師楊杰，靳紅梅，管益東，龍玉嬌，朱燕云，朱寧*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游平原農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，南京 210014；2.南京信息工程大學環(huán)境科學與工程學院，南京 210044；3.江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

近年來，我國化肥過量施用帶來了一系列環(huán)境污染、土壤質(zhì)量退化和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題。隨著農(nóng)業(yè)發(fā)展方式的轉(zhuǎn)變，開發(fā)綠色高效新型肥料是保障我國農(nóng)田生態(tài)安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重大需求。腐植酸是一類以芳香環(huán)和脂肪鏈為基本結(jié)構(gòu)的非均相高分子聚合物[1]，具有酸性、親水性、界面活性、陽離子交換、絡(luò)合及吸附能力[2]。腐植酸含有大量有機質(zhì)和多種活性官能團，可以改良土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤保水、保肥能力，促進植物生長發(fā)育，增強作物抗逆性[3]。腐植酸已成為農(nóng)業(yè)中土壤調(diào)理劑、植物抗旱劑和復(fù)合肥料的主要有效成分，其開發(fā)利用受到肥料研究者和生產(chǎn)企業(yè)的重視。

目前，商品腐植酸的規(guī)模化生產(chǎn)主要是利用化學降解或氧化的方法從泥炭、褐煤及風化煤中提取，在制備過程中需要消耗大量的酸、堿等化學物質(zhì)，還需要高溫、高壓等劇烈條件及嚴格的工藝和特殊設(shè)備[4-5]。生物腐植酸是以有機廢棄物為原料，在人工控制條件下經(jīng)微生物發(fā)酵制備獲得，因其生產(chǎn)成本低、處理條件溫和、無二次污染等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關(guān)注[6]。與礦物腐植酸相比，生物腐植酸分子量小、含有活性基團多，易被植物吸收，具有抗二價離子、抗硬水、抗酸堿的特性，同時含有作物生長所需的氮磷鉀養(yǎng)分以及氨基酸、有機酸、糖類、生物酶等生物活性物質(zhì)[7]。以木質(zhì)纖維素類原料生產(chǎn)生物腐植酸是當前腐植酸研究領(lǐng)域的熱點。尚校蘭等[8]分別利用微生物發(fā)酵法和化學法以巨菌草為底物制備腐植酸，發(fā)現(xiàn)利用毛霉發(fā)酵制備的腐植酸含量是10%氨水提取的腐植酸含量的1.45 倍。王思同等[9]以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌作為菌劑，采用堆肥的方式發(fā)酵菌糠制備生物腐植酸，36 d后生物腐植酸含量達23.3%。呂志偉等[10]利用微生物菌群發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)生物黃腐酸，發(fā)酵7 d后，生物黃腐酸產(chǎn)量為15.70%。然而，利用木質(zhì)纖維素類原料生產(chǎn)生物腐植酸仍存在以下問題：（1）有機廢棄物中各類組分的微生物降解轉(zhuǎn)化是影響其腐殖化進程的限制因素，目前發(fā)酵菌劑大多是單一或少數(shù)幾種菌種混合而成，沒有根據(jù)原料組成特點針對性設(shè)計，導(dǎo)致原料降解轉(zhuǎn)化速率慢，發(fā)酵生產(chǎn)周期長，腐植酸產(chǎn)率低；（2）固態(tài)發(fā)酵工藝尚不成熟，發(fā)酵條件和參數(shù)不明確，導(dǎo)致發(fā)酵過程的穩(wěn)定性差，生物腐植酸產(chǎn)品的質(zhì)量難以保證。因此，極有必要開發(fā)高效復(fù)合微生物菌劑并進行發(fā)酵條件優(yōu)化，這對于縮短腐植酸發(fā)酵生產(chǎn)周期、提高腐植酸產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究從腐殖化作用活躍的森林環(huán)境樣品中分離篩選高效腐殖化功能菌株，并進行發(fā)酵微生物菌劑復(fù)配，以常見農(nóng)業(yè)廢棄物為底物，探究不同發(fā)酵條件對腐植酸產(chǎn)量的影響，明確生物腐植酸的最佳發(fā)酵條件，通過元素分析和紅外光譜研究生物腐植酸的結(jié)構(gòu)特性，以期為生物腐植酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 環(huán)境樣品

本研究分別從吉林松花江三湖國家級自然保護區(qū)（42°57'N，127°09'E）、內(nèi)蒙古額爾古納濕地（50°19'N，120°14'E）和云南蒼山（25°48'N，100°05'E）采集枯木、森林凋落物和表層土樣品。

1.1.2 農(nóng)業(yè)廢棄物

本研究所用農(nóng)業(yè)廢棄物包括麥秸、麩皮、米糠、玉米芯、花生餅、豆粕，其中麥秸取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合試驗基地，麩皮、米糠、玉米芯、花生餅、豆粕購自湖南省商大農(nóng)貿(mào)有限公司，各原料基本性質(zhì)見表1。

表1 原料基本性質(zhì)（g·kg-1）Table 1 Basic properties of raw materials（g·kg-1）

1.1.3 培養(yǎng)基

真菌分離培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA）：馬鈴薯6.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂10.00 g，補加蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌15 min。

腐殖化功能菌株篩選培養(yǎng)基：發(fā)酵體系為150 mL 三角瓶，含麥秸3.00 g、（NH4）2SO40.30 g、蛋白胨0.15 g、麩皮0.30 g、KH2PO40.45 g，調(diào)節(jié)pH 為6、含水率至80%，121 ℃滅菌30 min。

生物腐植酸發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵體系為150 mL 三角瓶，含麥秸3.00 g、麩皮0.45 g、KH2PO40.45 g，調(diào)節(jié)pH為6、含水率至80%，121 ℃滅菌30 min。

1.1.4 商品腐植酸

供試商品腐植酸為濟農(nóng)牌液體腐植酸水溶肥，主要以堿溶液作為萃取劑從風化褐煤中提取。購于江蘇省農(nóng)科院明天種業(yè)公司，相關(guān)技術(shù)指標為：腐植酸≥40 g·L-1，總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）≥800 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株分離

取1 g 環(huán)境樣品充分懸浮于10 mL 無菌水中，梯度稀釋至10-4、10-6、10-8，吸取200μL懸液均勻涂布于PDA 固體培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待長出菌落后，挑取平板上生長良好且形態(tài)特征不同的單菌落，轉(zhuǎn)接至新的PDA 固體培養(yǎng)基進一步純化并傳代2～3次。將分離獲得的真菌菌株轉(zhuǎn)接于PDA 斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定

真菌菌株基因組DNA 提取采用Omega 公司的EZNA Fungal DNA Mini Kit 試劑盒進行提??；利用引物ITS1（正向引物：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增ITS 區(qū)域[11]，純化后的擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；將獲得的測序結(jié)果提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進行Blast 同源性分析，采用MEGA5.2軟件鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 腐殖化功能菌株篩選

（1）種子液制備。28 ℃培養(yǎng)7～10 d，待菌絲長滿整個平板后，用滅菌竹簽刮取培養(yǎng)基表面孢子加入到適量無菌水中，充分振蕩制成孢子懸液，利用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，然后用無菌水調(diào)整孢子濃度至107個·mL-1備用。

（2）腐殖化功能菌株的初篩。將種子液按照1×107個·g-1（以干質(zhì)量計，下同）接種于滅過菌的篩選培養(yǎng)基，無菌條件下攪拌均勻，于28 ℃發(fā)酵15 d。發(fā)酵結(jié)束后，測定腐植酸產(chǎn)量、木質(zhì)纖維素降解酶活力，并進行分子生物學鑒定。

（3）菌株產(chǎn)腐植酸能力測定。發(fā)酵結(jié)束后的樣品參照國際腐殖質(zhì)協(xié)會規(guī)定的方法提取腐植酸[12]，即在1 g 樣品中加入10 mL 提取液（0.1 mol·L-1NaOH+0.1 mol·L-1Na4P2O7，體積比為1∶1），室溫下振蕩2 h，4 000 r·min-1離心10 min，提取上清液，去掉濾渣，濾渣按照上述操作重復(fù)3次提取過程。濾液為總腐植酸，取1/3測定腐植酸，剩下2/3 用6 mol·L-1的鹽酸酸化至pH 1.0～2.0，充分攪拌，室溫下靜置過夜，4 000 r·min-1條件下離心10 min，沉淀物為胡敏酸，沉淀用0.1 mol·L-1KOH溶解，采用重鉻酸鉀氧化法（《水溶肥料腐植酸含量的測定》NY/T 1971—2010）測定腐植酸碳含量。

（4）菌株產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶能力測定。分別以Whatman No.1濾紙、羧甲基纖維素和山毛櫸木聚糖為底物，采用DNS 法測定濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活力[13]，分別以2，6-DMP、藜蘆醇和2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ATBS）測定錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶酶活力[14]。

1.2.4 菌株復(fù)配

采用對峙培養(yǎng)法考察腐殖化功能菌株之間的相容性。用滅過菌的打孔器（直徑5 mm）分別取活化的直徑相同的功能菌株菌餅接于平板（直徑9 cm）直徑線上一側(cè)、距平板邊緣3 cm 處，將不同的功能菌株菌餅接于直徑線另一側(cè)對稱處，即兩株菌餅在平板同一直徑線上相距3 cm、各距平板邊緣3 cm，將篩選出來的功能菌株按照上述方法兩兩組合，28 ℃培養(yǎng)7 d，每日觀察菌落的形態(tài)和生長情況，選擇相容性良好的功能菌株進行復(fù)配。按照1.2.3 中種子液制備方法制備功能菌株種子液，將相同孢子濃度等量混合均勻，獲得復(fù)配后的液體菌劑。

1.2.5 優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)腐植酸條件

采用單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件。在1.1.3 生物腐植酸發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下，種子液接種量為1×107個·g-1，將碳源分別設(shè)為麥秸、麩皮、玉米芯、米糠，將氮源分別設(shè)為尿素、硫酸銨、蛋白胨、豆粕、花生餅，以考察碳源和氮源對生物腐植酸產(chǎn)量的影響。接著在最優(yōu)碳源和氮源的基礎(chǔ)上，將碳氮源質(zhì)量比分別設(shè)為1∶1、1∶0.8、1∶0.5、1∶0.2，將初始含水率分別設(shè)為50%、60%、70%、80%，將接種量分別設(shè)為105、106、107、108個·g-1，于28 ℃發(fā)酵7 d 后測定生物腐植酸產(chǎn)量，分別考察相應(yīng)因素對生物腐植酸產(chǎn)量的影響。最后，在最佳培養(yǎng)基組成和最佳培養(yǎng)條件下分別發(fā)酵5、10、15、20 d，測定生物腐植酸產(chǎn)量，考察發(fā)酵時間對生物腐植酸產(chǎn)量的影響。每個處理3 個平行。

1.2.6 生物腐植酸性質(zhì)分析

將生物腐植酸與市售標準腐植酸凍干得到固體粉末樣品，比較二者的元素組成和表面官能團種類。

（1）元素組成分析。用德國VARIO IP20 型元素分析儀測定兩種腐植酸組分的C、N、H、S 元素含量[15]，通過操作軟件自動計算出待測樣品中元素的百分比含量。用灼燒法測定腐植酸灰分，利用差減法計算得到腐植酸中O元素含量。

（2）紅外光譜。采用傅里葉紅外光譜（FTIR）對生物腐植酸、市售腐植酸進行特征官能團分析。取1～2 mg 凍干固體，利用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet Is50，賽默飛世爾科技公司，美國）進行紅外光譜分析，波數(shù)采集范圍為4 000～400 cm-1。紅外譜圖數(shù)據(jù)處理[16]：將樣品透射率轉(zhuǎn)換為吸光度之后，進行基線自動矯正，利用OMNIC9 軟件對樣品圖譜進行峰面積計算。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS Statistics 26.0v.進行不同樣本數(shù)據(jù)之間的差異顯著性分析，多重比較采用Duncan 法（α=0.05），采用Origin 2019b制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌株分離及鑒定

本研究從吉林、內(nèi)蒙古和云南的枯木、森林凋落物和表層土樣品中篩選得到14 株真菌，并對其進行編號。分別提取這14 株菌總DNA 擴增ITS 序列并測序，提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫比對選取與每個真菌菌株序列同源性最高的前10個菌株ITS序列，使用MEGA5.2軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過與已知菌株序列進行比對，獲得其分類學地位信息，包括5 株深綠木霉（OR041595、OR041596、OR041593、OR041594、OR041605）、1株雜色曲霉（OR041599）、1 株裂褶菌（OR041598）、1 株擬康氏木霉（OR041601）、1 株哈茨木霉DLT21（OR041602）、1 株康氏木霉（OR041603）、1 株絨毛木霉（OR041604）、1 株硫色木霉（OR041606）、1 株雅致小克銀漢霉（OR041607）、1 株托姆青霉（OR041604），其中木霉屬真菌數(shù)量最多，且在3 個采樣地均有分布，表明木霉菌對不同環(huán)境均有較強適應(yīng)性。

2.2 腐殖化功能菌株篩選和復(fù)配

以小麥秸稈為原料，分別利用14 株真菌進行固態(tài)發(fā)酵，腐植酸產(chǎn)量如圖1 所示。由圖1a 可看出，哈茨木霉DLT21 總腐植酸產(chǎn)量最多，為299 mg·g-1，其次是絨毛木霉DLS32 和裂褶菌JLD3，其總腐植酸產(chǎn)量分別為281、281 mg·g-1?？偢菜岙a(chǎn)量最少的是雅致小克銀漢霉DLS21，為125 mg·g-1。不同屬菌株的腐殖化能力差異明顯，這歸因于菌株的產(chǎn)酶能力不同，對底物的降解轉(zhuǎn)化能力不同。由圖1b 可看出，哈茨木霉DLT21 胡敏酸產(chǎn)量最高，為96 mg·g-1，其次是雜色曲霉JLS2，為83 mg·g-1，這兩株菌胡敏酸產(chǎn)量顯著高于其他菌株。

圖1 功能菌株的生物腐植酸產(chǎn)量Figure 1 BHS production of functional strains

微生物在降解木質(zhì)纖維素過程中會產(chǎn)生腐植酸的重要前體酚類物質(zhì)[17]，因此木質(zhì)纖維素降解酶活力是篩選腐殖化功能菌株的重要指標。各功能菌株酶活力如圖2 所示。對于纖維素酶，裂褶菌JLD3、硫色木霉DLL42 和雜色曲霉JLS2 濾紙酶活力顯著高于其他菌株酶活（圖2a）。裂褶菌JLD3、雜色曲霉JLS2 和絨毛木霉DLS32 內(nèi)切葡聚糖酶活力明顯高于其他菌株酶活（圖2b）。對于半纖維素酶，在14 株菌中托姆青霉DLL22 木聚糖酶活力最高，其次是裂褶菌JLD3和哈茨木霉DLT21（圖2c）。對于木質(zhì)素降解酶，擬康氏木霉DLS12高產(chǎn)錳過氧化物酶，其余菌株產(chǎn)錳過氧化物酶能力無顯著差異（圖2d）。所有菌株均未檢測到木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶活力。

圖2 功能菌株的木質(zhì)纖維素降解酶活性Figure 2 Lignocellulose-degrading enzyme activities of functional strains

以菌株產(chǎn)腐植酸和產(chǎn)酶能力為衡量指標選擇腐殖化功能菌株，14 株菌中哈茨木霉DLT21、絨毛木霉DLS32、裂褶菌JLD3 和擬康氏木霉DLS12 腐植酸產(chǎn)量最高，裂褶菌JLD3 產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶能力強于其他菌株，擬康氏木霉DLS12的木質(zhì)素降解酶活力較高，因此選擇這4 株功能菌株進行菌劑復(fù)配。雖然托姆青霉DLL22、硫色木霉DLL42和雜色曲霉JLS2也表現(xiàn)出較高的產(chǎn)腐植酸或產(chǎn)酶水平，但由于這些真菌在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生真菌毒素，所以在菌劑復(fù)配中予以排除。

為了考察四株功能菌株的相容性，采用對峙培養(yǎng)法將功能菌株兩兩組合接于平板，觀察菌株生長情況，各功能菌株相容性結(jié)果如圖3 所示，各平板兩菌株之間未出現(xiàn)抑菌圈且交叉點生長良好，表明這四株真菌均不產(chǎn)生拮抗作用。將這四株真菌按照相同孢子濃度等量混合均勻，獲得復(fù)配后的液體菌劑，用于后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖3 功能菌株的相容性Figure 3 Compatibility of functional strains

2.3 復(fù)合菌劑發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對腐植酸產(chǎn)量的影響

不同碳源含類腐殖質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不同，對真菌轉(zhuǎn)化碳源底物形成腐植酸具有重要影響[18]。如圖4a 所示，當以麩皮、玉米芯為碳源時，總腐植酸、胡敏酸產(chǎn)量最高，且無顯著差異性。但以麩皮為碳源時，總腐植酸產(chǎn)量最高，為178 mg·g-1，這可能是由于麩皮的TOC、TN、TP和TK含量高于其他碳源（見表1）。另外，麩皮中含有的礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進菌體代謝，所以選擇麩皮作為最佳碳源。

圖4 不同發(fā)酵條件對生物腐植酸產(chǎn)量的影響Figure 4 Effects of different fermentation conditions on the yield of humic substrance

2.3.2 氮源對腐植酸產(chǎn)量的影響

不同氮源可以為腐殖化過程提供不同的前體物質(zhì)[19]。氮源對腐植酸產(chǎn)量影響如圖4b 所示，當豆粕作為氮源時，腐植酸產(chǎn)量顯著高于其他氮源，其總腐植酸、胡敏酸產(chǎn)量分別為180、69 mg·g-1，這可能是因為豆粕中TOC 和TN 含量較高，并且豆粕中豐富的蛋白質(zhì)提供了更多氨基酸等腐植酸前體物質(zhì)，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生了更多的腐植酸。

2.3.3 碳氮源質(zhì)量比對腐植酸產(chǎn)量的影響

碳氮源形成的C/N 影響著有機質(zhì)的分解速率和降解程度，進而影響腐植酸的形成[20]。由圖4c 可知：當碳氮源質(zhì)量比較小時，總腐植酸產(chǎn)量顯著高于碳氮源質(zhì)量比較大時的總腐植酸產(chǎn)量。當調(diào)節(jié)碳氮源質(zhì)量比為1∶0.8 時，總腐植酸產(chǎn)量達到最高，為275 mg·g-1，此時胡敏酸的產(chǎn)量也是最高的，為96 mg·g-1。

2.3.4 初始含水率對腐植酸產(chǎn)量的影響

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水率通過影響通氧量從而影響微生物發(fā)酵的腐植酸產(chǎn)量[21]。圖4d 表明調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基含水率對總腐植酸產(chǎn)量無顯著差異性，但培養(yǎng)基含水率為70%時，總腐植酸產(chǎn)量最高，為316 mg·g-1，此時對應(yīng)的胡敏酸產(chǎn)量也較高，為90 mg·g-1。

2.3.5 菌劑接種量對腐植酸產(chǎn)量的影響

接種量會直接影響菌株在培養(yǎng)基質(zhì)中的發(fā)酵速度和生產(chǎn)效率。功能菌株菌劑接種量對腐植酸產(chǎn)量的影響如圖4e 所示，總腐植酸產(chǎn)量隨菌劑接種量改變而改變，而胡敏酸產(chǎn)量隨著菌劑接種量的改變無顯著性差異。當孢子接種量為107個·g-1時，總腐植酸產(chǎn)量最高，為279 mg·g-1，此時胡敏酸產(chǎn)量為88 mg·g-1。

2.3.6 發(fā)酵時間對腐植酸產(chǎn)量的影響

由圖4f可知，腐植酸產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長呈增加趨勢，總腐植酸產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加，當發(fā)酵20 d 時，總腐植酸產(chǎn)量均最高，分別為338 mg·g-1；胡敏酸產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間延長呈略微增加趨勢，但并不顯著，其產(chǎn)量在82～105 mg·g-1之間。當發(fā)酵時間分別為15 d和20 d時，總腐植酸產(chǎn)量無顯著差異，考慮到實際生產(chǎn)成本，因此選擇發(fā)酵15 d 作為最優(yōu)發(fā)酵時間，此時總腐植酸產(chǎn)量為311 mg·g-1。

2.4 生物腐植酸結(jié)構(gòu)特性分析

2.4.1 生物腐植酸元素含量分析

腐植酸主要由碳（C）、氫（H）、氧（O）三種元素組成，其次含有少量氮（N）和硫（S）元素[22]。由表2 可知，生物腐植酸中C 元素含量最多，為41.03%，O 元素次之，為26.09%，均低于商品腐植酸C、O 元素含量，而生物腐植酸中N、H 元素含量分別是商品腐植酸的4.63 倍和2.48 倍，這進一步影響了兩種腐植酸的C/H、O/C、C/N。C/H 被認為是腐植酸分子縮合度的評價指標，C/H 值越小，表明腐植酸縮合度越低[23]，生物腐植酸的C/H 小于商品腐植酸，表明生物腐植酸縮合度低于商品腐植酸。O/C 表征腐植酸的氧化程度，反映了腐植酸中含氧官能團含量，O/C 值越大，說明腐植酸中含氧官能團越多[24]，生物腐植酸O/C 值小于商品腐植酸，表明生物腐植酸含氧官能團含量低于商品腐植酸。另外，生物腐植酸的C/N 值小于商品腐植酸，表明生物腐植酸含氮基團較多。

表2 腐植酸元素分析Table 2 Element analysis of humic substrance

2.4.2 生物腐植酸紅外光譜分析

FTIR 是研究腐植酸官能團種類的重要方法之一。圖5 中峰1（3 500～3 200 cm-1）是的伸縮振動，化合物來源主要為多糖、纖維素[25]；峰2、峰3（3 000～2 800 cm-1）是指表征脂肪和脂質(zhì)類化合物的亞甲基CH2的伸縮振動[26]；峰4（1 630 cm-1）是表征羧酸根的伸縮振動[27]；峰5（1 590～1 540 cm-1）表征酰胺類化合物的伸縮振動；峰6（1 480～1 340 cm-1）代表羧酸根離子的非對稱伸縮振動；峰7（1 320～1 240 cm-1）代表羧基上的伸縮振動；峰8（1 120～990 cm-1）代表酚類或醇類上的不對稱伸縮振動；峰9（920～800 cm-1）代表伸縮振動。生物腐植酸的官能團種類與商品腐植酸類似，但兩種腐植酸的官能團含量存在較大差異，生物腐植酸中峰1、峰2、峰3、峰5、峰8代表的基團伸縮振動較強烈，表明生物腐植酸中含有較多的羥基、亞甲基和酰胺基官能團。

圖5 腐植酸的FTIR圖譜Figure 5 FTIR spectra of humic substrance

3 討論

不同微生物的木質(zhì)纖維素降解酶系組成不同，導(dǎo)致其對木質(zhì)纖維素的降解轉(zhuǎn)化能力也存在差異，進而影響菌株的腐殖化能力。本研究篩選得到的裂褶菌JLD3、絨毛木霉DLS2、哈茨木霉DLT21和擬康氏木霉DLS12四株功能菌株可以分別產(chǎn)生纖維素降解酶、半纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶，能夠降解發(fā)酵原料中的大分子有機物，生成腐植酸前體物質(zhì)，復(fù)配后菌劑的腐植酸產(chǎn)量較單一菌株均有所提高。本試驗中對復(fù)合菌劑發(fā)酵條件優(yōu)化后腐植酸產(chǎn)量達到338 mg·g-1，較優(yōu)化前腐植酸產(chǎn)量提高了32%～128%，而冀頤之等[28]利用解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和長枝木霉組成復(fù)配菌劑，以果渣為底物發(fā)酵產(chǎn)生的黃腐酸僅為103 mg·g-1。陳勇強[29]以玉米秸稈和麩皮作為底物，利用枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化，其腐植酸產(chǎn)量為196 mg·g-1。本研究結(jié)果較二者分別提高了202%和59%。此外，本研究經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，接種復(fù)合菌劑制備腐植酸顯著縮短發(fā)酵周期，15 d腐植酸產(chǎn)量達34%，而王思同等[9]利用細菌菌劑進行36 d 的菌糠發(fā)酵，腐植酸產(chǎn)量為23%。本文結(jié)果表明，根據(jù)原料組成特點進行功能菌株的合理復(fù)配，可以顯著提高農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵制備生物腐植酸的產(chǎn)量。

本研究利用復(fù)配的微生物菌劑對常見的農(nóng)業(yè)廢棄物進行固態(tài)發(fā)酵，對發(fā)酵條件優(yōu)化后提高了生物腐植酸產(chǎn)量。本研究表明，固態(tài)發(fā)酵中碳源、氮源以及碳氮源質(zhì)量比對腐植酸產(chǎn)量的影響較其他發(fā)酵條件的影響更大。以麩皮為碳源時，復(fù)合菌劑產(chǎn)腐植酸量明顯高于其他碳源，這可能是因為麩皮中富含的具有生理活性的酚類物質(zhì)是腐植酸形成的重要前體物質(zhì)[30-31]。以豆粕為氮源時復(fù)合菌劑產(chǎn)腐植酸量顯著高于其他氮源，這可能是因為豆粕中含有的蛋白質(zhì)及少量可溶性多糖有助于微生物的生物量積累[32]。有研究指出，腐植酸的酚型化合物和醌型化合物等前體物質(zhì)在微生物作用下與蛋白質(zhì)、氨基酸等氨基化合物經(jīng)過復(fù)雜作用形成腐植酸[33]，因此通過調(diào)節(jié)麩皮和豆粕的質(zhì)量比，使發(fā)酵體系中酚類物質(zhì)與氨基化合物達到適宜比例，從而顯著提高了復(fù)合微生物菌劑發(fā)酵的腐植酸產(chǎn)量。本研究制備生物腐植酸用的麥麩、豆粕等原料都屬于農(nóng)副產(chǎn)品、價格低廉，按照腐植酸產(chǎn)率為原料30%計算，生產(chǎn)每千克腐植酸成本為63元，而市場現(xiàn)有腐植酸價格普遍較高，成本為每千克75～140 元，因此本研究技術(shù)在實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物原料高效轉(zhuǎn)化的同時，極大地降低了生物腐植酸的生產(chǎn)成本，具有較強的市場競爭力。

兩種不同來源的腐植酸在元素組成及FTIR 圖譜具有相似特征，兩種腐植酸中C、O 元素含量均最高，腐植酸結(jié)構(gòu)中都存在等官能團，這與前人研究結(jié)果一致[34]。本研究中生物腐植酸的C、O 元素含量都略低于商品腐植酸，這可能是因為商品腐植酸的提取方式改變了其組成，使得商品腐植酸C、O 含量較高。生物腐植酸的N、H 元素含量均高于商品腐植酸，這可能是制備生物腐植酸的原料中蛋白質(zhì)含量較高所致。另外，兩種腐植酸官能團種類相似，但官能團含量存在較大差異性，生物腐植酸中、CH2和的伸縮振動較強烈，表明生物腐植酸中此類官能團含量較高，與生物腐植酸中N、H元素含量高相一致，這主要是由于生物腐植酸中含有較多糖類、脂質(zhì)類物質(zhì)。

4 結(jié)論

（1）本研究從森林環(huán)境樣品中篩選獲得4 株具有高效木質(zhì)纖維素腐殖化能力的真菌菌株，包括哈茨木霉DLT21、絨毛木霉DLS32、裂褶菌JLD3 和擬康氏木霉DLS12，各菌株之間具有良好的相容性和互補的降解酶系，通過4株真菌組配構(gòu)建了復(fù)合微生物菌劑。

（2）利用復(fù)合微生物菌劑進行產(chǎn)腐植酸固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，明確最佳發(fā)酵條件為：麩皮為碳源、豆粕為氮源、碳源與氮源質(zhì)量比為1∶0.8、培養(yǎng)基含水率為70%、孢子接種量為107個·g-1（以干質(zhì)量計），發(fā)酵20 d 時，總腐植酸產(chǎn)量達338 mg·g-1。

（3）與商品腐植酸相比，本研究制備獲得的生物腐植酸具有更高的N、H 元素含量以及更多的羥基、亞甲基和酰胺基官能團。