楊麗君,李紅衛(wèi),李向永,諶愛東,于艷雪*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢驗(yàn)與檢疫研究所,北京 100176;2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京 100193;3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所,昆明 650205)

蝗蟲災(zāi)害是國(guó)際性的自然生物災(zāi)害,涉及多個(gè)國(guó)家和地區(qū),對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和環(huán)境造成嚴(yán)重影響(涂雄兵等, 2021)。

昆蟲腸道是昆蟲存儲(chǔ)食物、消化和排泄的場(chǎng)所,其中定殖著大量的微生物,與宿主在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了緊密的互利共生關(guān)系(Engel and Moran, 2013)。一方面,腸道微生物不僅影響昆蟲對(duì)植物組織的消化吸收和信息化合物的合成,而且還會(huì)為宿主提供重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提高宿主防御和解毒能力,進(jìn)而影響宿主昆蟲的選擇、繁殖和發(fā)育周期等行為(Fischeretal., 2017; 周帆等, 2020)。另一方面,腸道微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性與昆蟲種類、齡期、生存環(huán)境、食物的喂養(yǎng)條件和消化道形態(tài)等因素息息相關(guān)(魯迎新等, 2016; 程代鳳等, 2021)。近年來,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,對(duì)昆蟲腸道微生物的研究逐步加深,利用腸道微生物控制害蟲的新理論和新策略也越來越受到廣泛關(guān)注,并且其中部分研究已成功付諸于實(shí)踐(王四寶和曲爽, 2017; 侯璐文等, 2019)。

鑒于昆蟲腸道微生物的重要性,相關(guān)研究已越來越受國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視。葉國(guó)浚等人通過對(duì)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda腸道微生物宏基因組初步分析,鑒定出其優(yōu)勢(shì)菌屬(葉國(guó)浚等,2021);章雨璐等人通過對(duì)椰心葉甲BrontispalongissimiGestro腸道共生菌進(jìn)行分離培養(yǎng),鑒定其相關(guān)功能并探究腸道共生菌對(duì)椰心葉甲環(huán)境適應(yīng)性作用(章雨璐等, 2021);羅曼等人采用純培養(yǎng)法對(duì)云南地區(qū)的思茅松毛蟲DendrolimukikuchiiMatsumura 3齡幼蟲進(jìn)行腸道細(xì)菌多樣性的研究,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬為該蟲的優(yōu)勢(shì)菌群(羅曼等, 2021);魏博帆等人通過研究不同腸道微生物對(duì)無菌果蠅和正常果蠅交配行為的影響,證明植物乳桿菌可通過延長(zhǎng)交配潛伏期影響果蠅的交配行為(魏博帆等, 2021)。

黃脊竹蝗CeracriskiangsuTsai是竹蝗屬昆蟲中分布廣泛及危害嚴(yán)重的林業(yè)害蟲之一,其食性雜、分布廣、遷飛性強(qiáng),食物不足或大發(fā)生時(shí)也可為害農(nóng)田糧食作物(程佳等, 2010;倉(cāng)曉燕等, 2020)。其防治技術(shù)多為利用人尿進(jìn)行誘集和大量使用化學(xué)藥劑,但隨著可持續(xù)防治理念逐漸深化,生物防治方法的研究與應(yīng)用越來越廣泛(李紅梅等, 2021)。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)記載,氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、光照和風(fēng)速對(duì)黃脊竹蝗的生長(zhǎng)、產(chǎn)卵和遷飛具有顯著影響(李建江, 1998; 張賢開和左玉香, 2005; 張衛(wèi)東等, 2012),較少報(bào)道關(guān)于揭示性別和非生物因子對(duì)黃脊竹蝗腸道微生物的作用機(jī)制。因此,本文通過利用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)新入侵地區(qū)和國(guó)內(nèi)常發(fā)地區(qū)的黃脊竹蝗腸道微生物多樣性進(jìn)行研究,分析不同地理分布、性別及環(huán)境因子對(duì)黃脊竹蝗腸道微生物的影響,探尋蝗蟲地理溯源,為開發(fā)微生物制劑和提高綜合防治技術(shù)提供新思路,以保障世界糧食生產(chǎn)安全。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx

采集了3個(gè)地區(qū)的黃脊竹蝗,其中云南省普洱市江城縣是2020年新入侵地區(qū),湖南省益陽市桃江縣和湖南省邵陽市新寧縣是國(guó)內(nèi)常發(fā)地區(qū)。具體信息見表1。

表1 黃脊竹蝗采集信息表

1.1.2地理環(huán)境因子數(shù)據(jù)

在國(guó)家氣象數(shù)據(jù)中心下載黃脊竹蝗采集地的5年平均氣相數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析(表2)。其中,平均氣溫的代號(hào)為T;降水量的代號(hào)為P;相對(duì)濕度的代號(hào)為RH;日照時(shí)數(shù)的代號(hào)為SUN;風(fēng)速的代號(hào)為WVEL;蒸發(fā)量的代號(hào)為EVA;平均氣壓的代號(hào)為Pa;地面溫度的代號(hào)為GND。

表2 不同地理位置2017-2020年平均氣象條件數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.2 方法

1.2.1黃脊竹蝗樣品收集

隨機(jī)選取不同地理位置的黃脊竹蝗做6個(gè)重復(fù)處理,其中每頭為一個(gè)處理。每個(gè)地理位置蝗蟲雌雄蟲各3頭,用酒精和PBS溶液分別沖洗兩遍,每次1 min;將清洗后的蟲體放在蠟盤上進(jìn)行解剖,取出后腸放入離心管中,每頭放入一個(gè)2 mL離心管中,然后在研磨機(jī)上研磨,研磨結(jié)束放入冰箱。

1.2.2腸道微生物基因組提取及檢測(cè)

按照試劑盒的步驟提取樣本組織DNA:

(1)將研磨結(jié)束放置冰箱的樣品取出置于冰上。

(2)向每個(gè)樣品中加入1 mL Inhibit EX Buffer,渦旋持續(xù)1 min,直至樣品混均。

(3)將混合液放入70℃的水浴鍋中加熱 5 min,渦旋15 s,室溫下20 000 xg離心樣品1 min。

(4)向一個(gè)新的1.5 mL離心管中加入15 μL Proteinase K,然后從步驟3中轉(zhuǎn)移200 μL上清液加入。

(5)在混合液中加入200 μL Buffer AL,渦旋混勻,將混合液放入70℃的水浴鍋中孵育10 min。

(6)向混合液中加入200 μL(96%～100%)酒精,渦旋充分混合。

(7)將步驟6中的全部混合液滴到新QIAamp離心柱的中央,離心1 min,丟棄沉淀物。

(8)加入500 μL Buffer AW1,離心1 min,丟棄含濾液的管。

(9)加入500 μL Buffer AW2,離心3 min,丟棄含濾液的管。

(10)將離心柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL微量離心管中,將200 μL Buffer ATE滴到QIAamp膜中央位置。室溫孵育1 min,然后20 000 xg離心1 min洗脫DNA。

(11)對(duì)提取的DNA進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3PCR擴(kuò)增和純化

將提取的黃脊竹蝗腸道基因組DNA作為PCR的模板,采用16S V3-V4擴(kuò)增引物(341 F: 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806 R: 5′-GGACTAC NNGGGTATCTAAT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。然后根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度為2%瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物,割膠回收目標(biāo)條帶。

1.2.4文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè),合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定的干擾數(shù)據(jù),為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,首先根據(jù)barcode進(jìn)行拆分獲得每個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù),并去除barcode和引物,使用FLASH軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。隨后通過質(zhì)控得到Clean Tags,再進(jìn)行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。最后基于有效數(shù)據(jù)通過DADA2進(jìn)行降噪,并過濾掉豐度小于5的序列,從而獲得最終的ASVs(Lietal., 2020)。

對(duì)于得到的ASVs(Callahanetal., 2017),一方面對(duì)每個(gè)ASV的代表序列做物種注釋,得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況,進(jìn)行Alpha多樣性分析,以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息等。另一方面,可以對(duì)ASVs進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過無度量多維標(biāo)定法(NMDS),探究不同樣本或組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。最后,進(jìn)一步挖掘分組樣本間的群落結(jié)構(gòu)差異,選用LEfSe統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),用Spearman秩相關(guān)來研究環(huán)境因子與微生物種豐富度之間的相互變化關(guān)系,得到兩兩之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析

通過Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)不同地理分布的黃脊竹蝗腸道微生物16S的V3～V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)不同地理分布和性別的黃脊竹蝗腸道菌群測(cè)序所得的條帶數(shù)都有所差異(表3)。其中來自湖南省邵陽市新寧縣的雌成蟲(HSXA-F)樣品得到的優(yōu)化序列數(shù)最多(104 993條),湖南省邵陽市新寧縣的雄成蟲(HSXA-M)樣品優(yōu)化序列數(shù)量最少(95 742條)。6個(gè)樣品通過測(cè)序平均得到103 136對(duì)Reads,經(jīng)拼接、過濾后共平均產(chǎn)生100 824條Clean Tags,有效序列所占比例為97.7%,樣品的測(cè)序準(zhǔn)確度較好,滿足分析標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)樣品分別獲得的OTU數(shù)目如表3所示:對(duì)比不同地理位置的成蟲,OTU數(shù)目最多的是湖南省益陽市桃江縣的成蟲,最少的是湖南省邵陽市新寧縣的成蟲;對(duì)比不同性別的成蟲,3個(gè)地區(qū)的黃脊竹蝗雌雄蟲腸道OTU個(gè)數(shù)沒有顯著差異。各個(gè)地理分布的黃脊竹蝗腸道微生物在不同的分類階元注釋出的物種數(shù)目如表3所示:其中云南省普洱市江城縣雄蟲(YPJA-M)樣品在各個(gè)分類階元所得到的注釋數(shù)均略高于其他樣品,有22個(gè)門,34個(gè)綱,82個(gè)目,145個(gè)科,282個(gè)屬,362個(gè)種。湖南省邵陽市新寧縣雄蟲(HSXA-M)樣品在各個(gè)分類階元的注釋數(shù)均略低于其他樣品。

表3 黃脊竹蝗腸道細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序基本信息

2.2 黃脊竹蝗腸道微生物的組成分析

黃脊竹蝗腸道樣本在門分類階元水平上的微生物群落組成如圖1所示。主要有綠彎菌門Chloroflexi、酸桿菌門Acidobacteriota、Planctomycetota、粘球菌門Mvxococcota、梭桿菌門Fusobacteriota、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteriota、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria等。湖南省益陽市桃江縣(HYT)、湖南省邵陽市新寧縣(HSX)和云南省普洱市江城縣(YPJ)3個(gè)地理位置樣品的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門(46.7%、77.0%、64.3%)。其中湖南省邵陽市新寧縣(HSX)的次優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門(19.0%)和厚壁菌門(18.5%),云南省普洱市江城縣(YPJ)的次優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(20.2%),湖南省益陽市桃江縣(HYT)的次優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(11.4%)和放線菌門(11.3%)。3個(gè)地區(qū)不同性別樣品的腸道菌群門水平組成差異不顯著。

圖1 不同地理種群的黃脊竹蝗前十個(gè)腸道菌群組成Fig.1 Composition of the top ten gut microbiota of Ceracris kiangsu in different geographical populations

在綱分類階元水平上,黃脊竹蝗腸道微生物主要有嗜熱油菌綱Thermoleophilia、梭桿菌綱Fusobacteria、Myxococcia、梭菌綱Clostridia、藍(lán)藻綱Cyanobacteriia、擬桿菌綱Bacteroidia、α-變形菌綱Alphaproteobacteria、放線菌綱Actinobacteria、芽孢桿菌綱Bacilli、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria等。湖南省益陽市桃江縣(HYT)、湖南省邵陽市新寧縣(HSX)和云南省普洱市江城縣(YPJ)3個(gè)地理位置樣品的優(yōu)勢(shì)菌綱均為 γ-變形菌綱(31.4%、75.9%、55.1%)。其中湖南省邵陽市新寧縣(HSX)的次優(yōu)勢(shì)菌綱為芽孢桿菌綱(17.0%),云南省普洱市江城縣(YPJ)的次優(yōu)勢(shì)菌綱為放線菌綱(10.8%),湖南省益陽市桃江縣(HYT)的次優(yōu)勢(shì)菌綱為放線菌綱(17.5%)、芽孢桿菌綱(15.3%)和 α-變形菌綱(15.3%)。3個(gè)地區(qū)不同性別樣品的腸道菌群綱水平組成沒有顯著差異。

在目分類階元水平上,黃脊竹蝗腸道微生物主要有伯克氏菌目Burkholderiales、小單孢菌目Micromonosporales、黃桿菌目Flavobacteriales、蟲原體目Entomoplasmatales、微球菌目Micrococcales、根瘤菌目Rhizobiales、乳桿菌目Lactobacillales、假單胞菌目Pseudomonadales、腸桿菌目Enterobacterales等。湖南省益陽市桃江縣(HYT)、湖南省邵陽市新寧縣(HSX)和云南省普洱市江城縣(YPJ)3個(gè)地理位置樣品的優(yōu)勢(shì)菌目均為腸桿菌目(25.7%、60.4%、50.2%)。其中湖南省邵陽市新寧縣(HSX)的次優(yōu)勢(shì)菌目為乳桿菌目(16.3%)和假單胞菌目(14.3%),云南省普洱市江城縣(YPJ)的次優(yōu)勢(shì)菌目為其他(10%),湖南省益陽市桃江縣(HYT)的次優(yōu)勢(shì)菌目為乳桿菌目(12.6%)和根瘤菌目(11.2%)。3個(gè)地區(qū)不同性別樣品的腸道菌群目水平組成沒有顯著差異。

在科分類階元水平上,黃脊竹蝗腸道微生物主要有黃色桿菌科Xanthobacteraceae、周蝶菌科Weeksellaceae、微桿菌科Microbacteriaceae、螺原體科Spiroplasmataceae、歐文菌科Erwiniaceae、鏈球菌科Streptococcaceae、腸球菌科Enterococcaceae、莫拉氏菌科Moraxellaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae等。其中湖南省益陽市桃江縣(HYT)、湖南省邵陽市新寧縣(HSX)和云南省普洱市江城縣(YPJ)3個(gè)地理位置樣品的優(yōu)勢(shì)菌科均為腸桿菌科(24.3%、53.6%、39.5%)。其中湖南省邵陽市新寧縣(HSX)的次優(yōu)勢(shì)菌科為莫拉氏菌科(12.1%)和腸球菌科(9.7%),云南省普洱市江城縣(YPJ)的次優(yōu)勢(shì)菌科為其他(5%),湖南省益陽市桃江縣(HYT)的次優(yōu)勢(shì)菌科為鏈球菌科(6.1%)、梭菌科(5.3%)和腸球菌科(4.6%)。3個(gè)地區(qū)不同性別樣品的腸道菌群科水平組成沒有顯著差異。

在屬分類階元水平上,黃脊竹蝗腸道微生物主要有Pseudocitrobacter、李長(zhǎng)文氏赤水河菌屬Chishuiella、短小桿菌屬Curtobacterium、螺原體屬Spiroplasma、泛菌屬Pantoea、乳球菌屬Lactococcus、腸球菌屬Enterococcus、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、腸桿菌屬Enterobacter等。湖南省益陽市桃江縣(HYT)樣品的次優(yōu)勢(shì)菌屬有乳球菌屬(6.0%)、腸桿菌屬(4.8%)和腸球菌屬(4.6%)。云南省普洱市江城縣(YPJ)樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬(27.5%),次優(yōu)勢(shì)菌屬為其他(5%)。湖南省邵陽市新寧縣(HSX)樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬(16.8%),次優(yōu)勢(shì)菌屬為不動(dòng)桿菌屬(12.1%)和腸球菌屬(9.7%)。3個(gè)地區(qū)不同性別樣品的腸道菌群屬水平組成和豐度具有顯著差異。其中,湖南省益陽市桃江縣(HYT)的雌、雄樣品優(yōu)勢(shì)菌屬分別為乳球菌屬(9.0%、2.9%)和腸桿菌屬(3.7%、5.9%),云南省普洱市江城縣(YPJ)的雌、雄樣品優(yōu)勢(shì)菌屬均為腸桿菌屬(27.9%、27.0%),湖南省邵陽市新寧縣(HSX)的雌、雄樣品優(yōu)勢(shì)菌屬分別為腸桿菌屬(29.9%、3.5%)和乳球菌屬(0.4%、12.0%)。

2.3 黃脊竹蝗腸道微生物Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)評(píng)估可以反映樣本內(nèi)菌群的多樣性。本研究選用的Alpha多樣性指數(shù)為Chao 1、Goods_coverage、Shannon和Simpson指數(shù)(表4)。其中,Chao 1值越大,表示樣品群落中低豐度物種最多;Shannon和Simpson指數(shù)值越大,表示樣品中群落豐富度和均勻度越高。結(jié)果顯示:不同地理分布和性別的黃脊竹蝗腸道微生物多樣性各不相同。其中Chao 1值最大的為湖南省益陽市桃江縣的雄蟲(HYTA-M),樣品群落中低豐度物種最多,最小的為湖南省邵陽市新寧縣的雄蟲(HSXA-M),樣品群落中低豐度物種最少。從Shannon和Simpson指數(shù)可以看出,湖南省益陽市桃江縣雌蟲(HYTA-F)的物種豐富度和均勻度最高,而湖南省邵陽市新寧縣雌蟲(HSXA-F)的物種豐富度和均勻度最低。從Goods_coverage來看,所有地理種群樣品的Goods_coverage指數(shù)均接近于1,說明樣品中序列檢測(cè)率很高,該測(cè)序結(jié)果基本符合樣品中腸道微生物的真實(shí)情況。

表4 黃脊竹蝗不同地理種群腸道微生物Alpha多樣性分析

2.4 黃脊竹蝗腸道微生物Beta多樣性分析

為探究不同地理分布的黃脊竹蝗腸道微生物組成差別,本研究根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的屬,繪制了物種豐度聚類熱圖。結(jié)果如圖2所示:從性別來看,3個(gè)地區(qū)雌雄樣品的菌群組成都具有顯著差異;從不同地理位置來看,幾乎沒有3個(gè)地理品種共有且豐度較高的菌屬,這說明不同地理種群的黃脊竹蝗腸道微生物組成具有明顯差異。

為了更直觀的對(duì)不同地理分布黃脊竹蝗腸道微生物的差異進(jìn)行聚類分析,本研究采用了NMDS方法。該方法根據(jù)樣本中包含的物種信息,以點(diǎn)的形式反映在多維空間上,反映樣本的組間和組內(nèi)差異,有效克服線性模型的缺點(diǎn),更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)(Rivasetal., 2013)。結(jié)果顯示(圖3-A),不同地理種群的黃脊竹蝗腸道微生物差異較大,其中差異最大的兩組為湖南省邵陽市新寧縣雌蟲(HSXA-F)和云南省普洱市江城縣雌蟲(YPJA-F)。

進(jìn)一步深入分析,采用LEfSe分析法(圖3-B)。該分析方法可用于進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)分組的比較,強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計(jì)意義和生物相關(guān)性,能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。結(jié)果顯示湖南省邵陽市新寧縣雌蟲(HSXA-F)組中的o_Pseudomonadales、g_Acinetobacter、f_Moraxellaceae等細(xì)菌的豐度顯著高于云南省普洱市江城縣雌蟲(YPJA-F),而云南省普洱市江城縣雌蟲(YPJA-F)中的g_Fusobacterium豐度顯著高于湖南省邵陽市新寧縣雌蟲(HSXA-F)。

2.5 地理環(huán)境因子與黃脊竹蝗腸道微生物結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

地理位置的差異會(huì)導(dǎo)致環(huán)境因子不同,環(huán)境因子與蝗蟲的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)。為研究不同地理位置的環(huán)境因素與黃脊竹蝗腸道菌群之間的關(guān)系,采用Spearman相關(guān)性分析方法對(duì)其進(jìn)行研究。結(jié)果如圖4,α多樣性中的Chao 1、Dominance、Observed_otus、Pielou_e、Shannon、Simpson指數(shù)都與環(huán)境因子的蒸發(fā)量顯著相關(guān),且Dominance和Simpson指數(shù)與相對(duì)濕度和平均氣壓顯著相關(guān),說明這3個(gè)環(huán)境因子都影響了黃脊竹蝗腸道菌群多樣性。

圖4 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析Fig.4 Analysis of environmental factors of Ceracriskiangsu in different geographical populations

在分類階元門水平上(圖5),平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速、蒸發(fā)量和地面溫度與黃脊竹蝗腸道微生物中的梭桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門、謎古菌門Aenigmarchaeota、變形菌門、Desulfobacterota、廣古菌門Euryarchaeota、蛭弧菌門Bdellovibrionota、髕骨細(xì)菌門Patescibacteria顯著相關(guān)。此外,蒸發(fā)量還與變形菌門、綠彎菌門、疣微菌門Verrucomicrobiota和芽單胞菌門Gemmatimonadota顯著相關(guān)。

圖5 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析(門水平)Fig.5 Analysis of environmental factors of Ceracris kiangsu in different geographical populations (Phylum level)

在分類階元綱水平上(圖6),平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速、蒸發(fā)量和地面溫度與黃脊竹蝗腸道微生物中的放線菌綱、藍(lán)藻綱、酸微菌綱Acidimicrobiia、甲烷桿菌綱Methanobacteria、Desulfovibrionia、脫硫單胞菌綱Desulfuromonadia顯著相關(guān)。平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速和地面溫度與芽孢桿菌綱、厚壁菌綱Negativicutes、Oligoflexia顯著相關(guān)。此外,蒸發(fā)量還與γ-變形菌綱、疣微菌綱Verrucomicrobiae、Saccharimonadia、芽單胞菌綱Gemmatimonadetes顯著相關(guān)。

圖6 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析(綱水平)Fig.6 Analysis of environmental factors of Ceracris kiangsu in different geographical populations (Class level)

在分類階元目水平上(圖7),平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速和地面溫度與黃脊竹蝗腸道微生物中的假單胞菌目、乳桿菌目、蟲原體目、鞘脂單胞菌目Sphingomonadales、Peptostreptocoocale. Tissierellales、梭桿菌目Fusobacteriales、梭菌目Clostridiales、Veillonellales. Selenomonadales、假諾卡氏菌目Pseudonocardiales顯著相關(guān)。相對(duì)濕度與乳桿菌目、Solirubrobacterales和梭桿菌目顯著相關(guān)。而蒸發(fā)量與假單胞菌目、腸桿菌目、微球菌目、根瘤菌目、弗蘭克氏菌目Frankiales、立克次體目Rickettsiales、丙酸桿菌目Propionibacteriales、醋桿菌目Acetobacterales、Solirubrobacterales、假諾卡氏菌目Pseudonocardiales顯著相關(guān)。平均氣壓與乳桿菌目、Solirubrobacterales、梭桿菌目顯著相關(guān)。

圖7 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析(目水平)Fig.7 Analysis of environmental factors of Ceracris kiangsu in different geographical populations (Order level)Note:V.S.,Veillonellales. Selenomonadales;R.T.,Peptostreptocoocale. Tissierellales。

在分類階元科水平上(圖8),平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速和地面溫度與黃脊竹蝗腸道微生物中的腸球菌科、Streptoooccaceae、螺原體科、拜葉林克氏菌科Beijerinckiaceae、鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae、分支桿菌科Mycobacteriaceae、消化鏈球菌科Peptostreptocoocaceae、梭桿菌科Fusobacteriaceae、假單胞菌科Pseudomonadaceae顯著相關(guān)。相對(duì)濕度與梭桿菌科Fusobacteriaceae、鏈球菌科、腸球菌科顯著相關(guān)。蒸發(fā)量與根瘤菌科Rhizobiaceae、Microbacteriaceae、拜葉林克氏菌科Beijerinckiaceae、分支桿菌科Mycobacteriaceae、Mitochondria、德沃氏菌科Devosiaceae、假單胞菌科、類諾卡氏科Nocardioidaceae和醋桿菌科Acetobacteraceae顯著相關(guān)。平均氣壓與腸球菌科、鏈球菌科和梭桿菌科顯著相關(guān)。

圖8 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析(科水平)Fig.8 Analysis of environmental factors of Ceracris kiangsu in different geographical populations (Family level)

在分類階元屬水平上(圖9),平均氣溫、降水量、日照時(shí)數(shù)、風(fēng)速和地面溫度與黃脊竹蝗腸道微生物中的乳球菌屬、腸球菌屬、螺原體屬、短小桿菌屬、Peptoclostridium、Allorhizobium.Neorhizobium.Pararhizobium.Rhizobium、不動(dòng)桿菌屬、Mycobactenium、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、假單胞菌屬Pseudomonas、Methylobacterium.Methylorubrum、Burkholderia.Caballeronia.Paraburkholderia、Lysinibacillus、梭桿菌屬Fusobacterium顯著相關(guān)。相對(duì)濕度和平均氣壓與乳球菌屬、腸球菌屬和梭桿菌屬顯著相關(guān)。蒸發(fā)量與短小桿菌屬、類諾卡氏屬Nocardioides、亮桿菌屬Leucobacter、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium、Allorhizobium.Neorhizobium.Pararhizobium.Rhizobium、假單胞菌屬、Methylobacterium.Methylorubrum、Mitochondria、德沃斯氏菌屬Devosia顯著相關(guān)。

圖9 不同地理種群黃脊竹蝗的環(huán)境因子分析(屬水平)Fig.9 Analysis of environmental factors of Ceracris kiangsu in different geographical populations (Genus level)Note:B.C.P.,Burkholderia. Caballeronia. Paraburkholderia;M.M.,Methylobacterium. Methylorubrum;A.N.P.R.,Allorhizobium. Neorhizobium. Pararhizobium. Rhizobium.

3 結(jié)論與討論

2020年6月黃脊竹蝗從老撾和越南等地遷飛進(jìn)入我國(guó)云南邊境地區(qū),由于種群數(shù)量激增,取食范圍擴(kuò)展至大田作物,波及范圍9 000 ha,其中農(nóng)田約2 133 ha,林地約6 866 ha,對(duì)云南邊境地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害,引起社會(huì)廣泛關(guān)注(李永華和劉勇波, 2021; 趙紫華等, 2021; 卓富彥等, 2021)。

蝗蟲的群居型特征是造成蝗蟲數(shù)量暴發(fā)成災(zāi)的特征之一,蝗蟲腸道微生物與聚集信息素的合成與釋放密切相關(guān)。通過分析昆蟲腸道微生物的多樣性及外在條件刺激下的菌群結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化,可以進(jìn)一步了解宿主昆蟲和腸道微生物間的關(guān)系(杭蘇琴, 2007),對(duì)于昆蟲的生命活動(dòng)和生理代謝具有重要意義。關(guān)于蝗蟲腸道微生物多樣性的研究,近年來也可見一些報(bào)道。Dillon對(duì)沙漠蝗SchistocercagregariaForskal腸道微生物在饑餓和蟲齡兩個(gè)影響因子作用下的多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示細(xì)菌多樣性與蝗蟲年齡成正比,而受饑餓的蝗蟲通常容易發(fā)生疾病(Dillonetal., 2010);Su等人通過研究16種蝗蟲的腸道共生菌,發(fā)現(xiàn)纖維素分解酶和腸道微生物群落可能反映了不同種類的蝗蟲與其攝食方式的聯(lián)系(Suetal., 2014);徐沖等人從東亞飛蝗LocustamigratoriamanilensisMeyen腸道內(nèi)分離出12株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌,并對(duì)其中一株酶活性較高的菌株進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn),鑒定為蠟樣芽胞桿菌(徐沖等, 2016)。

本研究通過分析我國(guó)新入侵地區(qū)和國(guó)內(nèi)常發(fā)地區(qū)的黃脊竹蝗腸道微生物多樣性,為研發(fā)微生物制劑和綜合防控提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于黃脊竹蝗來說,不同地理分布和性別的腸道內(nèi)微生物多樣性與豐富度不同。其中,地理位置影響最為顯著,其次為性別因素。對(duì)比不同分布區(qū)域的黃脊竹蝗腸道微生物多樣性,結(jié)果顯示湖南省邵陽市新寧縣和云南省普洱市江城縣的差異最大。2020年黃脊竹蝗從境外遷入我國(guó)云南境內(nèi),由于該地氣候環(huán)境適宜且食物充足,造成該蟲大量繁殖危害(卓富彥等, 2020)。推測(cè)此次在云南省普洱市江城縣采集到的黃脊竹蝗應(yīng)該來自于境外遷入,因而兩地的黃脊竹蝗腸道微生物多樣性差異最大。通過對(duì)比不同性別的黃脊竹蝗,結(jié)果顯示雌雄蝗蟲的腸道菌群在屬水平組成上具有顯著差異。有研究表明不同性別的昆蟲體內(nèi)微生物多樣性與豐度存在差異,例如中華通草蛉ChrysopasinicaTjeder雌雄群體間的腸道微生物在屬水平組成存在差異,該研究推測(cè)差異原因是由于雄雌成蟲生理代謝的不同引起微生物菌群的差異(趙輝等, 2017)。目前僅有研究表明黃脊竹蝗食葉量隨蟲齡的增長(zhǎng)而增加,雌蝗的食葉量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄蝗(練佑明等, 1995),有關(guān)黃脊竹蝗雌雄個(gè)體腸道微生物差異性機(jī)理還少有研究。

研究表明,不同的環(huán)境條件會(huì)影響棲居于昆蟲腸道內(nèi)的共生微生物與其宿主之間的相互作用,進(jìn)而微生物的種類及分布也會(huì)受到影響(Schmidetal., 2015;Donkersleyetal., 2017)。本研究所選取的8個(gè)環(huán)境因子中對(duì)黃脊竹蝗腸道微生物影響最大的為蒸發(fā)量、相對(duì)濕度和平均氣壓。以往研究發(fā)現(xiàn),盡管不同種類的昆蟲腸道菌優(yōu)勢(shì)門存在差異,但變形菌門均是最主要的腸道細(xì)菌群體之一(Yunetal., 2014),本研究中關(guān)于黃脊竹蝗優(yōu)勢(shì)菌門的分析也支持上述結(jié)果。

近年來,由于環(huán)境氣候不斷變化,黃脊竹蝗入侵頻率逐年增加,防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻(卓富彥等, 2020)?；认x的群居覓食活動(dòng)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的破壞,有研究表明蝗蟲糞球中所含的芳香族化合物聚集信息素是維持昆蟲群體聚集的關(guān)鍵因素之一,而腸道微生物的次生代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和少量苯酚是合成聚集信息素的必要組分(Dillonetal., 2010)。因此,通過進(jìn)行蝗蟲腸道微生物的相關(guān)性研究,可為害蟲生物防治提供理論指導(dǎo)。作為生態(tài)系統(tǒng)中的因素,蝗蟲還將長(zhǎng)期存在,人類與蝗蟲爭(zhēng)奪糧食和牧草等斗爭(zhēng)也將是長(zhǎng)期的。因此,未來仍不能放松警惕,要徹底貫徹“改治并舉”的治蝗工作方針,將治蝗準(zhǔn)則牢記于心,努力實(shí)現(xiàn)“蟲口奪糧”。