李艷芬，馬瑞峻，陳瑜，黃麗，顏振鋒，蔡祥

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣州 510642）

目前，水稻中常用的農(nóng)藥有三唑磷、辛硫磷、阿維菌素、三氟苯嘧啶、四氯蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威、呋蟲胺、烯啶蟲胺等，這些農(nóng)藥當(dāng)中有機(jī)磷農(nóng)藥三唑磷[1]、辛硫磷[2]和生物農(nóng)藥阿維菌素[3]對(duì)水生生物的毒性比較高，其他農(nóng)藥對(duì)水生生物的毒性都比較低。阿維菌素在防治水稻螟蟲、稻縱卷葉螟（目前對(duì)水稻危害最大的害蟲之一）方面表現(xiàn)優(yōu)異，因此具有較高的研究?jī)r(jià)值。

阿維菌素（Avermectin）是由日本和美國(guó)首先開發(fā)的由土壤微生物阿維鏈霉（Strentomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物[4]，其化學(xué)式為C48H72O14（B1a）·C47H70O14（B1b），分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。市售阿維菌素活性物質(zhì)是avermectinB1a+B1b，其中B1a≥90%、B1b≤5%，以B1a的含量來標(biāo)定，阿維菌素是防治水稻害蟲理想的生物農(nóng)藥[5]。目前對(duì)于水體中阿維菌素農(nóng)藥的檢測(cè)最常用且最準(zhǔn)確的方式是液相色譜法[6]，包括高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）、高效液相色譜熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）等，該方法具有檢測(cè)限低、重復(fù)性高的優(yōu)勢(shì)，但其檢測(cè)樣品多集中在蔬菜、水果、脂肪、肉類等方面，且其檢測(cè)設(shè)備價(jià)格高且大型，需要專業(yè)維護(hù)，預(yù)處理繁瑣耗時(shí)，檢測(cè)時(shí)需嚴(yán)謹(jǐn)操作，依賴性強(qiáng)，只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[7]。因此，尋找一種現(xiàn)場(chǎng)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的方法用于檢測(cè)水體中阿維菌素具有重要的實(shí)際意義。

圖1 阿維菌素分子結(jié)構(gòu)Figure 1 Molecular structure of avermectin

光譜分析技術(shù)以其快速性、無損性、準(zhǔn)確性等檢測(cè)特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，是現(xiàn)代快速檢測(cè)的研究熱點(diǎn)[8]。但直接使用光譜技術(shù)檢測(cè)農(nóng)藥會(huì)存在光譜背景噪聲干擾明顯，檢測(cè)精度難以滿足定量要求等各種問題[9]，因此需將光譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法結(jié)合起來。目前，直接采用光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法快速定量檢測(cè)水體中生物農(nóng)藥的研究未有報(bào)道。故本文選擇阿維菌素為研究對(duì)象，使用光譜儀獲取其不同濃度樣本的紫外/可見光吸收光譜數(shù)據(jù)，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，樣本集劃分，剔除異常樣本，篩選特征波長(zhǎng)變量，建立偏最小二乘PLS 定量分析模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)阿維菌素農(nóng)藥快速有效的定量檢測(cè)研究。

1 材料與方法

1.1 樣本配制

阿維菌素實(shí)驗(yàn)樣本的配制：用1/10 000 電子天平稱取90%阿維菌素0.066 7（±0.000 2）g，用少量甲醇超聲溶解，然后用甲醇準(zhǔn)確定容至600 mL，搖勻，得到濃度為100 mg·L-1的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)液。本次實(shí)驗(yàn)以純凈水為稀釋劑，配制濃度為0.05 mg·L-1、0.1～2.0 mg·L-1（濃度梯度為0.1 mg·L-1）和6.0 mg·L-1共22 個(gè)不同濃度阿維菌素實(shí)驗(yàn)樣本，再配制濃度為0.05 mg·L-1和0.1～6.0 mg·L-1（濃度梯度為0.1 mg·L-1）共61個(gè)不同濃度阿維菌素實(shí)驗(yàn)樣本，每個(gè)樣本溶液配制50 mL。

1.2 紫外/可見光譜數(shù)據(jù)采集

實(shí)驗(yàn)所用的光譜采集器為水體中有機(jī)磷無機(jī)磷含量檢測(cè)儀，由美國(guó)Ocean Optics 海洋光學(xué)公司的Maya2000Pro光譜儀，型號(hào)為DT-MINI-2-GS的氘-鹵鎢燈組合光源以及可調(diào)光程比色皿支架構(gòu)成。在PC機(jī)上安裝與光譜儀配套的BiaoQi SpecSuite 軟件，并設(shè)置積分時(shí)間為9 ms，平滑度為2，樣本光譜平均次數(shù)為20，取其平均光譜數(shù)據(jù)為最終光譜數(shù)據(jù)。

1.3 比色皿光程優(yōu)選

由朗伯-比爾定律A=Klc（A為吸光度，K為吸收系數(shù)，l為光程，c為吸光物質(zhì)的濃度）[10]可知當(dāng)吸光物質(zhì)的濃度一定時(shí)，光程與吸光度呈線性關(guān)系，選擇的比色皿光程越大，吸光度值越大?？晒┻x擇的光程比色皿有10、30、50、100 mm 4 種，為了提高低濃度阿維菌素農(nóng)藥樣本的吸光度值，獲得較強(qiáng)的光譜信號(hào)，又為防止高濃度阿維菌素農(nóng)藥樣本的吸光度值過高，出現(xiàn)光譜信號(hào)失真的情況，選擇一種最佳光程比色皿，得到最佳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于后續(xù)定量處理分析尤為重要，故本實(shí)驗(yàn)選擇了50 mm 和100 mm 光程比色皿獲取光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。使用50 mm 光程比色皿采集了濃度范圍為0.05 mg·L-1、0.1～2.0 mg·L-1（濃度梯度為0.1 mg·L-1）和6.0 mg·L-1共22個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)以及使用100 mm 光程比色皿采集了濃度范圍為0.05 mg·L-1和0.1～6.0 mg·L-1（濃度梯度為0.1 mg·L-1）共61 個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

本文采用Savitzky-Golay 卷積平滑法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，采用SPXY 算法劃分樣本集，采用主成分分析結(jié)合馬氏距離算法（PCA-MD）剔除異常樣本，采用競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)采樣算法（CARS）篩選特征波長(zhǎng)變量。

1.4.1 光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

Savitzky-Golay 卷積平滑法（S-G 平滑法）又稱多項(xiàng)式平滑法，通過多項(xiàng)式對(duì)移動(dòng)窗口內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式最小二乘擬合，其實(shí)質(zhì)是一種加權(quán)平均法[10]。當(dāng)平滑窗口寬度選取恰當(dāng)時(shí)，檢測(cè)時(shí)儀器所引入的光譜數(shù)據(jù)噪聲可有效降低。

1.4.2 樣本集劃分

SPXY（Sample set partitioning based on joint x-y distance）算法是由Galvao 等[11]基于K-S（Kennardstone）算法提出的，能對(duì)低濃度樣本進(jìn)行合理的劃分。

1.4.3 剔除異常樣本

主成分分析（Principle component analysis，PCA）是一種線性特征提取方法，可將光譜數(shù)據(jù)降維。采用主成分分析法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可得到光譜數(shù)據(jù)的主成分個(gè)數(shù)和得分?jǐn)?shù)據(jù)。主成分個(gè)數(shù)選取是否恰當(dāng)，會(huì)影響其預(yù)測(cè)模型精度的高低。馬氏距離（Mahalanobis Distance，MD）表示數(shù)據(jù)的協(xié)方差距離，它是一種有效計(jì)算兩個(gè)樣本的相似度的方法。通過設(shè)置合適的距離閾值，可以剔除小于該閾值的樣本數(shù)據(jù)[12]。PCA-MD 剔除異常樣本即采用主成分分析方法獲得光譜數(shù)據(jù)的主成分得分，計(jì)算各樣本光譜數(shù)據(jù)得分到樣本光譜數(shù)據(jù)平均得分的馬氏距離，通過設(shè)置合理閾值剔除異常樣本，進(jìn)而得到有效樣本。

1.4.4 篩選特征波長(zhǎng)變量

競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法（Competitive adaptive reweighted sampling，CARS）是基于達(dá)爾文“適者生存”的思想，提出的基于迭代統(tǒng)計(jì)信息的變量選擇算法[13]。利用蒙特卡羅采樣、指數(shù)衰減函數(shù)和自適應(yīng)重加權(quán)采樣得到最佳的建模波長(zhǎng)變量組合。

1.5 模型評(píng)價(jià)

PLS 是常用的一種基于線性回歸的新型多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法[14]。PLS 模型的評(píng)價(jià)系數(shù)包括決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（RMSE）剩余預(yù)測(cè)殘差（RPD）和潛變量（LVs）。R2越接近1，RMSE（校正集RMSEC、預(yù)測(cè)集RMSEP）越小，模型精度越高。RPD 是預(yù)測(cè)集的標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測(cè)均方根誤差的比值，反映了模型的分辨能力和穩(wěn)健性。RPD≥3 表示模型預(yù)測(cè)效果很好，可應(yīng)用于定量分析和實(shí)際檢測(cè)；2.5＜RPD＜3 表示此模型可以進(jìn)行定量分析；RPD≤2.5表示此模型不適合進(jìn)行定量分析[15]。LVs 的選擇是否合理會(huì)直接影響到模型預(yù)測(cè)性能的好壞。

本文數(shù)據(jù)處理均基于MATLAB R2020b、Origin-Pro8.5和The Unscrambler X10.4軟件平臺(tái)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 光程優(yōu)選、特征波段和特征吸收峰

50 mm 和100 mm 光程比色皿采集得到的不同濃度阿維菌素溶液的原始吸收光譜如圖2、圖3所示，波長(zhǎng)范圍200～900 nm。由圖2、圖3可見，兩種光程比色皿采集的光譜數(shù)據(jù)均有一個(gè)明顯的特征吸收峰，其波段均在243.5～247.3 nm 之間，近似在245.4 nm 處為其特征吸收峰。

圖2 50 mm光程比色皿-阿維菌素原始吸收光譜圖Figure 2 50 mm optical path cuvettes-original absorption spectra of avermectin

圖3 100 mm光程比色皿-阿維菌素原始吸收光譜圖Figure 3 100 mm optical path cuvettes-original absorption spectra of avermectin

又由圖2、圖3 可知，阿維菌素溶液濃度為6 mg·L-1時(shí)50 mm 和100 mm 光程比色皿光譜曲線達(dá)到最高吸光度值，分別為1.01 和2.09?？梢?00 mm 光程比色皿光譜曲線最高吸光度值比50 mm 光程比色皿光譜曲線最高吸光度值高一倍左右，其吸收光譜信號(hào)較強(qiáng)且未出現(xiàn)光譜信號(hào)失真的情況，有利于低濃度檢測(cè)，故本文后續(xù)數(shù)據(jù)處理使用的光譜數(shù)據(jù)為通過100 mm 光程比色皿采集得到的61 個(gè)樣本光譜數(shù)據(jù)。此外，由于阿維菌素農(nóng)藥在波長(zhǎng)為500 nm 之后吸光度無限接近零，基本沒有吸收，包含的光譜數(shù)據(jù)信息有限，研究?jī)r(jià)值較小，故本文后續(xù)數(shù)據(jù)處理波長(zhǎng)范圍選擇200～500 nm，共計(jì)650個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)。

2.2 S-G平滑預(yù)處理

采用平滑窗口寬度為3 的S-G 平滑法對(duì)200～500 nm 波長(zhǎng)范圍的阿維菌素原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑去噪預(yù)處理，預(yù)處理后的光譜圖如圖4所示。由圖3、圖4 可知，經(jīng)過S-G 平滑法預(yù)處理后的光譜曲線變平滑，說明S-G 平滑法提高了光譜的平滑性，降低了噪聲的干擾，優(yōu)化了光譜信號(hào)。

圖4 S-G平滑法-阿維菌素吸收光譜圖Figure 4 S-G smoothing method-absorption spectra of avermectin

2.3 PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.1 SPXY算法劃分樣本集后建立PLS預(yù)測(cè)模型

將原始光譜數(shù)據(jù)和S-G 平滑法預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)采用SPXY 算法校正集和預(yù)測(cè)集分別按2∶1比例和3∶1 比例（SPXY 算法樣本集劃分最常用的兩種比例）進(jìn)行樣本集劃分，分別建立PLS定量分析模型，結(jié)果見表1。

表1 PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 PLS model prediction results

由表1可知，無論是原始數(shù)據(jù)還是原始數(shù)據(jù)經(jīng)SG 平滑法預(yù)處理后采用SPXY 算法進(jìn)行樣本集劃分后，所建立的PLS 模型均有較高的精度，滿足定量分析的要求，說明利用光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法可以快速檢測(cè)水體中生物農(nóng)藥阿維菌素的濃度。

原始數(shù)據(jù)以及原始數(shù)據(jù)經(jīng)S-G平滑法預(yù)處理后，采用SPXY 算法校正集和預(yù)測(cè)集按3∶1比例劃分后建立的模型均比按2∶1 比例建立的模型精度更高，穩(wěn)健性更好，尤其是RPD 值，分別從20.031 2、19.983 3 提升為28.425 5、28.499 7。

數(shù)據(jù)S-G平滑預(yù)處理對(duì)所建立的模型精度影響較小，S-G-SPXY（2∶1）-PLS 模型比Original data-SPXY（2∶1）-PLS 模型效果略差的原因可能是由誤差導(dǎo)致的；而效果最好的是S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型，其R2p為0.998 7，RMSEP為0.070 4，RPD為28.499 7。

2.3.2 PCA-MD 剔除異常樣本和CARS 篩選特征波長(zhǎng)后建立PLS預(yù)測(cè)模型

為了進(jìn)一步優(yōu)化模型，采用PCA-MD算法、CARS算法和PCA-MD 算法結(jié)合CARS 算法分別對(duì)2.3.1 優(yōu)選出的原始數(shù)據(jù)經(jīng)S-G平滑法預(yù)處理后采用SPXY算法校正集和預(yù)測(cè)集按3∶1比例劃分后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除異常樣本處理、篩選特征波長(zhǎng)變量處理以及剔除異常樣本后再篩選特征波長(zhǎng)變量處理，分別建立PLS模型，結(jié)果見表2。

表2 PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 PLS model prediction results

由表1、表2可知，采用PCA-MD 算法剔除異常樣本后建立的S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-PLS 模型比S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型的RMSEP 值小，從0.070 4 降至0.065 1，但R2p 和RPD 值也略有減小，故模型預(yù)測(cè)效果變化不大。

采用CARS 算法篩選特征波長(zhǎng)變量后建立的SG-SPXY（3∶1）-CARS-PLS 模型與S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型相比波長(zhǎng)變量數(shù)明顯減小，從650 個(gè)減少至20 個(gè)，減少了96.92%，簡(jiǎn)化了模型，但其模型預(yù)測(cè)效果變化也不大。

采用PCA-MD算法剔除異常樣本后再采用CARS算法篩選特征波長(zhǎng)變量后建立的S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS 模型篩選出的特征波長(zhǎng)變量數(shù)為28個(gè)，與S-G-SPXY（3∶1）-PLS 模型相比減少了95.69%，其R2p 值為0.998 8，RMSEP 值為0.061 1，RPD 值為29.589 4，模型精度更高，穩(wěn)健性更好，簡(jiǎn)化模型的同時(shí)也有效提高了模型的預(yù)測(cè)效果。

阿維菌素紫外/可見吸收光譜S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS模型具體公式表達(dá)如下：

式中：Y表示阿維菌素農(nóng)藥濃度；Xn表示阿維菌素農(nóng)藥在特征波長(zhǎng)點(diǎn)n處的吸光度值。

阿維菌素不同濃度下S-G-SPXY（3∶1）-（PCAMD）-CARS-PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，阿維菌素濃度樣本校正集的真實(shí)濃度與預(yù)測(cè)濃度的線性擬合圖與預(yù)測(cè)集的真實(shí)濃度與預(yù)測(cè)濃度的線性擬合圖幾乎重合，模型預(yù)測(cè)效果較好，可見利用紫外/可見吸收光譜測(cè)量技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法快速檢測(cè)水體中生物農(nóng)藥阿維菌素濃度是可行的。

圖5 S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS模型預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 5 S-G-SPXY（3∶1）-（PCA-MD）-CARS-PLS model prediction result graph

3 討論

對(duì)于實(shí)際復(fù)雜自然環(huán)境水體，例如農(nóng)田水中生物農(nóng)藥阿維菌素含量的快速檢測(cè)還有待繼續(xù)深入研究。采用光譜儀獲得復(fù)雜自然環(huán)境水體中阿維菌素不同濃度下的復(fù)雜光譜數(shù)據(jù)，建立濃度預(yù)測(cè)模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜自然環(huán)境水體中阿維菌素的快速定性定量分析?？刹捎没瘜W(xué)計(jì)量學(xué)二階校正分析方法如平行因子法（PARAFAC）[16]、交替三線性分解法（ATLD）[17]、自加權(quán)交替三線性分解法（SWATLD）、交替懲罰三線性分解法（APTLD）和多維偏最小二乘法（N-PLS）等對(duì)獲得的復(fù)雜光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分解分析，建立基于二階校正方法的多元回歸濃度預(yù)測(cè)模型。但是對(duì)二階校正方法（上述各種算法）的理解掌握和運(yùn)行是一個(gè)難點(diǎn)，以及使用二階校正方法處理的數(shù)據(jù)必須是二階張量數(shù)據(jù)，即所謂的三維數(shù)據(jù)矩陣（包含的樣本信息更全面，能夠提取的有用信息也相對(duì)變多）。而本文采用光譜儀獲得的數(shù)據(jù)是二維吸光度光譜數(shù)據(jù)矩陣，因此，如何把獲得的二維數(shù)據(jù)構(gòu)建成適用于二階校正方法的三維數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行二階校正分析也是一個(gè)難點(diǎn)。后續(xù)深入研究需注意攻克以上難點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際自然環(huán)境受污染水域的大面積快速篩查監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

（1）采用100 mm 光程比色皿采集阿維菌素溶液樣本從低濃度0.05 mg·L-1到高濃度6.0 mg·L-1所得的光譜吸光度值更好，243.5～247.3 nm 為其特征吸收峰波段，245.4 nm處近似為其特征吸收峰。

（2）利用紫外/可見吸收光譜測(cè)量技術(shù)獲得的不同濃度下的阿維菌素的原始光譜數(shù)據(jù)建立的PLS預(yù)測(cè)模型具有較高的精度，完全滿足定量分析的要求，說明采用紫外/可見吸收光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法快速檢測(cè)純凈水中生物農(nóng)藥阿維菌素濃度是可行的。原始數(shù)據(jù)經(jīng)S-G 平滑、SPXY 算法以3∶1 比例劃分校正集和預(yù)測(cè)集、PCA-MD 算法剔除異常樣本，CARS 算法篩選特征波長(zhǎng)后所建立的PLS 模型更優(yōu)。