(xì)胞分裂期,它們抑制基因的表達(dá)。miRNA的這種激活和抑制效應(yīng)在細(xì)胞周期中可持續(xù)切換(Vasudevan and Steitz, 2007; Vasudevanetal., 2007; Orometal., 2008)。

昆蟲的生長(zhǎng)與發(fā)育主要受到蛻皮激素和保幼激素兩大激素的協(xié)同調(diào)控,miRNA也參與了這些重要的生命過程的調(diào)控。在果蠅的幼蟲末期和預(yù)蛹期,體內(nèi)高滴度的蛻皮激素誘導(dǎo)let-7、miR-100和miR-125的表達(dá),同時(shí)抑制miR-34的表達(dá),而保幼激素的作用則剛好相反(Bashirullahetal., 2003; Sempereetal., 2003)。另一方面,蛻皮激素能夠通過抑制miR-14的表達(dá)而增強(qiáng)其信號(hào)強(qiáng)度,更有利于調(diào)控變態(tài)發(fā)育(Varghese and Cohen, 2007)。在家蠶Bombyxmori中,miR-281能夠抑制蛻皮激素受體B構(gòu)型的表達(dá),所以miR-281在幼蟲蛻皮階段時(shí)期維持在一個(gè)較高的水平;而在家蠶化蛹階段,受蛻皮激素的影響,miR-281表達(dá)量降低(Jiangetal., 2013)。在斜紋夜蛾中,miR-14-3p通過靶向蛻皮激素級(jí)聯(lián)基因ECR和E75而參與調(diào)控蛻皮激素信號(hào)通路(Luoetal., 2020)。然而,未見有novel miRNA參與調(diào)控蛻皮激素信號(hào)通路的報(bào)道。

基于miRNA在調(diào)控昆蟲的生命過程中的重要作用,實(shí)驗(yàn)室對(duì)斜紋夜蛾幼蟲中腸和頭部組織的miRNA進(jìn)行了深度測(cè)序與建庫,總共發(fā)現(xiàn)了530個(gè) miRNA,其中包含了413個(gè)新的miRNA,占總數(shù)的77.92%(Zouetal., 2020)。為了進(jìn)一步研究這些大量的novel miRNA在斜紋夜蛾體內(nèi)的功能與調(diào)控機(jī)制,選擇其中一個(gè)表達(dá)量較高的novel-m0287-3p作為研究對(duì)象,并利用生物信息學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行相關(guān)研究。結(jié)果表明,novel-m0287-3p在斜紋夜蛾體內(nèi)通過調(diào)控蛻皮激素受體而影響發(fā)育,可能是潛在的防治害蟲的核酸分子,具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試?yán)ハx

實(shí)驗(yàn)所用的斜紋夜蛾幼蟲和Spli-221細(xì)胞株來自中山大學(xué)昆蟲研究所。斜紋夜蛾幼蟲在溫度27±1℃、相對(duì)濕度70%±5%和光周期12 h光照∶12 h黑暗條件下,采用人工飼料飼養(yǎng)。而Spli-221細(xì)胞株在含有10%胎牛血清(FBS)昆蟲培養(yǎng)基(SF-900 Ⅲ SFM, GIBCO,Invitrogen,USA)中于28℃恒溫培養(yǎng),每隔2～3 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,并以1∶3的比例稀釋培養(yǎng)基后傳代培養(yǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑

Taq酶/Ex-Taq DNA聚合酶、DNA限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、pMD′18-T載體、dNTP、RT-PCR試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司(中國(guó));質(zhì)粒提取試劑盒及Gel Extraction Kit分別為美國(guó)Omega和美國(guó)Axygen公司的產(chǎn)品;FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑及熒光素酶的檢測(cè)試劑盒Dual Luciferase kit購自美國(guó)Promega公司;用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清和優(yōu)化培養(yǎng)基Opti-MEM以及SF900-Ⅲ(GIBCO,美國(guó))培養(yǎng)基購自Life公司(美國(guó))。novel-m0287-3p mimic和novel-m0287-3p agomir (模擬體類似物)及陰性對(duì)照NC (negative control,序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3′,為無義小片段)均由上海吉瑪基因股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA及蛋白的提取

總RNA的提取按照TaKaRa公司的RNA抽提試劑盒(Trizol Reagent)的方法并加以優(yōu)化。向組織材料中加入1 mL Trizol Reagent并充分研磨后于冰上靜置5～10 min,繼而加入氯仿∶異戊醇=24∶1(V/V)200 μL,劇烈震蕩15 s后冰上放置10 min,于12 000 rpm和4℃離心20 min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入等體積預(yù)冷異丙醇,上下顛倒混勻,-20℃放置30 min。再次離心20 min,棄上清。加入600 μL 75%乙醇上下顛倒洗滌RNA,離心5 min,棄上清。重復(fù)上述洗滌步驟一次。開蓋于室溫晾干沉淀15 min,最后用DEPC水溶解RNA,保存于-80℃。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄。miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用加尾法,miRNA首先在polyA聚合酶的作用下合成聚腺苷酸尾巴,再由oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄引物反向合成cDNA。具體步驟參考TaKaRa公司的Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR?qRT-PCR試劑盒說明書操作。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析

qPCR實(shí)驗(yàn)按照TaKaRa公司的2×SYBR?Premix EX TaqTMKit試劑盒的說明書進(jìn)行。當(dāng)用目的組織mRNA的cDNA作為qPCR模板時(shí),以斜紋夜蛾核糖體蛋白49基因(ribosomal protein 49 gene,rp49) (GenBank登錄號(hào): XM_022963351)為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s,60℃ 20 s,40個(gè)循環(huán);最后95℃ 60 s;50℃ 30 s;95℃ 30 s,1個(gè)循環(huán)。miRNA引物設(shè)計(jì)用premier 5.0軟件完成,本研究使用相關(guān)PCR的引物序列如表1所示。

表1 本研究所使用的引物

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶檢測(cè)

轉(zhuǎn)染前一天,將1 mL密度為2×105/mL的斜紋夜蛾Spli-221細(xì)胞加入12孔板的單孔中,培養(yǎng)細(xì)胞至密度達(dá)到80%～95%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí),每孔用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1 μg質(zhì)粒/0.5 μg模擬體(mimics)和3 μL的FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑,充分混勻并于室溫放置10～15 min;定時(shí)收集細(xì)胞用于檢測(cè)。用于構(gòu)建雙熒光素酶檢測(cè)的psicheck-2載體(Promega,美國(guó))內(nèi)部含有LUC(螢火蟲熒光素酶)和RLUC(海腎熒光素酶)基因,將斜紋夜蛾EcRb13′UTR的兩個(gè)靶位點(diǎn)片段分別構(gòu)建到海腎熒光素酶基因的3′UTR區(qū)域后,將載體分別與novel-m0287-3p mimics和NC mimics共轉(zhuǎn)染Spli-221細(xì)胞,使用Promega公司的Dual Luciferase kit試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 novel-m0287-3p的鑒定及其靶基因預(yù)測(cè)與分析

實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的中腸和頭部組織中miRNA的測(cè)序、建庫和分析,獲得了一系列miRNA序列(Zouetal., 2020)。本研究選擇了一個(gè)含量較高的novel-m0287-3p作為研究對(duì)象。為了開展其功能研究,首先確定novel-m0287-3p是否是一個(gè)新的miRNA。通過RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold. cgi)分析,發(fā)現(xiàn)novel-m0287-3p前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)特征,具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1-A)。novel-m0287-3p前體序列為:5′-AAATGCAAATTGTTGAATACATGACAAAATCCTGTA ATAGCATACATCATGATTTTGTCAAGTATTTCGCAAT TTTTATTC-3′,novel-m0287-3p成熟體序列(5′-TGATTTTGTCAAGTATTTCGCA-3′)位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個(gè)莖區(qū),長(zhǎng)度為22 bp,這與已知?jiǎng)游矬w內(nèi)Dicer酶的加工特征相一致。隨后將novel-m0287-3p成熟體序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(miRBase, http://www.mirbase.org)中已知的miRNA進(jìn)行比對(duì)(圖1-B),未發(fā)現(xiàn)有相似的miRNA。由此,可以確定novel-m0287-3p為新的miRNA。

圖1 novel-m0287-3p前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及與miRBase數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果Fig.1 Prediction of the secondary structure of novel-m0287-3p precursor and the results of comparison in the miRBase database注:A,novel-m0287-3p前體的二級(jí)結(jié)構(gòu);B,novel-m0287-3p成熟體序列在miRBase數(shù)據(jù)庫中比對(duì)的結(jié)果。Note: A,Secondary structure of the novel-m0287-3p precursor; B, Results of the novel-m0287-3p mature sequence alignment in the miRBase database.

2.2 novel-m0287-3p對(duì)斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響

為了研究novel-m0287-3p對(duì)斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響,分別選取斜紋夜蛾4齡第1天以及6齡第3天生長(zhǎng)狀況相一致的幼蟲進(jìn)行體腔注射novel-m0287-3p agomir(模擬體類似物)。每頭幼蟲注射10 μg agomir。與對(duì)照組相比,4齡第1天的幼蟲注射novel-m0287-3p agomir后,其體重增長(zhǎng)明顯減慢,說明其生長(zhǎng)受到抑制(圖2-A);而novel-m0287-3p agomir處理后的6齡幼蟲化蛹發(fā)生滯后(圖2-C),與正常蟲相比較,蟲的發(fā)育延緩一天進(jìn)入蛹期。綜合以上結(jié)果,推測(cè)novel-m0287-3p可能參與調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝,致使斜紋夜蛾生長(zhǎng)緩慢;也可能直接參與調(diào)控蛻皮激素信號(hào)通路,而影響斜紋夜蛾蛻皮及變態(tài)發(fā)育。

圖2 注射novel-m0287-3p對(duì)斜紋夜蛾4齡和6齡幼蟲發(fā)育的影響Fig.2 Effects of novel-m0287-3p injection on the development of the 4th instar (A) and the 6th instar (B) of Spodoptera litura注:A,注射novel-m0287-3p后4齡幼蟲的體重變化;B,4齡幼蟲注射novel-m0287-3p 72 h后的表型變化;C,注射novel-m0287-3p后對(duì)6齡幼蟲化蛹的影響;(1),6齡第4天;(2),6齡第5天;(3),6齡第6天;(4),蛹期;NC,模擬體的陰性對(duì)照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物。Note: A, Changes in body weight of 4th instar larvae after injection of novel-m0287-3p; B, Phenotypic changes of 4th instar larvae injected with novel-m0287-3p for 72 h; C, Effects of injection of novel-m0287-3p on pupation of 6th instar larvae; (1), 6LD4; (2), 6LD5; (3), 6LD6; (4), Pupation; NC, Negative control; novel-m0287-3p, novel-m0287-3p agomir; L, Larval; D, Day.

2.3 預(yù)測(cè)ECR是novel-m0287-3p的靶基因

由于novel-m0287-3p延后了幼蟲的蛻皮,因此分析novel-m0287-3p是否可能靶向蛻皮激素信號(hào)通路基因。蛻皮激素信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因蛻皮激素受體存在兩種構(gòu)型EcRA(XM_022963763)和EcRb1(XM_022963759),并且兩種構(gòu)型的3′UTR是一樣的(Luoetal., 2020)。通過PITA和RNAhybrid兩個(gè)軟件分析發(fā)現(xiàn),novel-m0287-3p在EcRb1的3′UTR中可能存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),分別處于3′UTR上的3 055及4 195位點(diǎn)(圖3-A、B)。

圖3 novel-m0287-3p在EcRb1 3′UTR的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Two binding sites in the EcR 3′UTR for novel-m0287-3p

將預(yù)測(cè)得到的2個(gè)長(zhǎng)度為100 bp、包含了可能與novel-m0287-3p結(jié)合位點(diǎn)的EcR3′UTR片段克隆到psi-check2質(zhì)粒中,并與合成的novel-m0287-3p模擬物共轉(zhuǎn)染到Spli-221細(xì)胞中。如果novel-m0287-3p能結(jié)合到上面預(yù)測(cè)靶位點(diǎn),則novel-m0287-3p進(jìn)入到細(xì)胞后,海腎熒光素酶mRNA會(huì)被降解或者抑制翻譯,海腎熒光素酶的活性因而降低。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,海腎熒光素酶活性降低(圖4-A、B),說明novel-m0287-3p能與靶基因EcR3′UTR結(jié)合,負(fù)調(diào)控靶基因EcRb1的表達(dá)。

圖4 novel-m0287-3p作用EcR 3′UTR的雙熒光素酶活性測(cè)定Fig.4 Determination of dual luciferase activity with theEcR 3′UTR regulated by novel-m0287-3p注:A,novel-m0287-3p與EcR 3′UTR上的3 055位點(diǎn)作用后的熒光強(qiáng)度;B,novel-m0287-3p與EcR 3′UTR上的4 195位點(diǎn)作用后的熒光強(qiáng)度;NC,模擬體類似物的陰性對(duì)照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物;**表示同一處理時(shí)間處理組與對(duì)照組間差異顯著P<0.01;***表示差異極顯著P<0.001,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Note:A, Fluorescence intensity of novel-m0287-3p interacting with site 3 055 on EcR 3′UTR; B, Fluorescence intensity of novel-m0287-3p interacting with site 4 195 on EcR 3′UTR; NC, Negative control; novel-m0287-3p, novel-m0287-3p mimics; ** showed significantly difference between treatments and control groups by student’s t test at 0.01 level; ***showed significantly difference between treatments by student’s t test at 0.001 level.

2.4 novel-m0287-3p和EcRb1在中腸中表達(dá)

為了進(jìn)一步研究novel-m0287-3p和EcR在蟲體中的關(guān)系,選取齡期最長(zhǎng)的6齡幼蟲作為研究對(duì)象,分別提取6齡第1天、第3天及第5天的斜紋夜蛾不同組織(頭部、中腸、脂肪體和表皮)的總RNA,反轉(zhuǎn)錄后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析兩者轉(zhuǎn)錄水平,分別以snRNAU6和rp49作為novel-m0287-3p和EcRA、EcRb1的內(nèi)參基因。結(jié)果顯示,在斜紋夜蛾6齡幼蟲的這3個(gè)時(shí)期的組織表達(dá)譜中,novel-m0287-3p都在中腸具有最高的表達(dá)量,而在其他組織幾乎無表達(dá),表明novel-m0287-3p主要是在中腸調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)(圖5-A);相同地,EcRb1在中腸中的表達(dá)量也比其他組織高,而EcRA在中腸的表達(dá)量相對(duì)較低,說明EcRb1為中腸EcR的主要表達(dá)形式(圖5-B、C)。表達(dá)譜分析的結(jié)果暗示兩者在斜紋夜蛾中腸可能存在互作關(guān)系。

圖5 novel-m0287-3p與EcRb1在斜紋夜蛾幼蟲的不同組織的表達(dá)譜分析Fig.5 novel-m0287-3p and EcRb1expression levels at different tissues of Spodoptera litura larvae注:A,novel-m0287-3p在各個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量;B,EcRb1在各個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量;C,EcRA在各個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量;L,幼蟲期;D,天;FB,脂肪體;MG,中腸;HD,頭部;EP,表皮。Note:A, Relative expression of novel-m0287-3p in various tissues; B, Relative expression of EcRb1 in various tissues; C, Relative expression of EcRA in various tissues; L, larva; D, day; FB, Fat body; MG, Midgut; HD, Head; EP, Epidermis.

2.5 novel-m0287-3p抑制EcRb1表達(dá)

蟲體內(nèi)novel-m0287-3p與EcRb1表達(dá)譜的結(jié)果暗示了novel-m0287-3p可能調(diào)控EcRb1表達(dá)。為了進(jìn)一步研究?jī)烧唛g的關(guān)系,選取4齡第1天、生長(zhǎng)狀況一致的斜紋夜蛾幼蟲進(jìn)行體腔注射novel-m0287-3p,每頭幼蟲注射10 μg miRNA。注射novel-m0287-3p 72 h后檢測(cè)中腸的EcRb1表達(dá)水平。結(jié)果顯示,注射novel-m0287-3p后,斜紋夜蛾中腸EcRb1的mRNA水平發(fā)生下調(diào)(圖6)。說明novel-m0287-3p能夠抑制斜紋夜蛾幼蟲EcRb1的表達(dá)。

圖6 注射novel-m0287-3p后斜紋夜蛾中腸的EcRb1表達(dá)水平分析Fig.6 Analysis of EcRb1 mRNA level in the Spodopteralitura midgut after novel-m0287-3p injection注:NC,模擬體類似物的陰性對(duì)照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物;*表示同一處理時(shí)間處理組與對(duì)照組間差異顯著P<0.05,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Note:NC, negative control;novel-m0287-3p, novel-m0287-3p mimics; *showed significantly difference between treatments and control groups by student’s t test at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

斜紋夜蛾的miRNA數(shù)據(jù)庫表明蟲體中存在大量novel miRNA(Zouetal., 2020),其功能不詳。而miRNA的鑒定方法主要有3種:克隆構(gòu)建cDNA文庫法,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和高通量測(cè)序法。在研究早期為了尋找和鑒定未發(fā)現(xiàn)的miRNA,主要通過克隆技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫,基因克隆適合生物體內(nèi)豐度較高miRNA的研究,而對(duì)于那些只在某些特定組織和細(xì)胞表達(dá)或者表達(dá)量低的miRNA則不適合(Chenetal., 2008; Zhouetal., 2009)。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)斜紋夜蛾幼蟲中腸組織的miRNA高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上,選擇其中一個(gè)本底表達(dá)量比較高的novel-m0287-3p進(jìn)行了序列鑒定和功能研究。通過RNAfold分析novel-m0287-3p的前體結(jié)構(gòu),并將其成熟體序列與miRBase數(shù)據(jù)庫的miRNA比對(duì),確定novel-m0287-3p是一個(gè)全新的miRNA(圖1)。

目前,用來進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件多種多樣,但主流的主要有以下幾種:TargetScanS、miRanda、PITA、RNAhybrid。盡管每個(gè)軟件之間的算法不盡相同,但遵循的原理基本一致,大體上分為以下幾點(diǎn):(1)miRNA與靶基因結(jié)合形成二級(jí)結(jié)構(gòu)間的熱力學(xué)穩(wěn)定性;(2)miRNA種子區(qū)域和靶基因的互補(bǔ)性;(3)靶基因及其靶位點(diǎn)在同源物種中的保守性;(4)miRNA與靶基因結(jié)合形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度(Lewisetal., 2004;John, 2004;Krüger and Rehmsmeier, 2006)。本實(shí)驗(yàn)使用PITA和RNAhybrid兩個(gè)在線軟件共同對(duì)novel-m0287-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),求其交集基因以提高結(jié)果的精準(zhǔn)度。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)novel-m0287-3p可能靶向蛻皮激素信號(hào)通路基因EcRb1(圖3)。

為了進(jìn)一步探究novel-m0287-3p的功能,本研究通過采用基因沉默技術(shù),用novel-m0287-3p模擬體類似物分別注射4齡與6齡幼蟲,皆得到了幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制的結(jié)果(圖2),并且發(fā)現(xiàn)在這些蟲中的EcRb1表達(dá)量下降(圖6)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明了novel-m0287-3p結(jié)合于EcRb13′UTR的兩個(gè)位點(diǎn)(圖4)。表明EcRb1是novel-m0287-3p的靶基因之一。蛻皮激素是調(diào)控昆蟲蛻皮與變態(tài)發(fā)育的重要因素,其受體EcR的表達(dá)下降將導(dǎo)致昆蟲不能正常蛻皮而生長(zhǎng)延緩,甚至死亡。因此,本研究證明了novel-m0287-3p在調(diào)控昆蟲發(fā)育中的功能,同時(shí)也證明了斜紋夜蛾中所存在的大量novel miRNA是具有功能的。

已有研究表明miRNA調(diào)控EcR的表達(dá)。在家蠶中,馬氏管特異性表達(dá)的miR-281調(diào)控靶標(biāo)基因Bm-EcR的表達(dá)(Jiangetal., 2013);在果蠅中,miR-14通過靶向基因EcR而調(diào)控蛻皮激素信號(hào)通路(Varghese and Cohen, 2007);在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中,針對(duì)靶基因Ha-EcR設(shè)計(jì)的人造miRNA可以影響棉鈴蟲的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)卵量(Yogindran and Manchikatla, 2016)。本研究的結(jié)果表明novel-m0287-3p通過結(jié)合3′UTR而調(diào)控EcR的表達(dá)。這些結(jié)果表明了不同物種中的EcR受不同miRNA的調(diào)控。由于每個(gè)基因有可能受多個(gè)miRNA的調(diào)控,因此,僅novel-m0287-3p不能完全抑制EcR的表達(dá)(圖6),這可能是注射novel-m0287-3p不能完全控制斜紋夜蛾蛻皮的原因(圖2)。同時(shí),通過預(yù)測(cè),本研究發(fā)現(xiàn)novel-m0287-3p可能靶向相關(guān)營(yíng)養(yǎng)代謝通路基因。因此,注射novel-m0287-3p后的斜紋夜蛾發(fā)育延緩也可能是營(yíng)養(yǎng)代謝受到影響的緣故,這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中利用熒光定量PCR的方法分析了novel-m0287-3p和EcRb1的時(shí)空表達(dá)譜(圖5),發(fā)現(xiàn)novel-m0287-3p具有中腸特異性表達(dá)的特點(diǎn),表明novel-m0287-3p在主要是在中腸調(diào)控靶基因而發(fā)揮作用,可能調(diào)控EcR在中腸的表達(dá)量較高的基因EcRb1。兩者的時(shí)空表達(dá)譜以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明兩者在中腸發(fā)生關(guān)系,而調(diào)控圍食膜的發(fā)育。通過向斜紋夜蛾幼蟲血淋巴注射novel-m0287-3p agomir及其陰性對(duì)照NC agomir,并對(duì)中腸中EcRb1的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,注射novel-m0287-3p后斜紋夜蛾體內(nèi)EcRb1的mRNA水平發(fā)生下調(diào),說明所注射的novel-m0287-3p能夠運(yùn)輸至中腸,抑制中腸內(nèi)EcRb1的表達(dá)。

綜上所述,本研究通過表達(dá)譜分析、結(jié)合實(shí)驗(yàn)和敲除實(shí)驗(yàn),證明了novel-m0287-3p對(duì)斜紋夜蛾中腸EcRb1表達(dá)的調(diào)控,從而證明了novel-m0287-3p在斜紋夜蛾發(fā)育中的功能。