何 薇 龔 蘭 鄧紹文 李中燕 袁 霖

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，永州 425199)

0 引 言

鋅離子具有良好的配位能力，廣泛存在于人體細(xì)胞和體液中，是人體必需的微量元素之一，在人體內(nèi)的含量僅次于鐵。Zn2+在基因表達(dá)、機體免疫和神經(jīng)傳輸?shù)刃玛惔x活動中發(fā)揮著重要作用[1-3]。人體內(nèi)Zn2+代謝紊亂，往往會導(dǎo)致酶活性失調(diào)、基因表達(dá)錯誤、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)傳遞受阻等生理紊亂現(xiàn)象，Zn2+濃度過低會引起消化不良、食欲不振，而Zn2+濃度過高則會導(dǎo)致一些毒性癥狀和神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、癲癇等[4-6]。因此，Zn2+的識別、檢測對人體疾病的診斷與環(huán)境中Zn2+污染的監(jiān)測具有重要意義。

目前，與大多數(shù)傳統(tǒng)分析方法相比，熒光探針法具有靈敏度高、選擇性好、作用迅速、操作簡單、可實時監(jiān)測等諸多優(yōu)點，因此在分析化學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)等多個領(lǐng)域里得到普遍應(yīng)用[7-13]。目前報道的大多數(shù)Zn2+熒光探針的分子量一般較大，合成步驟多，結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，有的探針?biāo)苄暂^差，這些因素限制了熒光探針的實際應(yīng)用范圍[14-17]。因此通過簡單的反應(yīng)制備出水溶性好的小分子Zn2+熒光探針仍然具有重要意義。此外，席夫堿型熒光探針由于其合成條件溫和且具有良好的配位能力而得到化學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[18-19]。

我們以乙二胺與水楊醛及其衍生物為原料設(shè)計合成了4 種新型的席夫堿熒光探針L1～L4(Scheme 1)，并通過光譜實驗研究了探針對Zn2+的選擇性識別、檢測。

Scheme 1 Synthesis of probes L1-L4

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器有AVANCE ⅢHD 400 MHz核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)、AVATAR-360傅里葉變換紅外光譜儀(美國Niconet 公司)、RF-6000 熒光分光光度計(日本島津公司)、UPH-III-10TN 超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

水楊醛、取代水楊醛、乙二胺、乙醇及所用金屬離子的相應(yīng)鹽酸鹽或硝酸鹽，均為分析純，購于上海泰坦科技股份有限公司。實驗用水為超純水。

1.2 探針L1～L4及配合物L(fēng)2-Zn2+的合成及表征

探針的制備如Scheme 1 所示。稱取水楊醛或取代水楊醛(2 mmol)、乙二胺(60 mg，1 mmol)，加入到15 mL 無水乙醇中，然后加熱回流2 h 左右，用薄層色譜法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)期間會產(chǎn)生大量固體。反應(yīng)完全后，旋蒸除去溶劑，加入少量冰乙醇洗滌，抽濾，烘干，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

將探針L2(169 mg，0.5 mmol)和醋酸鋅(183 mg，1 mmol)加入到乙醇(20 mL)中，加熱回流2 h，然后冷卻至室溫，靜置5 d 左右析出淡黃色晶體，即配合物L(fēng)2-Zn2+。

L1：淡黃色固體，產(chǎn)率88%。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ13.153(s，2H)，8.257(s，2H)，7.205(t，J=15.588 Hz，2H)，7.143(d，J=9.113 Hz，2H)，6.867(d，J=8.279 Hz,2H),6.769(t，J=14.921 Hz，2H)，3.833(s，4H)。13C NMR(CDCl3，101 Hz)：δ165.444,159.921,131.342,130.443，117.637，117.559，115.882，58.672。FTIR(KBr，cm-1)：3 444，2 905，1 634，1 483，1 277，1 034，827，706。元素分析按C16H16N2O2的計算值(%)：C 71.62，H 6.01，N 10.44。實驗值(%)：C 71.23，H 5.83，N 10.23。HRMS(m/z)：計算值269.129 0 [M+H]+；實驗值269.127 3。

L2：淡黃色固體，產(chǎn)率92%。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ13.060(s，2H)，8.220(s，2H)，7.157～7.190(m，2H)，7.134(d，J=2.499 Hz，2H)，6.833(d，J=8.766 Hz，2H)，3.882(s，4H)。13C NMR(CDCl3，101 MHz)：δ164.385,158.508,131.319,129.539，122.280，118.228，117.555，58.568。FTIR(KBr，cm-1)：3 444，2 940，1 634，1 483，1 277，1 034，706，644。元素分析按C16H14Cl2N2O2的計算值(%)：C 56.99，H 4.19，N 8.31；實驗值(%)：C 56.70，H 4.01，N 8.14。HRMS(m/z)：計算值337.051 1[M+H]+；實驗值337.049 1。

L3：淡黃色固體，產(chǎn)率93%。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ13.059(s，2H)，8.225(s，2H)，7.159～7.191(m，4H)，7.137(d，J=2.320 Hz，2H)，6.833(d，J=8.762 Hz，2H)，3.887(s，4H)。13C NMR(CDCl3，101 MHz)：δ164.295,158.990,134.129,132.526，118.854，118.012，109.156，58.562。FTIR(KBr，cm-1)：3 426，2 933，1 634，1 474，1 276，1 127，1 033，826。元素分析按C16H14Br2N2O2的計算值(%)：C 45.10，H 3.31，N 6.57；實驗值(%)：C 45.00，H 3.19，N 6.39。HRMS(m/z)：計算值426.948 0[M+H]+；實驗值426.946 1。

L4：淡黃色固體，產(chǎn)率89%。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ13.780(s，2H)，8.425(s，2H)，7.273(d，J=8.570 Hz，2H)，6.398(d，J=1.920 Hz，1H)，6.376(d，J=1.869 Hz,1H)，7.134(d，J=1.779 Hz，2H)，3.824(s，4H)，3.743(s，6H)。13C NMR(CDCl3，101 MHz)：δ166.305，165.723,163.711,133.645,112.418，106.316，101.458，57.731，55.713;FTIR(KBr，cm-1)：3 444，2 973，1 621，1 444,1 285，1 025，852，581。元素分析按C18H20N2O4的計算值(%)：C 65.84，H 6.14，N 8.53；實驗值(%)：C 65.65，H 6.00，N 8.39。HRMS(m/z)：計算值329.150 1[M+H]+；實驗值329.149 0。

L2-Zn2+：淡黃色固體,產(chǎn)率90%，1H NMR(DMSOd6，400 MHz)：δ8.42(s，2H)，7.34(d，J=2.8 Hz，2H)，7.21(dd，J=9.0，2.8 Hz，2H)，6.58(d，J=9.0 Hz，2H)，3.72(s，4H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ170.03，167.68,133.48,132.91，125.01，120.36，115.38，56.49，56.12，19.03。FTIR(KBr，cm-1)：3 451，2 970，2 920，1 641,1 560，1 460，1 420，1 300，1 171，1 090，1 050，947，819，709。元素分析按C16H14Cl2N2O3Zn 的計算值(%)：C 45.91，H 3.37，N 6.69；實驗值(%)：C 45.65，H 3.13，N 6.59。

1.3 光譜性質(zhì)測試

將探針L1～L4 溶于乙醇制得探針儲備液(2 mmol·L-1)，配制金屬離子(Na+、K+、Ag+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sn2+、Cd2+、Fe3+、Cr3+、Al3+)儲備液(2 mmol·L-1)用于金屬選擇性的檢測。將4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)溶于超純水中制備0.1 mg·mL-1的溶液，并用稀HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)至pH=7.54，作為緩沖溶液。檢測體系為EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.54)。

熒光滴定實驗：移取20 μL探針儲備液(2 mmol·L-1)，加入適量的Zn2+緩沖溶液，然后加入乙醇定容至2 mL，熒光光譜測定條件為：λex=362 nm，λem=400～600 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為3 nm/3 nm。

1.4 單晶X射線衍射

選取尺寸為0.42 mm×0.36 mm×0.32 mm 的配合物L(fēng)2-Zn2+的晶體置于玻璃毛細(xì)管上，使用Bruker SMART APEX ⅡCCD衍射儀，在室溫下以石墨單色化的MoKα輻射(λ=0.071 073 nm)和φ-ω掃描技術(shù)在一定θ范圍內(nèi)收集晶體的強度數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)集成到SHELX 程序并用SAINT 程序校正，全部數(shù)據(jù)經(jīng)Lp 因子和多重掃描吸收校正后，使用Olex2 軟件和SHELXS程序解出晶體分子結(jié)構(gòu)，用SHELXL程序[20]對全部非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)進行全矩陣最小二乘法精修至收斂。氫原子均為理論加氫并在結(jié)構(gòu)精修中確定氫原子的位置和熱參數(shù)。相應(yīng)的晶體學(xué)數(shù)據(jù)見表1，部分鍵長和鍵角見表2。

表2 配合物L(fēng)2-Zn2+的部分鍵長與鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complex L2-Zn2+

CCDC：2247372。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針L2與L2+Zn2+的UV-Vis吸收光譜

探針L2分子中C=N鍵中的N原子和酚羥基中的O 原子容易與Zn2+結(jié)合，使得分子剛性增強，從而引起探針L2 光譜性質(zhì)的變化。在EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.54)中對L2 的UV-Vis 光譜性質(zhì)進行了研究，如圖1所示。加入等量的Zn2+后，L2在332 nm處產(chǎn)生了一個新的吸收峰，說明L2 與Zn2+發(fā)生了配位。

圖1 L2與L2+Zn2+的UV-Vis吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of L2 and L2+Zn2+

2.2 探針與Zn2+的熒光光譜

考察了探針L1～L4對Zn2+的熒光響應(yīng)性，如圖2所示。結(jié)果表明，探針本身幾乎沒有熒光，隨著Zn2+的加入，4 種探針的熒光強度顯著增強，這可能是探針與Zn2+的螯合使得探針分子中C=N 的異構(gòu)化受阻，同時增加了分子的剛性，產(chǎn)生了螯合型熒光增強的效果，據(jù)此可對Zn2+進行識別檢測。其中探針L2 的熒光強度最強，發(fā)出亮藍(lán)色熒光(圖2 插圖)，因此選擇L2為代表研究探針對Zn2+的識別性能。

圖2 L1～L4對Zn2+的熒光響應(yīng)Fig.2 Fluorescence response of L1～L4 to Zn2+

2.3 探針L2與Zn2+的熒光滴定實驗

如圖3所示，隨著Zn2+的加入，探針L2在464 nm處的熒光強度顯著增強。熒光滴定實驗(圖3和4)表明，在0～30 μmol·L-1范圍內(nèi)，隨著加入的Zn2+濃度的升高，體系的熒光強度不斷增強，而且體系的熒光強度與Zn2+的濃度在0～30 μmol·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.993 76，檢出限為92.15 nmol·L-1，遠(yuǎn)低于國標(biāo)GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[20]規(guī)定的飲水中Zn2+含量的限量值1.0 mg·L-1(約15 μmol·L-1)。實驗數(shù)據(jù)表明探針L2 可以對Zn2+進行高效地識別、檢測。同時，根據(jù)熒光滴定結(jié)果，如圖5 所示，利用Benesi-Hildebrand 方程計算得出探針L2與Zn2+的結(jié)合常數(shù)為2.66×104L·mol-1。

圖3 不同濃度Zn2+存在時L2的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of L2 in the presence of Zn2+with different concentrations

圖4 Zn2+濃度與L2熒光強度的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between the concentration of Zn2+and the fluorescence intensity of L2

圖5 L2與Zn2+的熒光滴定數(shù)據(jù)的Benesi-Hildebrand圖Fig.5 Benesi-Hildebrand plot from fluorescence titration data of L2 with Zn2+

2.4 探針L2識別Zn2+的響應(yīng)時間

用熒光光譜法研究探針L2 識別Zn2+的響應(yīng)時間，結(jié)果如圖6所示。前59 s是探針L2溶液，溶液無熒光變化。在59 s 時加入Zn2+溶液，體系的熒光強度迅速增強，在6 s 內(nèi)熒光幾乎達(dá)到最強且基本穩(wěn)定。這表明L2可以作為Zn2+的快速識別熒光探針。

圖6 L2加入Zn2+后在464 nm處熒光強度隨時間的變化Fig.6 Change of fluorescence intensity at 464 nm of L2 with time after adding Zn2+

2.5 pH值對熒光光譜的影響

溶液的pH 值對探針L2 及L2+Zn2+的熒光光譜的影響結(jié)果如圖7 所示，探針L2 本身的熒光強度非常弱，而且在5.5～8.5 的pH 范圍內(nèi)，探針L2 的熒光強度幾乎沒有變化。但是pH 對L2+Zn2+體系的熒光強度影響比較明顯，在pH=6.7～8.0 時體系熒光強度較大且基本不受溶液酸堿度的影響，當(dāng)pH<6.7 或pH>8.0 時熒光強度會迅速下降。這可能是由于體系酸性增強時會引起C=N 基團的分解，降低識別基團的有效濃度，而堿性增強時會導(dǎo)致體系中的Zn2+形成Zn(OH)2，降低體系中游離Zn2+的濃度，二者都不利于探針L2 與Zn2+的結(jié)合，均會導(dǎo)致體系熒光強度的降低。L2+Zn2+體系在pH=7.54 時熒光強度最強，故選擇7.54為測試的最佳pH值。

圖7 pH對L2和L2+Zn2+體系熒光強度的影響Fig.7 Effect of pH on the fluorescence intensities of L2 and L2+Zn2+system

2.6 離子選擇性和抗干擾性

考察了采用探針L2 檢測Zn2+的選擇性。如圖8所示，在含有10 μmol·L-1探針L2 的EtOH-H2O(9∶1，V/V，pH=7.54) 體系中分別加入20 μmol·L-1的Na+、K+、Ag+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Sn2+、Cd2+、Fe3+、Cr3+和Al3+，只有Zn2+能使探針L2的熒光強度顯著增強，表明探針對Zn2+有特異性響應(yīng)。進一步考察了共存離子的影響，除了Cu2+和Co2+，其它離子對體系熒光強度的影響不明顯，這表明探針L2在上述共存離子存在下可以有效地選擇性識別和檢測Zn2+。在實際測試中可以加入Cu2+和Co2+掩蔽劑再進行離子檢測。

圖8 L2(10 μmol·L-1)對金屬離子(20 μmol·L-1)的選擇性以及Zn2+ (20 μmol·L-1)與其它金屬離子(20 μmol·L-1)共存時,L2在464 nm處的熒光強度Fig.8 Selectivity of L2 for metal ions and the fluorescence intensity of L2 at 464 nm when Zn2+coexists with other metal ions

2.7 探針L2與Zn2+的結(jié)合模式

為了探究探針L2 與Zn2+的結(jié)合模式，我們首先利用等物質(zhì)的量連續(xù)變換法測定了L2 與Zn2+的Job曲線，結(jié)果如圖9所示，可以推測探針L2與Zn2+的結(jié)合比為1∶1。

圖9 探針L2與Zn2+相互作用的Job曲線Fig.9 Job′s plot for interaction between L2 and Zn2+

核磁滴定結(jié)果也驗證了這一推測。在L2(0.3 mmol)的DMSO-d6溶液里加入0.15 mmol 和0.3 mmol的醋酸鋅，測定其1H NMR譜的變化，結(jié)果如圖10所示。從圖10 中可以看出，隨著Zn2+的加入，L2 上酚羥基的質(zhì)子峰(H1)逐漸消失，發(fā)生去質(zhì)子化，亞胺的質(zhì)子峰(H2)、苯環(huán)上的質(zhì)子峰(H3、H4、H5)均向高場發(fā)生移動，這說明探針分子中的N 原子和O 原子均與Zn2+發(fā)生了配位。當(dāng)加入與L2 等量的Zn2+時，H1完全消失，H2～H5 完全移向高場，說明L2 與Zn2+的結(jié)合比為1∶1。

圖10 (a)L2、(b)L2(0.3 mmol)+Zn2+(0.15 mmol)、(c)L2(0.3 mmol)+Zn2+(0.3 mmol)的1H NMR譜圖Fig.101H NMR spectra of(a)L2,(b)L2(0.3 mmol)+Zn2+(0.15 mmol),(c)L2(0.3 mmol)+Zn2+(0.3 mmol)

同時，我們培養(yǎng)了配合物L(fēng)2-Zn2+的晶體，分子結(jié)構(gòu)如圖11 所示。L2-Zn2+的晶體結(jié)構(gòu)表明Zn2+通過探針L2 的N 原子與O 原子、以及一個水分子的O原子形成了金屬配合物。原子O1、C1、C6、N1 和相鄰苯環(huán)幾乎在一個平面上，命名為P1，原子N2、C10、C11、C12、O2 和相鄰苯環(huán)也幾乎在一個平面上，命名為P2，P1 和P2 的二面角為6.999(4)°。Zn2+與相連的N 和O 原子呈變形四方錐體。同時，分子結(jié)構(gòu)表明探針L2 中的酚羥基發(fā)生了去質(zhì)子化，L2與Zn2+的配位比為1∶1，這與等物質(zhì)的量連續(xù)變換法與核磁滴定實驗的推測結(jié)果一致。

圖11 L2-Zn2+的50%概率晶體結(jié)構(gòu)橢球圖Fig.11 Crystal structure of L2-Zn2+shown as ellipsoids with 50%probability

此外，我們還利用Gaussian16 B3LYP/6-31G(d，p)計算了L2 和L2-Zn2+的能量優(yōu)化軌道[21](圖12)。結(jié)果表明，L2-Zn2+配合物的HOMO 和LUMO 的能量差為3.74 eV，低于L2 的HOMO 和LUMO 的能量差(4.31 eV)，說明探針分子L2與Zn2+發(fā)生了配位。

圖12 探針L2和配合物L(fēng)2-Zn2+的優(yōu)化結(jié)構(gòu)和HOMO/LUMO能量Fig.12 Optimized structures and HOMO/LUMO energies of probe L2 and complex L2-Zn2+

根據(jù)上述實驗結(jié)果，我們推測L2 對Zn2+可能的識別機理如Scheme 2 所示。L2 中存在C=N 雙鍵異構(gòu)化，同時苯酚上的—OH 基團和相鄰的—CH=N—組合在一起，兩者導(dǎo)致了激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT)過程，加劇了激發(fā)態(tài)下的非輻射躍遷，使探針L2 本身幾乎沒有熒光。加入Zn2+后，探針L2 識別基團的空腔與Zn2+剛好匹配，L2 與Zn2+發(fā)生配位，阻止了探針分子中C=N 的異構(gòu)化，同時增加了分子的剛性，產(chǎn)生了螯合型熒光增強(chelation-enhanced fluorescence，CHEF)的效果；另外，L2 與Zn2+配位后，ESIPT過程被抑制，產(chǎn)生熒光響應(yīng)[22]。

Scheme 2 Fluorescence enhancement mechanism for L2 to recognize Zn2+

2.8 水樣中Zn2+的檢測

運用本文中的實驗方法檢測了自來水和湘江河水中的Zn2+，結(jié)果見表3。2 種實際水樣中Zn2+的加標(biāo)回收率分別為100.4%～102.7% 和101.0%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.20%～1.68%和1.56%～2.52%，說明L2 在實際水樣中識別檢測Zn2+的準(zhǔn)確度高，具有良好的應(yīng)用前景。

表3 自來水和河水中的Zn2+的檢測Table 3 Determination of Zn2+in tap water and river water samples

3 結(jié) 論

以乙二胺與水楊醛及其衍生物為原料，通過簡單的反應(yīng)合成了4 種新型的席夫堿類熒光探針L1～L4，其中探針L2 對Zn2+表現(xiàn)出出色的選擇性和靈敏度。在365 nm 紫外燈下，探針L2與Zn2+可形成配合物，引起體系熒光增強，發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，因此，探針L2 可以實現(xiàn)可視化檢測Zn2+，其檢出限為92.15 nmol·L-1。探針L2 對Zn2+檢測的機理為CHEF 效應(yīng)和ESIPT 效應(yīng)。通過Job 曲線、核磁滴定實驗、DFT 理論計算和單晶結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，探針L2與Zn2+形成了1∶1 的配合物，探針L2 中的亞胺中的N 原子與酚羥基中的氧原子參與了L2 與Zn2+的配位。此外，水樣中Zn2+的檢測實驗表明該探針在檢測實際水樣中的Zn2+濃度具有潛在的應(yīng)用價值。