趙曉娜，譚笑，朱忠武，周萍，祝賀，陸冠亞，史敏，沈煒，唐泰山*，祝長青，孔繁德

(1. 南京海關(guān)，江蘇 南京 210019；2. 長沙海關(guān)，湖南 長沙 410004；3. 南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 211171；4. 廈門海關(guān)，福建 廈門 361013)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬急性接觸性傳染病，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，其感染導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率可高達100%，對生豬養(yǎng)殖行業(yè)危害極大[1]。ASF是世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

目前，ASFV實驗室檢測方法主要有血清學(xué)和分子生物學(xué)方法。血清學(xué)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、直接熒光試驗(FAT)和間接免疫熒光試驗(IFA)等[2]，分子生物學(xué)方法主要為PCR、熒光PCR、數(shù)字PCR等[3]。PCR技術(shù)簡單方便，但是靈敏度不夠。熒光PCR技術(shù)更為靈敏，但常遇到樣品病毒含量低，Ct值較大而不能確認檢測結(jié)果的情況。數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)，作為一種核酸檢測絕對定量的新技術(shù)，與熒光PCR相比，具有可檢測痕量病毒樣品、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點[4]。目前，該技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)診斷、病原體檢測、食品安全等越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用[5-7]。

本研究在之前建立的熒光PCR方法基礎(chǔ)上，建立和優(yōu)化了可用于定量檢測ASFV的數(shù)字PCR方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)毒株由本課題組保存；豬水泡病病毒(SVDV)核酸由廣州千尋生物公司生產(chǎn)；ASFV陽性豬肉樣品核酸由本課題組保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計和篩選

從GenBank中下載74株ASFV的全基因序列，其中來自非洲21株，歐洲41株，亞洲12株，含11個基因型，其中基因Ⅰ型22株，基因Ⅱ型33株。用DNAStar軟件進行同源性分析，選取同源性較高的CP2475L、B602L基因作為目的片段，用Primer Express 3.0軟件設(shè)計3套數(shù)字PCR引物和探針C1、C2、B1，其中探針的5′ 端標(biāo)記FAM，3′ 端標(biāo)記BHQ1(表1)。所有引物與探針由南京金斯瑞公司合成。

表1 數(shù)字PCR引物和探針

1.2.2 熒光PCR擴增

選取不同來源的ASFV核酸8份作為模板進行熒光PCR擴增，熒光PCR反應(yīng)體系為：qPCR Master Mix(Applied Biosystems)12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，TaqMan探針(20 μmol/L)0.125 μL，DNA模板5 μL，補水至25 μL。擴增程序為預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)。篩選到C1用于下一步的試驗。

1.2.3 熒光PCR特異性和靈敏度

制備ASFV、PRV和PCV-2的DNA，以及PRRSV、CSFV、SIV和SVDV的cDNA，制備家豬、野豬、牛、羊、雞樣品核酸作為動物組織背景，進行熒光PCR擴增，驗證方法的特異性。

取ASFV核酸，用C2上游引物、C1下游引物進行PCR擴增，擴增目的片段大小為1 535 bp，是CP2475L基因的長片段，可用于2種引物的特異性和靈敏性檢測。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa)對PCR產(chǎn)物進行純化，測序比對確認序列的準(zhǔn)確性。雙鏈DNA用超微量分光光度計進行定量，計算拷貝數(shù)后進行10倍倍比稀釋。取10倍倍比稀釋的雙鏈DNA進行熒光PCR擴增，測試方法的靈敏度。

1.2.4 數(shù)字PCR體系和反應(yīng)條件

在C1熒光PCR方法的基礎(chǔ)上建立數(shù)字PCR方法，其過程包括體系配置、微滴生成、PCR擴增、讀取微滴。配置反應(yīng)體系：2×Supermix for Probes(Bio Rad)10 μL，上、下游引物終濃度為0.9 μmol/L，探針終濃度為0.25 μmol/L，模板1 μL，補水至20 μL。轉(zhuǎn)移20 μL反應(yīng)液至微滴生成卡，在生成卡對應(yīng)位置加入70 μL微滴生成油，在微滴生成儀中生成微滴。隨后轉(zhuǎn)移微滴至96孔PCR反應(yīng)板，封膜后置于PCR儀中擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，退火/延伸1 min，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min。擴增結(jié)束后，用微滴讀取儀(Bio-Rad，QX200)讀取微滴熒光信號，在QuantaSoft Droplet Reader 軟件(V1.7.4)中分析結(jié)果。

1.2.5 數(shù)字PCR特異性和靈敏度

取上述7種病毒核酸，5種動物組織核酸(同1.2.3)，進行數(shù)字PCR擴增，觀察陽性微滴的分布及熒光信號強度，判斷數(shù)字PCR方法的特異性。

取10倍倍比稀釋后濃度范圍為104～10-1copies/μL的雙鏈DNA作為模板，每個濃度設(shè)立3個重復(fù)，測試方法的靈敏度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性分析。

1.2.6 空白檢測線(LOB)與最低檢測線(LOD)測定

參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會標(biāo)準(zhǔn)和測定指南(NCCLS EP17-A2)[8]，用數(shù)字PCR對6份陰性樣品進行60次檢測，測定數(shù)字PCR的LOB；對4份含低拷貝ASFV核酸的樣品進行40次檢測，每個反應(yīng)中ASFV核酸含量為2～3 copies，測定數(shù)字PCR的LOD。

1.2.7 臨床樣品檢測

收集50份不同來源的豬組織或含豬組織樣品，分別用建立的數(shù)字PCR、C1熒光PCR方法及WOAH熒光PCR、WOAH常規(guī)PCR方法進行檢測[9]，比較分析不同方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 引物探針篩選

用設(shè)計的3套引物探針對不同來源樣品的ASFV核酸進行熒光PCR擴增。熒光PCRCt值C2與C1相差1.1±0.6，B1與C1相差0.7±0.6，選擇C1進行后續(xù)試驗(表2)。

表2 3套引物探針初篩試驗(n=8)

2.2 熒光PCR靈敏度和特異性

以PRV、PCV-2、ASFV基因組DNA，PRRSV、CSFV、SIV、SVDV的cDNA以及家豬、野豬、牛、羊、雞基因組DNA作為模板，進行熒光PCR擴增，發(fā)現(xiàn)僅有ASFV出現(xiàn)特異性擴增曲線，其他均沒有擴增曲線。

用C1體系擴增濃度為6×108～6×100copies/μL雙鏈DNA，發(fā)現(xiàn)稀釋到6 copies還能擴增出特異性曲線，其中濃度為6×108～6×100copies/μL擴增的Ct值依次為9.27、12.97、16.55、20.10、23.82、27.43、31.01、34.76、38.58，Ct值和雙鏈DNA拷貝數(shù)的對數(shù)相關(guān)性方程為Y=-3.64X+40.99，R2=0.999(圖1)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1～9. 分別為模板DNA的拷貝數(shù)6×108～6×100 copies/μL；10. 陰性對照。圖1 C1熒光PCR的擴增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)

2.3 數(shù)字PCR條件優(yōu)化

設(shè)置3個引物探針濃度組，第1組為(0.65 +0.150)μmol/L，第2組為(0.9 +0.25)μmol/L，第3組為(1.2 +0.35)μmol/L，以相同濃度的雙鏈DNA作為模板進行數(shù)字PCR。結(jié)果顯示第2組和第3組的陽性微滴熒光值與本底之間的差值較大，第2組的陽性微滴產(chǎn)生數(shù)量最多，則最佳PCR引物和探針濃度分別為0.9 μmol/L和0.25 μmol/L。

以相同濃度的雙鏈DNA作為模板，在55～62 ℃之間摸索數(shù)字PCR反應(yīng)最佳退火溫度，8組退火溫度設(shè)定為55、55.5、56.5、57.8、59.4、60.7、61.6和62 ℃。結(jié)果顯示，隨著溫度升高，陽性微滴熒光值不斷降低，綜合分析選擇退火溫度為60 ℃(圖2)。

A01～H01. 依次為62、61.6、60.7、59.4、57.8、56.6、55.5和55 ℃。圖2 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.4 數(shù)字PCR特異性和線性分析

通過對7種病毒核酸和5種動物組織核酸進行的特異性試驗，顯示僅ASFV檢測孔出現(xiàn)陽性微滴，PRV、PCV-2、PRRSV、CSFV、SIV、SVDV以及家豬、野豬、牛、羊、雞均無陽性微滴(圖3)，表明建立的數(shù)字PCR方法有很好的特異性。

A02～G03. 依次為PRV、PCV-2、PRRSV、CSFV、SIV、SVDV，家豬、野豬、牛、羊和雞的組織；E03. ASFV。圖3 數(shù)字PCR特異性試驗

以倍比稀釋的雙鏈DNA作為模板進行數(shù)字PCR，結(jié)果顯示線性回歸系數(shù)R2=0.999，變異系數(shù)均小于3%，ASFV計算拷貝數(shù)與實際檢測拷貝數(shù)呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系(圖4，圖5)，表明其具有較好的重復(fù)性(表3)。

B05、D05. 陰性對照；C06～C07. 1 copies·μL-1；B08～D08. 10 copies·μL-1；B09～D09. 1 00 copies·μL-1；B10～D10. 1 000 copies·μL-1。圖4 數(shù)字PCR的線性分析結(jié)果

圖5 數(shù)字PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 ASFV ddPCR 重復(fù)性試驗

2.5 LOB與LOD

以ASFV核酸作為陽性對照，60次陰性樣本檢測中基本無陽性微滴檢出，根據(jù)NCCLS EP17-A指南，經(jīng)統(tǒng)計分析可得數(shù)字PCR方法的LOB為1.6 copies/μL。為確定方法的LOD，分3次試驗對4個低拷貝樣品進行了40次檢測。根據(jù)EP17-A的指南，統(tǒng)計分析得出數(shù)字PCR方法的LOD為3 copies/μL。臨床檢測中樣品拷貝數(shù)低于1.6 copies/μL，即可判為陰性，高于3 copies/μL可判為陽性，介于兩者之間，需要重新取樣或者提高核酸濃度進行確認。

2.6 臨床樣品檢測

提取50份不同來源的臨床樣品核酸，用建立的數(shù)字PCR、C1熒光PCR方法以及WOAH熒光PCR、WOAH常規(guī)PCR方法對樣品進行檢測。前3種方法均從樣品中檢出12份ASFV核酸，38份樣品未檢出ASFV核酸；WOAH常規(guī)PCR方法從樣品中檢出8份ASFV核酸(表4)。WOAH熒光PCR與C1熒光PCRCt值差值為2.2±1.9(n=12)。

表4 陽性樣品不同檢測方法比較

3 討論

數(shù)字PCR是20世紀90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術(shù)[10]，靈敏度高，可對核酸進行絕對定量，常用于病原體檢測、動物源性成分檢測、轉(zhuǎn)基因檢測等。在非洲豬瘟檢測應(yīng)用方面，鄔旭龍等[11]針對K205R基因建立ASFV 數(shù)字PCR檢測方法；原霖等[12]在WOAH熒光PCR方法的基礎(chǔ)上建立數(shù)字PCR方法；嚴禮等[13]在WOAH熒光PCR方法、團體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMA5—2018熒光PCR方法基礎(chǔ)上建立數(shù)字PCR方法，并與鄔旭龍等[11]建立的方法進行比較。

本研究基于74株ASFV病毒全基因組序列分析，選擇CP2475L基因保守區(qū)段建立數(shù)字PCR方法。ASFV CP2475L基因位于基因組較為保守的C區(qū)，編碼pp220蛋白，pp220相對分子量為281.5 kDa，屬于病毒感染中的晚期蛋白，是構(gòu)成病毒粒子核衣殼的主要成分[14]，目前未見以CP2475L基因作為靶基因的ASFV PCR檢測方法。分析引物探針與74株ASFV基因序列同源性發(fā)現(xiàn)，共計4個位置堿基有錯配的情況發(fā)生，WOAH熒光PCR引物探針有8個位置堿基發(fā)生錯配，引物和探針結(jié)合區(qū)的錯配可能會導(dǎo)致假陰性。2019年，越南研究人員Truong等[15]發(fā)現(xiàn)WOAH推薦的熒光PCR探針結(jié)合位點的單個錯配導(dǎo)致其在ASFV的臨床診斷中出現(xiàn)漏檢，研究人員將WOAH探針21位的堿基C換成Y，WOAH熒光PCR檢測結(jié)果為陰性的樣品用改進后的方法檢出ASFV核酸[16]。

根據(jù)WOAH手冊，ASFV熒光PCRCt值小于40的樣品判為陽性，但在實際臨床應(yīng)用中，Ct值大于35的樣品經(jīng)常會出現(xiàn)擴增曲線不明顯，難以判定結(jié)果的情況。在應(yīng)用建立的數(shù)字PCR方法進行臨床樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，陽性樣品的C1熒光PCRCt值均低于WOAH熒光PCR檢測Ct值；Ct值介于35～40之間且擴增曲線不明顯的樣品，數(shù)字PCR檢測拷貝數(shù)大于LOD，可判定為陽性。因此本研究建立的ASFV 數(shù)字PCR方法在含低拷貝ASFV的樣品確認上具有一定優(yōu)勢，對非洲豬瘟的高效防控和口岸動物疫病檢測具有十分重要的意義。