張志會，滕蔓，鄭鹿平，劉金玲，王培增，王偉東，張文凱，5，樊劍鳴，羅俊，5*

(1. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；4. 清豐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 清豐 457300；5. 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)感染引起的一種重要的家禽免疫抑制病與腫瘤病，臨床感染發(fā)病雞主要表現(xiàn)為嚴重的免疫器官萎縮、神經(jīng)損傷和內(nèi)臟多發(fā)性T細胞淋巴瘤，最終導(dǎo)致感染雞群大批死亡，每年給我國和世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。MDV屬于α皰疹病毒亞科、馬立克病病毒屬，根據(jù)離株抗原性的差異，此前曾將MDV分為3種不同的血清型，包括對宿主具有致病性和致瘤性的血清1型(MDV-1)，對宿主完全無致病性的血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3)，后者也被稱為火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT)。在最新的病毒學(xué)分類中，MDV-1，MDV-2和HVT已被分別重新歸類為禽α皰疹病毒2型(Gallidalphaherpesvirus2，GaAHV-2)，禽α皰疹病毒3型(Gallidalphaherpesvirus3，GaAHV-3)和火雞α皰疹病毒1型(Meleagridalphaherpesvirus1，MeAHV-1)[2]。根據(jù)對宿主雞的致病性差異，Witter(1997)提出將MDV-1分離株又進一步分為多種不同毒力的致病型，包括弱毒MDV(mild MDV，mMDV)，強毒MDV(virulent MDV，vMDV)，超強毒MDV(very virulent MDV，vvMDV)和特超強毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)。

為了預(yù)防和控制MD的流行和疫情發(fā)生，MD疫苗自上世紀70年代首次研制成功后，便開始在雞群中得到廣泛應(yīng)用，對MD的早期防控做出了巨大貢獻。這不僅是世界上首個用疫苗成功預(yù)防腫瘤性疾病發(fā)生的案例，而且在很大程度上保障了世界家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。然而，自MD疫苗問世至今長達50年的廣泛應(yīng)用和免疫壓力下，MDV的毒力也在持續(xù)增強。近年來，部分流行毒株的遺傳進化和變異，更是已經(jīng)突破了傳統(tǒng)MD商品疫苗株如HVT、SB-1和CVI988/Rispens(CVI988)的免疫保護，導(dǎo)致我國和全球MD疫情頻發(fā)[3-6]。顯然，為了更好地保障世界養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展盡快研發(fā)新一代安全高效的MD疫苗已勢在必行。因此，本文回顧了MD傳統(tǒng)疫苗的研究發(fā)展史及已取得的重大歷史成就，重點對當(dāng)前國內(nèi)外各種新型MD疫苗、尤其是基因工程疫苗和基因編輯疫苗的最新研究進展進行了綜述，同時對今后面臨的重大挑戰(zhàn)和發(fā)展前景進行了展望，以期為MD新型疫苗的創(chuàng)制及MD的有效防控提供重要參考。

1 MD傳統(tǒng)疫苗

20世紀60年代，英國霍頓家禽研究站(Houghton Poultry Research Station，HPRS)的科學(xué)家Churchill(1969)首次發(fā)現(xiàn)，從羅德島紅雞中分離出來的MDV-1毒株 HPRS-16可用于MD的免疫和預(yù)防。HPRS-16的首次使用，證明了用疫苗預(yù)防MD的可能性，但很快被非致病性HVT疫苗株FC-126所取代。1970年，Witter(1970)從火雞體內(nèi)分離獲得HVT FC-126，該毒株對雞完全無致病性，并且被證明對MDV的感染具有很好的免疫保護作用。作為首個商業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用的MD疫苗，HVT疫苗為應(yīng)對早期的MD暴發(fā)流行及有效防控發(fā)揮了關(guān)鍵作用，至今仍在全球使用，為世界養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展做出了巨大貢獻。1972年，Rispens(1972a)發(fā)現(xiàn)荷蘭某商業(yè)雞群中未發(fā)生MD疫情但卻呈現(xiàn)抗體陽性，隨后從中分離出一個低致病性的MDV-1毒株并命名為CVI988。CVI988可通過直接接觸傳播，接種宿主雞后可立即產(chǎn)生高度的免疫保護，體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出完全無毒力的同時還保留了抗原性和擴散能力，并且無母源抗體的易感雛雞接種MDV初期也只引起較弱的病變。同時，Rispens(1972b)發(fā)現(xiàn)安全性和效力試驗也證實接種CVI988僅具有極低的早期死亡率，對雞群的體重和產(chǎn)蛋等生產(chǎn)性能指標(biāo)也無負面影響。1973年至今，CVI988已在全球許多國家獲得批準上市。在過去的數(shù)十年中，CVI988一度被認為是預(yù)防MD效果最好的疫苗，被稱為MD疫苗的“金標(biāo)準”。為了紀念Rispens的巨大貢獻，該疫苗又被稱為CVI988/Rispens。1978年，Schat(1978)又分離出SB毒株并獲得其克隆株SB-1，它們的體外生長特征與其他非致病性毒株明顯不同。在血清學(xué)上SB毒株可與致病性的MDV-1毒株和非致病性的HVT區(qū)分開，因而將其劃分為MDV-2。研究發(fā)現(xiàn)，SB不會引起MD病變，是一個非致瘤性毒株，并且SB-1可保護雞免受MDV-1強毒的攻擊。在我國，20世紀80年代之前僅使用過非致病性的MDV-2和MDV-3疫苗，但在東北地區(qū)暴發(fā)MD疫情后，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所童昆周(1984)從連續(xù)多年無MD發(fā)病癥狀的某雞場健康雞群中分離獲得814毒株。814是中國特有的MDV-1自然弱毒株，具有抗母源抗體干擾的能力且性能較穩(wěn)定，是中國使用的第一個國產(chǎn)MD疫苗株，至今仍在廣泛使用。

綜上所述，20世紀70和80年代(圖1和表1)，國內(nèi)外科學(xué)家研發(fā)的MD經(jīng)典疫苗為全球各國MD的有效防控做出了巨大貢獻。然而，近年來隨著MDV毒力不斷增強，尤其是vvMDV、vv+MDV和變異毒株的出現(xiàn)，現(xiàn)有MD商品疫苗對部分流行毒株已不能提供良好的免疫保護，亟需研發(fā)新的疫苗或調(diào)整免疫方案來更好地應(yīng)對新的挑戰(zhàn)。因此，有研究者如Calnek(1983)、Witter(1987)、徐宜為(1990)和Umthong[7]等，嘗試將現(xiàn)有的經(jīng)典疫苗株進行組合，生產(chǎn)二價或三價MD疫苗如HVT+SB-1、HVT+CVI988、HVT+CVI988+SB-1等，這些多價疫苗對MDV的感染和攻擊表現(xiàn)出了不同效力的免疫保護，但卻依然不能提供完全保護。除此之外，Schat(1985)研究表明通過連續(xù)傳代衰減，可有效降低MDV體內(nèi)病毒滴度以及傳染能力，美國科學(xué)院院士Witter教授在20世紀80年代開始也曾嘗試將不同MDV-1毒株在CEF上連續(xù)傳代致弱、以提高其對MD的免疫保護效力，但在將近20年的研究中并未發(fā)現(xiàn)任何毒株優(yōu)于CVI988。因此，除了利用基因工程方法研發(fā)新的MD疫苗之外，常規(guī)的病毒學(xué)方法已難以獲得比CVI988更好的疫苗株[8]。鑒于經(jīng)典的MD疫苗對當(dāng)前流行的MDV毒株的免疫保護效力明顯降低，迫切需要利用新技術(shù)新方法來研發(fā)安全可靠的新型高效疫苗，如重組載體疫苗或基因編輯工程疫苗等，以更好地應(yīng)對新發(fā)vv+MDV和變異株帶來的嚴峻挑戰(zhàn)。

表1 MD經(jīng)典疫苗和新型疫苗候選毒株背景信息

圖1 過去50年MD經(jīng)典疫苗和基因工程疫苗研究發(fā)展史

2 MD基因重組疫苗

MD基因重組疫苗，是將外源基因整合在對病毒增殖或傳染性非必需的區(qū)域上，利用非致病性的MDV活病毒載體，在宿主體內(nèi)同時表達一種或多種外源病毒抗原基因的重組載體疫苗。此類疫苗具有一劑免疫預(yù)防多種疾病、降低養(yǎng)殖成本、提升免疫效果的優(yōu)勢。早在20 世紀 90 年代，就有學(xué)者如Nazerian(1996)和Heine(1997)，將禽痘病毒(fowl pox virus，F(xiàn)PV)作為載體表達MDV編碼的單個基因(如gC、gD、UL47、UL48)或者同時表達多個基因(如gB、gE和gI或gB、gE、gI和UL32)，從而達到免疫保護效果，但這些疫苗免疫效果不如CVI988，并且雞體存在的 FPV 母源抗體會產(chǎn)生抑制疫苗免疫的效果，因而不具備商業(yè)化價值[9]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，由于 HVT不受母源抗體干擾，可以刺激體液免疫和細胞免疫并誘導(dǎo)終身保護，將其作為病毒載體表達外源抗原蛋白多數(shù)表現(xiàn)出較好的免疫效果。因此，作為家禽使用最廣泛且安全有效的MD疫苗之一，HVT被認為是表達其他禽類病原體保護性抗原蛋白的良好病毒載體[10]。自20世紀90年代至今(圖1和表1)，HVT已被廣泛用于研究和開發(fā)家禽重大傳染病如禽流感(avian influenza，AI)，新城疫(Newcastle disease，ND)，傳染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)，傳染性喉氣管炎 (infectious laryngotracheitis，ILT)等的重組載體疫苗[11-14]，以期賦予家禽出色持久的免疫保護。早期認為，同時接種多種HVT載體疫苗或許可以同時應(yīng)對多種病毒感染。但事實證明，不同的HVT載體疫苗之間會產(chǎn)生相互干擾，僅通過多種疫苗的簡單組合難以實現(xiàn)強大的多重免疫保護目的[15]，這可能是由于不同疫苗株在宿主體內(nèi)增殖速度不同所致[8]。為解決此問題，Gergen等[16]將 NDV的融合蛋白(F)基因和來自ILTV的 gD 和 gI 基因插入到HVT基因組非必需區(qū)域US2中構(gòu)建了雙重重組病毒(HVT-NDV-ILT)，在細胞培養(yǎng)和感染雞中連續(xù)傳代后，該重組病毒在遺傳和表型上均完全穩(wěn)定，證明HVT作為病毒載體有能力接受多個外源基因的插入，可以用于開發(fā)針對多種不同家禽疫病的HVT載體疫苗。之后，通過US2基因位點，還有研究人員構(gòu)建出一種同時含有NDV-F基因和IBDV-VP2基因的雙重HVT重組疫苗(HVT-ND-IBD)，該疫苗可以同時抵抗MDV、NDV和IBDV的攻擊，進一步證實外源基因的插入并未改變HVT載體的安全性[17]。如表1 列示，這種可同時表達多種外源基因或抗原蛋白的HVT載體疫苗[18-24]，為MD基因工程重組疫苗的研發(fā)打開了新的思路，這也是通過改變疫苗研發(fā)策略來控制家禽傳染病的重大技術(shù)創(chuàng)新之一。

最近10年，一些科學(xué)家也開始嘗試利用MDV-1疫苗株或候選毒株(如CVI988、814、GX0101Δmeq、rLMSΔMeq)和MDV-2疫苗株(如SB-1和v301B/1)作為病毒載體(表1 和圖1)研發(fā)MD基因重組疫苗[25-30]。為了便于讀者更好地理解，本文對用于上述研究的3種不同血清型MDV載體的相關(guān)基因區(qū)域進行了匯總(圖2和表2)。目前，部分HVT 載體疫苗，如Vectormune-ND(詩華)、Innovax-ILT、Innovax-ND-IBD和Innovax-ND-ILT(英特威)、Vaxxitek?HVT+IBD(vHVT-013-69株)、Vaxxitek?HVT+IBD+ND和 Vaxxitek?HVT+IBD+ILT(勃林格殷格翰)等已得到商業(yè)化許可和推廣應(yīng)用[31]。2022年，勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司(Gainesville生產(chǎn)廠)生產(chǎn)的HVT-IBD疫苗(vHVT-013-69株)在我國的變更注冊剛剛獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的正式批準。

表2 MD基因重組疫苗外源基因插入位點及候選疫苗株列表

圖2 MD基因重組疫苗候選毒株外源基因插入位點示意圖

3 MD基因缺失疫苗

利用傳統(tǒng)的基因同源重組系統(tǒng)(homologous recombination system，HRS)，黏粒(cosmid)或 F 黏粒(fosmid)基因組文庫技術(shù)，細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)和基因同源重組技術(shù)，可以有效地對MDV基因組中特定的基因或位點進行操作獲得重組病毒，如敲除MDV編碼的關(guān)鍵基因pp38[32]、vTR[33]和vIL-8[34]等，但獲得的相關(guān)疫苗候選株對雞仍存在一定致病性，未能商業(yè)化應(yīng)用。meq基因是MDV特有的致瘤基因，Jones(1992)提出其表達的Meq蛋白結(jié)構(gòu)與腫瘤蛋白FOS結(jié)構(gòu)相似，被認為是一種致瘤蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子。Lupiani等[35]在敲除MDV強毒株的meq基因后，發(fā)現(xiàn)病毒雖然不再具有致瘤作用，并且在meq回復(fù)表達后病毒顯示出與親本毒相似的特性，表明meq在MDV致瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，將meq基因進行敲除，構(gòu)建一系列的MD基因缺失疫苗候選株，在本世紀的第一個10年已成為新的研究熱點(圖1和表1)。隨著對meq基因缺失毒株的深入研究，發(fā)現(xiàn)雖然其致瘤性喪失，但仍具有一定程度的誘導(dǎo)宿主淋巴器官萎縮的免疫抑制能力。為解決這一問題，2012年Lee等[36]將MDV基因缺失毒株rMd5Δmeq進行傳代致弱，以減弱meq基因缺失毒株導(dǎo)致的淋巴器官萎縮。有趣的是，經(jīng)過傳代致弱，雖然meq基因缺失疫苗的安全性得以提升，但其應(yīng)對vv+MDV的保護作用卻顯著降低。因此，如何平衡MD疫苗的安全性和有效應(yīng)對vv+MDV的感染，是一個亟待解決的問題。2019年，Sun等[37]根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)lorf9基因缺失或可抵消這種淋巴器官萎縮的提示，進一步構(gòu)建了meq和lorf9雙基因缺失的MDV毒株Md5BAC ΔMeqΔLORF9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該候選疫苗株成功消除了誘導(dǎo)宿主淋巴器官萎縮的能力。2021年，Liao等[38]在敲除vv+MDV分離株meq基因的基礎(chǔ)上進一步敲除vIL8基因，獲得了雙基因缺失毒株686BAC-ΔMeqΔvIL8，該基因缺失毒株不僅表現(xiàn)出與CVI988相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo能力，而且與單獨缺失meq基因的毒株相比，誘導(dǎo)宿主淋巴器官萎縮的能力顯著減弱。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在meq基因缺失的基礎(chǔ)上，繼續(xù)敲除MDV編碼的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因，雖然也可減輕感染宿主的淋巴器官萎縮但其免疫保護效果并不好[39]。上述研究結(jié)果為今后開發(fā)更加高效、安全的MD疫苗候選株提供了可能。同時，為了更好地應(yīng)對MDV流行毒株的感染和攻擊，消除meq基因缺失毒株的宿主免疫抑制能力，也是今后疫苗研究的另一項關(guān)鍵任務(wù)。

目前，我國已有2個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的meq基因缺失毒株生產(chǎn)的MD疫苗獲得國家新獸藥注冊證書，分別為SC9-1和rMDV-MS-Δmeq毒株。其中，Li等[40]在vvMDV國內(nèi)分離株GX0101(2001年分離自廣西省發(fā)病雞群)的BAC克隆基礎(chǔ)上，通過同源重組敲除meq基因，從而獲得重組毒株GX0101Δmeq。Su等[41]進一步敲除該毒株攜帶的卡那霉素抗性基因，從而獲得疫苗株SC9-1(即GX0101ΔmeqΔkal)。研究表明，SC9-1對Md5的攻毒免疫保護效果均優(yōu)于CVI988，并且SC9-1的meq基因敲除具有很好的遺傳穩(wěn)定性，各項試驗均表明SC9-1具備良好的免疫保護效果[42]。隨后，Su等[43]又在SC9-1疫苗株的基礎(chǔ)上，利用Cre-LoxP系統(tǒng)敲除病毒基因組中重組的BAC序列，進一步獲得SC9-2候選疫苗株。然而，SC9-2雖然具有免疫保護作用，但其可對宿主產(chǎn)生免疫抑制，暫不具備作為最佳疫苗候選株的條件。隨后為了消除SC9-2引起的宿主免疫抑制，將其在細胞上連續(xù)傳代致弱，得到第10代及第40代毒株并分別命名為SC9-2/10和SC9-2/40，最終動物試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)SC9-2/40對SPF雞的保護作用優(yōu)于CVI988[44]，表明MD疫苗候選株對宿主的免疫抑制作用可通過傳代致弱消除，從而生產(chǎn)一種安全有效的MD疫苗，這與Lee等[45]此前的研究結(jié)論一致。2017年，張艷萍等[46]以體內(nèi)外復(fù)制速度較快的MDV-1分離株LMS(2007年分離自中國西南發(fā)病雞群)為親本毒株[47]，通過BAC克隆和兩次同源重組獲得疫苗候選株rMSΔmeq。進一步的研究證實，該基因缺失毒株可有效應(yīng)對vvMDV標(biāo)準毒株Md5和部分中國變異株(如LCC和LTS)的攻毒并提供良好免疫保護。至今，上述2種meq基因缺失疫苗均已實現(xiàn)科技成果轉(zhuǎn)化、商業(yè)化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。但與傳統(tǒng)的MD經(jīng)典疫苗尤其是液氮苗相比，它們目前的市場占有率仍較小，對我國雞群MD防控成效仍有待進一步觀察。

4 MD基因編輯疫苗

成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和Cas9蛋白組成的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，自2013年Cong等[48]首次成功用于真核細胞的基因編輯以來，近年來也廣泛應(yīng)用于病毒基因組的改造，特別是一些致瘤性病毒和皰疹病毒，已成為病毒學(xué)研究的熱點，如人類乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)[49]，高危人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)[50]以及雞皰疹病毒，鴨腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)[51]，豬偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)[52]等。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，向?qū)NA(gRNA)幾乎可介導(dǎo)Cas9蛋白酶靶向編輯任何基因或位點，從而實現(xiàn)基因組的定點突變、敲除或插入。在病毒學(xué)研究領(lǐng)域尤其是大基因組DNA病毒的基因編輯中，利用該項技術(shù)已取得了一系列重要的研究進展[53-55]，其中包括MDV的基因編輯、功能研究、抗體篩選及疫苗研發(fā)等[56-60]，均展現(xiàn)出了極好的技術(shù)優(yōu)勢。

2016年，Yao等[61]首次報道利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造家禽皰疹病毒的基因組，在HVT中引入靶向突變，快速高效地構(gòu)建相應(yīng)的HVT疫苗載體。最近幾年，國內(nèi)外陸續(xù)報道了多項利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建MDV基因編輯毒株的研究，比如以Md5、GX0101等超強毒株或CVI988疫苗株為對象，敲除其全部或部分meq基因，或者以HVT疫苗株FC-126為載體靶向插入外源病毒基因構(gòu)建重組疫苗株。2019年，Chang等[62]利用基因編輯和同源定向修復(fù)(homologous directed repair，HDR)將H7N9 HA表達盒插入HVT基因組的UL45/46位點(圖2)，構(gòu)建了HVT-H7N9 HA二價疫苗株(表2)，并首次利用CRISPR/Cas9編輯病毒表達的AIV HA蛋白可與紅細胞結(jié)合的特性，來優(yōu)化候選疫苗株的篩選效率。因此，作為穩(wěn)定的疫苗載體平臺之一，HVT疫苗株與新型基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可能會進一步提高基因重組疫苗的實用性。

在最新的研究中(圖1、圖2和表2)，研究人員利用非同源末端連接(non-homology end joining，NHEJ)，CRISPR/Cas9和Cre-LoxP系統(tǒng)3種方法結(jié)合的途徑，將NDV的F蛋白基因插入到HVT基因組UL45/46基因間區(qū)，構(gòu)建的重組病毒rHVT-F可成功應(yīng)對基因XII型NDV野毒株的攻毒[63]。此類利用多種新型技術(shù)構(gòu)建HVT基因編輯的重組疫苗，不僅為病毒載體疫苗研究打開了新的視野，也為更實用更穩(wěn)定的MD疫苗研發(fā)開辟了新方向。有趣的是，Tang等[64-65]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功的將ILTV-gD-gI和H9N2-AIVHA表達盒分別插入到重組病毒HVT-IBDV-VP2基因組的HVT065/066和US2位點，構(gòu)建了三重插入的HVT-VP2-gDgI-HA重組疫苗株。這是首個成功制備的三重重組HVT疫苗候選株，免疫后具有可同時保護家禽的4種主要病毒病如MD、IBD、AI和ILT的潛力。

更有趣的是，2021年Challagulla等[66]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，培育出一種可穩(wěn)定表達靶向MDV編碼的病毒基因ICP4的轉(zhuǎn)基因雞。研究發(fā)現(xiàn)，表達ICP4-gRNAs/Cas9的轉(zhuǎn)基因雞，與僅轉(zhuǎn)染Cas9基因的野生型對照雞相比，攻毒后體內(nèi)的MDV復(fù)制水平明顯減少，說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)或可用于MD的抗病育種，具有潛在的應(yīng)用前景。此外，Liu等[67]使用MDV-1疫苗株814來遞送靶向J亞型禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)長末端重復(fù)序列區(qū)(long terminal repeat，LTR)的Cas9/sgRNA，成功構(gòu)建了r814-Cas9-sgLTR-8疫苗株。這是首次使用皰疹病毒作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的體內(nèi)遞送載體，用于抗病毒基因治療或免疫的報道。這種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)、通過MDV遞送并在體內(nèi)進行ALV-J靶向切除的可行性及有效性，為雞慢性病毒感染的基因治療提供了新思路。上述研究充分利用了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)所具備的快速、高效、簡便的特點，為MD疫苗研究及抗病毒治療開辟了新的途徑。

5 其他新型疫苗

除了前述的MD基因重組疫苗、基因缺失疫苗和基因編輯疫苗之外，科學(xué)家們也一直在嘗試通過不同的方式插入某些特定的外援基因或病毒序列，以期獲得具有特定生物學(xué)功能的疫苗，以期提供更好的免疫保護效果。此前研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)分離株GX0101是一株基因組中自然重組了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)LTR基因片段的MDV-1流行毒株，并且REV-LTR的重組插入可顯著增強MDV的水平傳播能力，具備提升候選疫苗株免疫效果的潛力。2021年，Ellington等[68]將REV-LTR插入到MDV強毒株rMd5的基因組中獲得了Md5-BAC-REV-LTR株，但與早期研究結(jié)果相似，插入REV-LTR應(yīng)對MDV強毒攻擊的免疫保護效果并不理想[69-70]。此后，該研究團隊將Md5-BAC-REV-LTR連續(xù)傳代40次，然后發(fā)現(xiàn)此時的傳代病毒在感染宿主的早期和晚期均未引起免疫抑制，對MDV強毒的早期攻擊也具有高度保護性。這一結(jié)果與Song等[71]將REV-LTR插入到CVI988疫苗株基因組中獲得的研究結(jié)果基本一致。 REV-LTR的插入顯著改變了MDV的部分生物學(xué)特征，比如水平傳播力，但其具體的機制仍有待進一步深入研究。此外，也有研究人員嘗試從利用宿主細胞因子的角度來提升MD疫苗的免疫效力。最近，Kim等[29]在MD疫苗株v301B/1基因組的UL3.5/UL4位點插入了雞白介素-15(IL-15，一種可促進T細胞增殖并增強T細胞反應(yīng)的宿主細胞因子)，從而構(gòu)建了重組疫苗株v301B/1-IL-15，并將雙價苗HVT+v301B/1-IL-15與HVT+v301B/1進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然兩組疫苗之間在免疫保護效果上不存在顯著差異，但插入IL-15具有減少MDV在胸腺復(fù)制或從羽毛囊脫落的潛力，這為今后MD疫苗的進一步優(yōu)化或根據(jù)需要調(diào)整MD雙價苗組合策略提供了新思路。

6 總結(jié)與展望

MD是世界上首個使用疫苗成功預(yù)防腫瘤性疾病發(fā)生的案例，自20世紀70年代至今，MD疫苗的創(chuàng)制及廣泛應(yīng)用已為全球家禽養(yǎng)殖業(yè)挽回了巨大的經(jīng)濟損失。隨著MDV的不斷進化、毒力增強、毒株變異以及新興生物科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，MD新型疫苗的研究和開發(fā)一直是該領(lǐng)域的熱點。目前，全球市場銷售的商業(yè)化MD疫苗，不僅有經(jīng)典的單價苗HVT、SB-1、CVI988、814、MDV-CVTR(肇慶大華農(nóng)，http://www.moa.gov.cn/nybgb/2021/202110/202112/t20211207_6384100.htm)等，還有通過各種技術(shù)手段制備的MD多價苗，如HVT重組載體疫苗株Vectormune-ND(詩華)，Innovax-ILT(英特威)，Innovax-ND-IBD(英特威)，Innovax-ND-ILT(英特威)，Vaxxitek?HVT+IBD(又稱vHVT-013-69，勃林格殷格翰)，Vaxxitek?HVT+IBD+ND(勃林格殷格翰)和Vaxxitek?HVT+IBD+ILT(勃林格殷格翰)等，基因缺失疫苗SC9-1和rMDV-MS-Δmeq，以及二價苗HVT+SB-1、CVI988+HVT、CVI988+814、814+HVT、CVI988+vHVT-013-69等。值得一提的是，利用新一代CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建MD基因重組疫苗、基因缺失疫苗或者病毒載體疫苗，均已取得了良好進展。從不同的角度和采用不同的策略，嘗試提升疫苗株抗原性及免疫效力，將成為未來數(shù)年間MD疫苗研究中最受關(guān)注的方向和內(nèi)容。

然而，在現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的背景下，雖然MD疫苗研究已取得了很多重要進展，但當(dāng)前全球MD的防控仍存在諸多亟待解決的問題。眾所周知，MD疫苗只能預(yù)防野毒感染誘發(fā)的腫瘤形成、神經(jīng)病變以及免疫抑制，但無法阻斷MDV的感染和傳播，不完美的疫苗免疫保護甚至可能促進病毒的毒力增強及傳播[72]，過去50年隨著MD傳統(tǒng)疫苗廣泛持久的應(yīng)用，MDV不斷向毒性更強的方向進化或變異，在疫苗株和野毒株之間也已發(fā)生基因重組并形成新的MDV流行毒株[73]。更重要的是，已有研究表明經(jīng)典的MD單價苗及多價苗，在預(yù)防vv+MDV 感染和攻擊中并未顯示出明顯優(yōu)勢[74]，而最新分離的一些MDV野毒株也已經(jīng)突破了現(xiàn)有主流MD疫苗產(chǎn)品的免疫保護[4，75-76]。顯然，vv+MDV、自然重組毒株、尤其是MDV變異株的相繼出現(xiàn)和流行，進一步增加了MD臨床診斷、免疫預(yù)防和有效控制的難度。

當(dāng)前的MD免疫失敗，究其原因可能與以下幾個主要因素有關(guān)。首先，在過去的20年尤其是最近5～10年間，在巨大的MD疫苗免疫壓力下，中國雞群流行的MDV超強毒株和變異株在遺傳進化路線上，已與傳統(tǒng)的MD疫苗株產(chǎn)生了巨大的遺傳距離[3]，這很可能導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗株的抗原性對當(dāng)前流行毒株或變異株匹配不足。其次，MDV的毒力增強，往往會導(dǎo)致流行毒株的增殖速度加快、潛伏期縮短，而MDV變異株的低水平復(fù)制則可能導(dǎo)致其免疫逃逸能力增強和病程延長，這兩種情況均會增加MD疫苗免疫空窗期野毒感染的機率。最近幾年，對市場銷售的MD傳統(tǒng)疫苗質(zhì)量評估和監(jiān)測結(jié)果顯示，在使用環(huán)節(jié)，部分疫苗尤其是HVT凍干疫苗，活病毒效價未達到國標(biāo)要求，實際應(yīng)用效果令人堪憂[77]，這在一定程度上導(dǎo)致免疫失敗及MD疫情頻繁發(fā)生[5]。

鑒于上述情況，若想獲得更好的免疫防控效果，今后在疫苗研發(fā)和使用上需要很好把握如下關(guān)鍵問題：一是要盡可能使用最新分離自我國雞群的優(yōu)勢流行毒株作為親本株，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的MD新型疫苗。無論是基因重組疫苗、病毒載體疫苗，還是基因缺失疫苗，均需要在平衡好疫苗安全性和免疫效力的同時，盡快實現(xiàn)疫苗株或載體病毒的迭代升級，擴大疫苗免疫保護范圍，更好地應(yīng)對MDV毒力增強和毒株變異帶來的新挑戰(zhàn)。二是充分發(fā)揮現(xiàn)有MD商品疫苗的免疫潛力，在加強流行病學(xué)監(jiān)測、流行毒株致病性分析和疫苗免疫保護效果評價的前提下，調(diào)整免疫程序和接種方式，針對不同品系雞制定最佳的疫苗接種方案，取得最好的免疫防控效果。由于MDV具有嚴格的宿主細胞結(jié)合性，MD疫苗必須以活細胞為載體進行保存、運輸和接種，這無形中增大了MD疫苗在生產(chǎn)、儲存、解凍、稀釋和管理條件等方面的難度。因此，還需要進一步研究提高MD疫苗的生產(chǎn)工藝和操作程序，確保最佳的疫苗效力。MD特超強毒株和變異株的不斷出現(xiàn)，迫切需要盡快研發(fā)出高效、穩(wěn)定、安全的MD新型疫苗以應(yīng)對未來MD免疫防控更加艱巨的挑戰(zhàn)。