王 存 鄒曉川 黃遠(yuǎn)波 胡 靜 鄧明川 馮 霞

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067)

0 引 言

凝血酶(TB)是一種絲氨酸蛋白酶，能夠促進(jìn)血液凝固，調(diào)節(jié)凝血功能，對(duì)揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制、早期診斷和療效具有重要意義[1-2]。由于血液中TB 的濃度非常低，檢測困難，因此建立一種簡單、快速、高靈敏度的TB 檢測方法具有重要意義[3]。近年來，化學(xué)發(fā)光[4]、表面等離子體共振[5]、熒光[6]和電化學(xué)方法[7]等已被用于TB 的檢測。然而，這些方法大多存在操作復(fù)雜、成本高、設(shè)備規(guī)模大、價(jià)格昂貴等問題。其中，電化學(xué)適體傳感器因儀器小型化、成本低廉、響應(yīng)迅速及靈敏度高等特點(diǎn)而備受關(guān)注。

電化學(xué)適體傳感器有效結(jié)合了傳感器的高靈敏度與生物識(shí)別的高特異性，能顯著提高相關(guān)生物分子檢測的靈敏度和選擇性，在蛋白質(zhì)檢測和臨床分析等研究中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[8]。信號(hào)探針的制備是電化學(xué)適體傳感器應(yīng)用推廣的關(guān)鍵[9]，然而傳統(tǒng)信號(hào)探針的制備主要是以納米材料如金屬有機(jī)骨架(MOFs)、金屬有機(jī)片層(MOLs)及一些碳納米材料等作為支撐基質(zhì)來固定信號(hào)分子(亞甲藍(lán)、甲苯胺藍(lán)或二茂鐵等)。同時(shí)為進(jìn)一步提高傳感器的靈敏度，常需要酶和其他納米材料標(biāo)記[10]。然而，以上方法雖然可以在一定程度上放大信號(hào)，達(dá)到提高傳感器靈敏度的目的，但不可避免地存在一些問題：(1)MOLs 比表面積相對(duì)較低，MOFs 孔徑與信號(hào)分子尺寸不匹配，信號(hào)分子的固載量有限，甚至信號(hào)分子在檢測過程中泄漏，導(dǎo)致傳感器穩(wěn)定性差[11]；(2) MOFs 和MOLs 的配體一般為有機(jī)配體，具有一定的絕緣性，進(jìn)而降低傳感器的導(dǎo)電性[12]；(3) 標(biāo)記過程通常繁瑣，特別是酶存在失活等問題[13]。因此，直接用于電化學(xué)適體傳感器，且具有電化學(xué)活性的納米材料的合成越來越受到關(guān)注。

配合物(COP)是一種多孔軟雜化超分子材料，具有結(jié)構(gòu)多樣、孔隙可調(diào)、可設(shè)計(jì)和高比表面積等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于能源儲(chǔ)存、氣體吸附分離、催化等領(lǐng)域[3]。其中具有電化學(xué)活性的鑭系配合物(Ln-COP)除具有上述優(yōu)點(diǎn)外，還具有內(nèi)在的氧化還原特性，能夠直接用于電化學(xué)適體傳感器的信號(hào)探針，因而備受關(guān)注[14]。如Zhang等[15]合成了用于色氨酸檢測的殼聚糖負(fù)載的鈰配合物(Ce-COP)。Ce-COP 合成方法綠色、經(jīng)濟(jì)、簡便，同時(shí)殼聚糖和Ce-COP的結(jié)合不僅使修飾電極更加穩(wěn)定，還可以防止Ce-COP 的聚積。然而，殼聚糖阻礙電子傳遞，傳感器導(dǎo)電性差。Tu 等[16]采用簡單、綠色的方法合成了一種還原氧化石墨烯(RGO)封裝的Ce-COP 納米復(fù)合材料。RGO 和Ce-COP 的結(jié)合顯著提高了復(fù)合材料的導(dǎo)電性。因此，選擇其他導(dǎo)電性好的功能材料如石墨烯[16]、碳納米管[17]、金屬納米顆粒[18]等能夠改善Ln-COP 的導(dǎo)電性，并推動(dòng)其在適體傳感器中的應(yīng)用。

基于以上，我們以Ce3+為中心離子，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為有機(jī)配體，通過溫度控制，合成了系列形貌不同和電化學(xué)信號(hào)不同的鈰配合物(Ce-COPs)。篩選出電化學(xué)信號(hào)最強(qiáng)的多面體狀Ce-COP，同時(shí)通過原位還原的方法將金(Au)納米粒子包裹到Ce-COP表面形成Au@Ce-COP納米復(fù)合材料。首先，Au 既起到改善Au@Ce-COP 導(dǎo)電性的作用，又起到固定TB 適體鏈(TBA)的作用；其次，電化學(xué)信號(hào)直接來自Ce-COP，電子在Ce3+和Ce4+之間轉(zhuǎn)移，避免添加或標(biāo)記其他氧化還原介質(zhì)。最后，以Ce-COP 為信號(hào)探針，TB 為目標(biāo)分析物，我們成功構(gòu)建了一種用于TB 靈敏檢測的適體傳感器(圖1)。結(jié)果表明，本工作中構(gòu)建傳感器具有檢測限較低、線性范圍較寬等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成功用于實(shí)際樣品中TB高靈敏檢測，有望為臨床實(shí)際樣品中TB的快速檢測提供一個(gè)簡單、高效的通用平臺(tái)。

圖1 Ce-COPs的制備及傳感器構(gòu)建過程Fig.1 Preparation of Ce-COPs and the biosensor construction process

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

六水合硝酸鈰(Ce(NO3)3·6H2O，99.99%)、DMF、凝血酶(TB，2 000 U·mg-1)和6-巰基-1-己醇(MCH，99%)購買于Sigma-Aldrich 公司(美國)。Na2HPO4、KH2PO4、四氯金酸(HAuCl4)和NaBH4購買于重慶鈦新化工有限公司(中國)。不同pH 值的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.1 mol·L-1)由Na2HPO4和KH2PO4配制，支持電解質(zhì)為0.1 mol·L-1KCl。0.1 mol·L-1pH 7.4 的Tris-HCl 緩沖液(包含140 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1KCl 和1 mmol·L-1MgCl2)作為DNA 雜交和儲(chǔ)存液。巰基修飾TBA(5′-GGTTGGTGTGGTTGGAGA AGAAGGTGTTTAAGTA-(CH3)6-SH-3′)購買于生工生物技術(shù)(上海)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

CHI660E 電化學(xué)工作站購自上海辰華儀器公司，三電極系統(tǒng)中工作電極為直徑4 mm的玻碳電極(GCE)，對(duì)電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極。

1.2 系列Ce-COPs的制備[18]

系列Ce-COPs 制備過程如下：將0.434 4 mg Ce(NO3)3·6H2O加入到DMF/H2O(7∶3)混合溶液中，磁力攪拌30 min 得到均一透明溶液。將上述均一透明溶液轉(zhuǎn)移到50 mL反應(yīng)釜中，在烘箱中分別于90、120、150、180 和200 ℃下水熱反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)釜冷卻至室溫，離心收集產(chǎn)物并用DMF 和無水乙醇洗滌產(chǎn)物。最后在60 ℃烘箱中干燥，得系列Ce-COPs，不同溫度合成樣品分別記為Ce-COP-90、Ce-COP-120、Ce-COP-150、Ce-COP-180、Ce-COP-200。

1.3 Au@Ce-COP納米復(fù)合材料的制備[19]

將1 mL 1%HAuCl4溶液迅速加入到2 mL Ce-COP(0.5 mg·mL-1)分散液中，持續(xù)攪拌30 min，然后加入1 mL NaBH4(0.1 mol·L-1，0 ℃)溶液，攪拌30 min，得Au@Ce-COP納米復(fù)合材料。離心、洗滌后將Au@Ce-COP 重新分散于1 mL Tris-HCl 緩沖液中，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 TBA/Au@Ce-COP復(fù)合物的制備

將100 μL TBA(4 μmol·L-1)加入到1 mL Au@Ce-COP(0.5 mg·mL-1)分散液中，4 ℃下攪拌至少16 h，TBA 通過Au—S 鍵作用固定到Au@Ce-COP 上。離心除去游離未結(jié)合的TBA，所得沉淀即為TBA/Au@Ce-COP 復(fù)合物。最后將TBA/Au@Ce-COP 重新分散于1 mL Tris-HCl緩沖液中，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 TB適體傳感器的構(gòu)建

GCE(直徑4 mm)依次用0.3和0.05 μm的氧化鋁漿液反復(fù)拋光成鏡面，然后依次用水和無水乙醇分別超聲洗滌5次，室溫晾干。為固定TBA，將晾干后的GCE浸入HAuCl4溶液(1%)中，-0.2 V電沉積30 s，得納米金修飾的GCE(Au NPs/GCE)。蒸餾水沖洗電極之后，將10 μL TBA(2 μmol·L-1)滴涂至Au NPs/GCE 表面，4 ℃孵育過夜，通過Au—S 鍵將TBA 固定到Au NPs/GCE 表面。加入10 μL MCH(1 mmol·L-1)在4 ℃孵育30 min，封閉電極剩余的活性位點(diǎn)，記為TBA/Au NPs/GCE。隨后，將10 μL 不同濃度目標(biāo)物TB 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂至TBA/Au NPs/GCE 表面，37 ℃孵育1 h。最后，將10 μL TBA/Au@Ce-COP 滴涂于上述電極表面，37 ℃孵育1 h后測其電化學(xué)信號(hào)。

1.6 表征儀器

主要儀器包括X 射線光電子能譜儀(XPS，ThermoFisher Scientific 公司，美國，單色AlKα(hν=1 486.6 eV)，功率150 W，650 μm 束斑，電壓14.8 kV，電流1.6 A)、S-4800 掃描電子顯微鏡(SEM，日立儀器有限公司，日本，加速電壓20 kV，工作距離7.6 mm)、UNICUBE 有機(jī)元素分析儀(Elementar 公司，德國)、ICPoes730 電感耦合等離子光譜發(fā)生儀(ICP，Agilent 公司，美國，發(fā)射功率1.0 kW，載氣為Ar，等離子氣流量15 L·min-1，輔助氣流量1.5 L·min-1，霧化器流量0.75 L·min-1)、D8 型X 射線衍射儀(XRD，布魯克，德國，管電流40 mA，管電壓40 kV，CuKα輻射，波長0.154 06 nm，掃描范圍10°～80°，掃速6(°)·min-1)、托利多同步熱分析儀TGA/DSC3+(梅特勒，美國，從室溫升至600 ℃，升溫速率10 ℃·min-1，氣氛N2)。

1.7 電化學(xué)測試

循環(huán)伏安(CV)測試底液為0.1 mol·L-1PBS(pH 7.5)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：初始電位-0.2 V，最高電位0.6 V，最低電位-0.2 V，最終電位0 V，掃描速率0.05 V·s-1，掃描4 圈，采樣間隔0.001 V，靜置時(shí)間2 s，靈敏度1×10-4A·V-1。電化學(xué)阻抗(EIS)測試底液為5 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-溶液，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：頻率范圍0.012 12～1 000 Hz，電位幅度0.05 V，靜止時(shí)間2 s。差分脈沖伏安(DPV)法測試底液為0.1 mol·L-1PBS(pH 7.5)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：初始電位0 V，終止電位0.3 V，電位間隔0.004 V，電位幅度0.05 V，脈沖寬度0.016 7 s，脈沖周期0.2 s，靜止時(shí)間2 s，選用的電流靈敏度為2×10-5A·V-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 系列Ce-COPs的表征

采用SEM 表征系列Ce-COPs 的形貌和尺寸。當(dāng)水熱溫度由90 ℃逐漸變化到200 ℃時(shí)，Ce-COPs的形貌隨之變化。如圖2 所示，Ce-COP-90(圖2a)、Ce-COP-120(圖2b)、Ce-COP-150(圖2c)、Ce-COP-180(圖2d)、Ce-COP-200(圖2e)的形貌分別為蜂窩狀、四角星、棒狀、多孔球狀和不規(guī)則多面體狀，其中Ce-COP-120 長約16 μm、厚約2 μm，Ce-COP-150 長約32.5 μm、厚約4 μm，Ce-COP-180 和Ce-COP-200 的直徑分別約為0.2 和0.5 μm。此外，分別將Ce-COP-90、Ce-COP-120、Ce-COP-150、Ce-COP-180、Ce-COP-200 修飾到電極表面，發(fā)現(xiàn)Ce-COP-150 的電化學(xué)信號(hào)最強(qiáng)(圖2f)。基于以上結(jié)果，選擇Ce-COP-150 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用材料。

圖2 (a)Ce-COP-90、(b)Ce-COP-120、(c)Ce-COP-150、(d)Ce-COP-180、(e)Ce-COP-200的SEM圖;(f)不同溫度下Ce-COPs的DPV曲線Fig.2 SEM images of(a)Ce-COP-90,(b)Ce-COP-120,(c)Ce-COP-150,(d)Ce-COP-180,and(e)Ce-COP-200;(f)DPV curves of Ce-COPs at different temperatures

ICP測試表明，Ce-COP-150中Ce的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為42.51%，根據(jù)有機(jī)元素分析儀得出N、C和O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.09%、6.63%和14.82%。此外，采用能量色散X 射線光譜(EDX)表征Ce-COP-150 的組成，如圖3 所示，Ce-COP-150 主要由C、N、O 和Ce 元素組成且各元素分布均勻。

圖3 Ce-COP-150的(a)EDX譜圖和(b)元素含量及(c)元素分布圖Fig.3 (a)EDX spectrum,(b)element contents,and(c)the elemental mapping images of C,N,O and Ce for Ce-COP-150

采用XPS 測定Ce-COP-150 的元素組成及其價(jià)態(tài)。如圖4a 所示，284.3、399.2 和529.7 eV 處的峰分別對(duì)應(yīng)C1s、N1s和O1s。由Ce3d譜圖分峰可知(圖4b)，Ce-COP-150 表面存在Ce3+和Ce4+兩種價(jià)態(tài)，且Ce4+面積占比較大，說明Ce 元素主要以+4 價(jià)為主，且Ce4+和Ce3+的比值約為1.7∶1。圖4c 為Au@Ce-COP 納米復(fù)合材料的XPS 譜圖，由圖可知，C、N、O、Ce 和Au 元素同時(shí)存在，表明Au@Ce-COP 納米復(fù)合材料成功合成。XRD 圖表明Ce-COP-150 的結(jié)晶度和晶體結(jié)構(gòu)(圖4d)相對(duì)較差，且與Ce(OH)3(PDF No.81-0792)和Ce2O3(PDF No.19-0284)標(biāo)準(zhǔn)卡差別較大。此外，采用FTIR 光譜研究Ce-COP-150 的組成。如圖4e 所示，對(duì)于配體DMF，1 658 cm-1處為—C=O 伸縮振動(dòng)，658 cm-1處為N—C=O 變形振動(dòng)，1 503 cm-1處為N—C 伸縮振動(dòng)，1 063 cm-1處為H—C=O 彎曲振動(dòng)。然而，當(dāng)Ce 與DMF 發(fā)生配位后，N—C=O 變形振動(dòng)峰和H—C=O 彎曲振動(dòng)峰消失，—C=O 伸縮振動(dòng)和N—C 伸縮振動(dòng)峰發(fā)生移動(dòng)，這可能是Ce與N 和O 發(fā)生配位所致。結(jié)合XRD與FTIR 表征可知，Ce-COP-150 主要以配合物的形式存在。

圖4 Ce-COP-150的(a)XPS總譜圖和(b)Ce3d譜圖;(c)Au@Ce-COP-150的XPS總譜圖;(d)Ce-COP-150的XRD圖;(e)DMF和Ce-COP-150的FTIR譜圖Fig.4 (a)XPS survey spectrum and(b)Ce3d spectrum for Ce-COP-150;(c)XPS survey spectrum for Au@Ce-COP-150;(d)XRD pattern for Ce-COP-150;(e)FTIR spectra of DMF and Ce-COP-150

采用熱重分析法測試Ce-COP-150的熱穩(wěn)定性。如圖5 所示，由熱重(TG)和熱重微分(DTG)曲線可知，Ce-COP-150 的初始分解溫度為204.5 ℃，表明其具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖5 Ce-COP-150的TG和DTG曲線Fig.5 TG and DTG curves of Ce-COP-150

2.2 修飾電極組裝過程的表征

采用CV 和EIS 表征電極的組裝過程。如圖6A所示，當(dāng)電極表面沉積Au NPs 后，其峰電流值(曲線b)相較于裸GCE(曲線a)明顯增大，主要?dú)w功于Au NPs 增加了電極的有效比表面積，加快了電子的傳遞速率。當(dāng)TBA(曲線c)、MCH(曲線d)、TB(曲線e)和TBA/Au@Ce-COP-150(曲線f)分別修飾到電極表面時(shí)，傳感器峰電流值依次下降，主要?dú)w因于DNA 適體鏈、蛋白質(zhì)及配合物阻礙了電子傳遞。圖6B為電極組裝過程的EIS 表征。EIS 中半圓直徑大小對(duì)應(yīng)電子轉(zhuǎn)移電阻(Ret)。如圖所示，Au NPs 修飾GCE 的Ret(曲線b)小于裸GCE 的Ret(曲線a)。當(dāng)TBA(曲線c)、MCH(曲線d)、TB(曲線e)和TBA/Au@Ce-COP-150(曲線f)分別修飾到電極表面時(shí)，Ret值依次增大。EIS 表征結(jié)果與CV 曲線一致，表明傳感器構(gòu)建成功。

圖6 傳感器組裝過程的(A)CV曲線和(B)EISFig.6 (A)CV curves and(B)EIS on the biosensor assembly process

2.3 TBA在Au NPs/GCE的表面覆蓋量

在5 mmol·L-1Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中，采用CV 法分別在10、20、30、50、80、100、120、150、180、200、220、250、280、300 和320 mV·s-1掃速下研究Au NPs/GCE 的有效比表面積(A)。如圖7A、7B 所示，根據(jù)Randles-Sevcik 方程[20]，Au NPs/GCE 的有效比表面積為11.5 mm2。

圖7 (A)不同掃速下Au NPs/GCE在5 mmol·L-1 Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液中的CV曲線;(B)Au NPs/GCE的陽極和陰極峰電流值與掃描速率平方根的線性關(guān)系;(C)不存在(曲線a)和存在(曲線b)5 0 μmol·L-1氯化六氨合釕時(shí)TBA/Au NPs/GCE 的計(jì)時(shí)電量曲線Fig.7 (A)CV curves of Au NPs/GCE in 5 mmol·L-1 Fe(CN)63-/Fe(CN)64-at different scan rates;(B)Linear relations of the Au NPs/GCE with the anodic and cathodic peak currents against the square root of scan rate;(C)Representative chronocoulometric curves for TBA/Au NPs/GCE in the absence(curve a)and presence(curve b)of 50 μmol·L-1 hexaammineruthenium（Ⅲ）chloride

其中，Ip為圖7a 中不同掃速的下CV 峰電流值(mA·cm-2)，n為氧化還原反應(yīng)過程中電子轉(zhuǎn)移的量，D為擴(kuò)散系數(shù)(25 ℃，(6.70±0.02)×10-6cm2·s-1)，c為Fe(CN)63-/Fe(CN)64-溶液濃度，v為掃速(mV·s-1)。

電荷補(bǔ)償量與DNA 中堿基的數(shù)量直接相關(guān)，因此TBA 在Au NPs/GCE 上的表面覆蓋量可以通過計(jì)時(shí)電量法求出。圖7C為TBA/Au NPs/GCE 在不含有(曲線a)和含有(曲線b)50 μmol·L-1氯化六氨合釕的Tris-HCl 緩沖溶液中(10 mmol·L-1，pH 7.4)的電量曲線，電位范圍-0.5～0.2 V。根據(jù)Cottrell 方程[21]，TBA在Au NPs/GCE 上的表面覆蓋量(ГTBA)為3.87×1016mol·cm-2。具體計(jì)算過程如下：

計(jì)時(shí)電量法測得的電量(Q)為時(shí)間t的函數(shù)：

其中n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)(96 485 C·mol-1)，A為Au NPs/GCE 的有效比表面積(cm2)，Do為氯化六氨合釕的擴(kuò)散系數(shù)(cm2·s-1)，co*為氯化六氨合釕的濃度(mol·cm-2)，Qdl為電容電量(C)，nFAГo為電極表面吸附的氧化還原標(biāo)記物還原的法拉第分量，Гo為表面過剩濃度或表面余量(mol·cm-2)，表示限制在電極表面的氯化六氨合釕的量。t=0 時(shí)，計(jì)時(shí)庫侖電量為雙層電荷和表面余量之和。在氯化六氨合釕存在和不存在條件下，表面余量是由圖7c中縱坐標(biāo)截距的差值確定：

其中，Qdl和Qds分別為氯化六氨合釕存在和不存在時(shí)的電容電量。

氯化六氨合釕飽和的電極表面余量與DNA 表面密度的關(guān)系如下：

其中ГTBA為TBA 在Au NPs/GCE 的表面覆蓋量(mol·cm-2)，z為六氨合釕電荷，m為TBA中的堿基數(shù)量，NA為阿伏伽德羅常數(shù)。

2.4 可行性實(shí)驗(yàn)

為考察傳感器檢測TB的可行性，研究了傳感器在存在和不存在TB 時(shí)的電化學(xué)響應(yīng)。如圖8 所示，當(dāng)傳感器沒有孵育TB(曲線a)時(shí)，傳感器無電化學(xué)響應(yīng)峰，這主要是由于信號(hào)探針Ce-COP-150不能被引入到電極表面。相反，當(dāng)傳感器孵育不同濃度TB時(shí)，在0.127 和0.257 V 可以觀察到一對(duì)明顯的氧化還原峰，且隨著目標(biāo)物濃度由0.1 pmol·L-1增大到1.0 pmol·L-1，相應(yīng)的峰電流也隨之增強(qiáng)(曲線b和c)。這表明由于TB 與TBA 之間的特異性識(shí)別作用，隨著TB 的濃度增加，引入到電極表面的信號(hào)探針Ce-COP-150 的量也隨之增加，導(dǎo)致傳感器電化學(xué)響應(yīng)峰電流增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，本方法可用于TB的靈敏和特異性檢測。

圖8 在0.1 mol·L-1 PBS(pH 7.5)中(a)不存在和存在(b)0.1 pmol·L-1和(c)1.0 pmol·L-1 TB時(shí)傳感器的CV響應(yīng)Fig.8 CV responses of the biosensor in the(a)absence and presence of(b)0.1 pmol·L-1 and(c)1.0 pmol·L-1 TB in 0.1 mol·L-1 PBS(pH 7.5)

2.5 適體傳感器的性能分析

由于差分脈沖伏安法(DPV)比CV 法具有更高的靈敏度，因此實(shí)驗(yàn)采用DPV 對(duì)不同濃度的TB 進(jìn)行測定，結(jié)果如圖9 所示。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下(圖9a)，隨著TB 濃度的增加，傳感器峰電流值逐漸增大(圖9b)。在1.0 fmol·L-1～1.0 nmol·L-1(0.1 fmol·L-1、1 fmol·L-1、10 fmol·L-1、0.1 pmol·L-1、1 pmol·L-1、10 pmol·L-1、0.1 nmol·L-1、1 nmol·L-1、10 nmol·L-1)濃度范圍內(nèi)，峰電流值與TB 濃度的對(duì)數(shù)成正比(圖9c)，線性方程為Ip=-11.61-0.320lgc(R=0.994)，檢測限為0.94 fmol·L-1。此外，與文獻(xiàn)相比(表1)，本文中構(gòu)建的傳感器具有相對(duì)較低的檢測限和較寬的線性范圍。

表1 TB檢測方法比較Table 1 Comparison of TB detection methods

圖9 (a)pH的影響;(b)生物傳感器對(duì)不同濃度TB的DPV響應(yīng)曲線;(c)峰電流值與相應(yīng)TB濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線;(d)傳感器抗干擾能力Fig.9 (a)Effect of the pH;(b)DPV response curves of the biosensor with various concentrations of TB;(c)Linear relationship curve between peak current value and corresponding TB concentration logarithmic value;(d)Anti-interference ability

2.6 傳感器的抗干擾能力和穩(wěn)定性

抗干擾能力和穩(wěn)定性是評(píng)估生物傳感器性能的重要因素。因此，通過檢測潛在干擾物質(zhì)(10 pmol·L-1，目標(biāo)物濃度的100 倍)，如甲胎蛋白(AFP)、牛血清蛋白(BSA)和癌胚抗原(CEA)等其他蛋白來評(píng)估傳感器的選擇性，結(jié)果如圖9d 所示，干擾物質(zhì)與空白DPV 信號(hào)強(qiáng)度接近。然而，當(dāng)目標(biāo)物TB(0.1 pmol·L-1)孵育到電極表面，DPV 信號(hào)值遠(yuǎn)高于干擾物質(zhì)和空白信號(hào)值。此外，目標(biāo)物TB和干擾物組成的混合物的DPV 信號(hào)值與目標(biāo)TB 的信號(hào)值接近。這表明開發(fā)的TB 適體傳感策略具有高的選擇性。傳感器不用時(shí)將其蓋帽儲(chǔ)存(4 ℃)5 和10 d 后，傳感器峰電流值僅分別下降0.3%和1.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.3%和0.5%。同時(shí)，同一只電極連續(xù)測量8 次后，傳感器峰電流值沒有明顯變化，RSD為1.7%。以上表明，該傳感策略具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性。

2.7 實(shí)際樣品分析

為了評(píng)估本文中提出的傳感器在臨床應(yīng)用的可行性，將制備的適體傳感器用于檢測人血清中TB的含量，患者血清來自重慶市第九人民醫(yī)院。采用本實(shí)驗(yàn)方法和TM ELISA 試劑盒方法同時(shí)檢測患者血清中TB 含量，結(jié)果如表2 所示。由表可知，本方案方法與商品TM ELISA 試劑盒檢測結(jié)果相近，表明構(gòu)建的生物傳感器在臨床分析中具有良好的應(yīng)用潛力。

表2 不同檢測方法的對(duì)比Table 2 Comparison of different detection methods

3 結(jié) 論

通過水熱法成功合成了系列不同形貌和電化學(xué)信號(hào)不同的鈰配合物(Ce-COPs)。傳感器電化學(xué)信號(hào)直接源自Ce-COPs 內(nèi)在的氧化還原特性，電子在Ce3+和Ce4+之間轉(zhuǎn)移。同時(shí)，通過原位還原的方法將金納米粒子包裹到Ce-COPs 表面，不僅改善了其導(dǎo)電性，還可以避免添加或標(biāo)記其他氧化還原介質(zhì)。通過TB 與TBA 之間的高特異性識(shí)別作用，成功實(shí)現(xiàn)了TB的高效、靈敏、準(zhǔn)確檢測。此外，人血清樣品中TB實(shí)驗(yàn)表明，該傳感器有望為臨床血液樣品中TB的檢測提供參考和借鑒。