李雅琪，王玉桂，鄒揚，張月玥，馬平平，葉得河，王帥，馬永華*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室/農(nóng)業(yè)部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要專性胞內(nèi)寄生且具有人畜共患性的機會性致病原蟲，可感染多種脊椎動物[1-3]。由隱孢子蟲感染導致的隱孢子蟲病是人類最常見的6種腹瀉病之一[4]。隱孢子蟲主要通過糞-口途徑和水源傳播[5-6]，其卵囊進入宿主體內(nèi)后，定殖在消化道上皮細胞內(nèi)進行發(fā)育[7-8]。據(jù)現(xiàn)有報道，隱孢子蟲可感染所有脊椎動物，且通?；疾游飼ㄟ^糞-口途徑和水源途徑感染人類，嚴重威脅人類健康[9]。免疫力正常人群感染會出現(xiàn)急性自限性腹瀉，免疫力低下和免疫缺陷人群感染可引起水樣腹瀉，嚴重時會危及患者生命。

研究表明，伴侶動物，特別是寵物犬貓，不僅對寵物主人的心理健康有著正向的影響，同時對于部分疾病也有著輔助治療的作用[10]。寵物貓作為常見的隱孢子蟲宿主，長期與寵主接觸增加了人獸共患傳染病的傳播風險。1979年研究者首次在寵物貓身上發(fā)現(xiàn)了隱孢子蟲[11]。對寵物貓糞便中隱孢子蟲的基因研究表明，其感染蟲種主要為貓隱孢子蟲(Cryptosporidiumfelis)[12-16]。貓隱孢子蟲極易傳染給人類，已有部分亞型在兒童、免疫正常病人、免疫缺陷病人及其他多種動物的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)，貓隱孢子蟲已被列為感染人類的5個重要蟲種之一[3]，并在大量人隱孢子蟲病例中報道。Meng等[11]將1988—2021年貓隱孢子蟲感染全球流行狀況進行了系統(tǒng)性回顧分析，整理繪制出全球貓隱孢子蟲的流行地圖，發(fā)現(xiàn)全球貓隱孢子蟲的感染率在0.6%～40.8%，其中肯尼亞的貓隱孢子蟲感染率為40.8%(95%置信區(qū)間：31.4～50.5)，顯著高于其他國家和地區(qū)，中國地區(qū)的貓隱孢子蟲感染率為3.4%(95%置信區(qū)間：1.8～5.2)。

隱孢子蟲基因組已有幾個遺傳位點被開發(fā)并作為分子診斷工具供臨床使用來鑒定蟲種亞型。其中擴增小亞基核糖體RNA(SSU rRNA)基因位點的方法使用較廣泛[17-18]。本試驗基于SSU rRNA序列采用套式PCR擴增調(diào)查蘭州市寵物貓隱孢子蟲的感染情況，經(jīng)過測序鑒定感染蟲種亞型，分析易感因素，為預防控制隱孢子蟲感染提供理論依據(jù)[19-23]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與保存

2020年1月至2022年6月從蘭州市五大主城區(qū)的寵物醫(yī)院、繁育貓舍及寵物市場獲取寵物貓糞便，保存于一次性無菌離心管中，記錄寵物貓品種、年齡、性別、來源等信息。將樣品及時送回實驗室，保存在-80 ℃冰箱中。各城區(qū)樣品分布情況如圖1所示。

1.2 主要試劑

E.Z.N.A.?Stool DNA Kit 糞便DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司；r-TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、6×Loading Buffer、25 mmol MgCl2、DL1000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；50× TAE購自生工生物工程(上海)股份有限公司；溴化乙錠(EB)購自美國Sigma公司。

M.相對分子質(zhì)量標準；+.陽性對照；-.陰性對照；1～10. 糞便樣品。圖2 隱孢子蟲SSU rRNA套式PCR擴增結果

1.3 糞便DNA提取

為提高糞便純度，先進行預處理。將糞便置于50 mL燒杯中，加入40 mL ddH2O混勻后，用60目的金屬過濾篩過濾，濾液收集在50 mL離心管內(nèi)，8 000 r/min，離心10 min，棄去上清液，沉淀用于后續(xù)試驗。取200 mg沉淀于2 mL無菌離心管中，參照OMRGA E.Z.NVA.?Stool DNA Kit試劑盒說明書提取糞便中的DNA，并于-20 ℃保存。

1.4 套式PCR擴增

基于SSU rRNA序列，引用參考文獻[19]中擴增引物。擴增第1輪上游引物為：5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′，下游引物為：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′；第2輪擴增上游引物為：5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，下游引物為：5′-GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG-3′。引物由西安擎科澤西生物有限公司負責合成。對所提取的DNA樣品進行套式PCR擴增，套式PCR反應體系為25 μL，反應共進行2輪，第1輪擴增產(chǎn)物作為第2輪的模板。

1.5 核酸電泳及測序分析

取終輪PCR產(chǎn)物5 μL與1 μL DNA Loading Buffer混勻后加入含有溴化乙錠(EB)的1.2%瓊脂糖凝膠中，160 V電泳15 min，置于成像系統(tǒng)中拍照檢測，將有目的條帶的PCR樣品原液送至西安擎科澤西生物有限公司進行測序。測序結果用DNAMAN軟件編輯和校準序列，在NCBI網(wǎng)站進行序列比對來確定蟲種亞型。

1.6 統(tǒng)計學分析

以蘭州市寵物貓的年齡、品種、性別、季節(jié)、采樣地區(qū)及樣品來源作為試驗相關因素，利用SPSS 25.0分析軟件中的風險因素和χ2檢驗，分析寵物貓隱孢子蟲的感染率和相關風險因素，通過計算其感染率的優(yōu)勢比(odds ratio，OR)和95%置信區(qū)間，分析貓隱孢子蟲在不同來源、地區(qū)、季節(jié)、年齡、品種及性別之間是否存在顯著差異，當P<0.05或P<0.01時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

1.7 遺傳進化及發(fā)育分析

從NCBI網(wǎng)站的GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載部分貓隱孢子蟲的序列作為參考序列，并將本試驗中的基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫獲取基因號，運用MRGA 11軟件中的最大似然(Maximum Likelihood)法構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 蘭州市寵物貓隱孢子蟲感染情況

運用套式PCR擴增法，對隱孢子蟲的SSU rRNA基因位點進行擴增，在655份樣品中，成功擴增出了26份陽性樣品，總感染率為3.97%(26/655)。部分樣品的凝膠電泳圖如圖1所示，擴增出的目的片段大小約為380 bp。

2.2 不同年齡組寵物貓感染情況

對寵物貓年齡進行分組，分別計算隱孢子蟲感染率，結果顯示，3～10月齡的寵物貓感染率最高為6.16%，1～3月齡寵物貓感染率次之為3.85%，不同年齡段的感染情況詳見表1。感染組中年齡最小為2月齡，最大為4歲3月齡，由此可見，隱孢子蟲可以感染各個年齡段的寵物貓，且各年齡段之間感染情況并無統(tǒng)計學差異。

表1 不同年齡、性別、品種寵物貓隱孢子蟲感染情況

2.3 不同性別寵物貓感染情況

在收集的655份樣品中，雄性樣品占47%，雌性樣品占53%，不同性別的寵物貓感染情況詳見表1。通過計算可知，不同性別之間的感染率無顯著差異。

2.4 不同品種寵物貓感染情況

本試驗共涉及21個常見寵物貓品種，包括中華田園貓、美國短毛貓、英國短毛貓、加菲貓、布偶貓、藍貓、銀點貓、銀漸層貓、金漸層貓、斯芬克斯無毛貓、阿比西尼亞貓等，其中有6個品種檢出隱孢子蟲，各品種感染情況詳見表1，在本次試驗中，金漸層貓的感染率最高為18.18%，且不同品種之間的感染率存在顯著的差異(P<0.05)。由此推斷，寵物貓的品種是影響隱孢子蟲感染的主要因素之一。

2.5 不同地區(qū)寵物貓感染情況

本試驗采樣區(qū)域為蘭州市五大主城區(qū)(城關區(qū)、七里河區(qū)、安寧區(qū)、西固區(qū)、紅谷區(qū))，主城區(qū)中，僅有城關區(qū)與七里河區(qū)檢出陽性樣品，各地區(qū)的感染情況如表2所示，城關區(qū)與區(qū)七里河區(qū)的感染率分別為7.52%和3.35%，經(jīng)統(tǒng)計可知，不同地區(qū)之間感染率并無顯著差異。

表2 不同地區(qū)、季節(jié)、來源寵物貓隱孢子蟲感染情況

2.6 不同季節(jié)寵物貓感染情況

試驗樣品采集耗時1.5年，根據(jù)采樣季節(jié)對樣品進行劃分，各季節(jié)寵物貓隱孢子蟲感染情況如表2所示，各季節(jié)采集的樣品均有檢出隱孢子蟲，夏季共采集樣品235個，占樣本總數(shù)的36%，感染率為7.66%，感染率顯著高于其他3個季節(jié)，不同季節(jié)感染率之間也存在顯著的差異(P<0.05)。因此季節(jié)因素也是影響寵物貓感染隱孢子蟲的主要因素之一。

2.7 不同來源寵物貓感染情況

樣品分別來自寵物市場、繁育貓舍及寵物醫(yī)院，不同來源地的感染情況詳見表2。寵物市場的感染率(7.96%)遠高于繁育貓舍(4.56%)及寵物醫(yī)院(1.93%)。經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)，采樣場所之間感染率的差異也較為顯著(P<0.05)。樣品來源地也是影響隱孢子蟲感染的因素之一。

2.8 隱孢子蟲蟲種鑒定及遺傳進化發(fā)育分析

對26份PCR陽性樣品測序鑒定，結果均為貓隱孢子蟲。使用MEGA 11軟件采用最大似然(Maximum Likelihood)法構建遺傳進化樹，結果如圖3所示。測序樣品與已鑒定出的貓隱孢子蟲(基因登記號為KY882321.1)的相似性為99%以上。通過構建進化樹發(fā)現(xiàn)，所有陽性樣品均與中國上海地區(qū)鑒定出的貓隱孢子蟲(基因登記號為MT458670)位于同一分支上，且發(fā)育樹中的Bootstrap值較高，提示兩種分離珠遺傳進化關系較近。本研究中鑒定的貓隱孢子蟲陽性序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得了基因登記號為OP345050～OP345056。

▲為本試驗陽性樣品。圖3 基于SSU rRNA基因位點得到的貓隱孢子蟲進化關系樹

3 討論

3.1 不同來源地感染率差異分析

根據(jù)試驗結果可知，不同來源地的寵物貓感染隱孢子蟲的情況有所不同，這可能與飼養(yǎng)方式和生活環(huán)境有關。分析采樣信息可知，46.9%的樣品來自于繁育貓舍，這些貓舍大多存在于居民住宅區(qū)中，飼養(yǎng)密度大，空間相對局限，且存在共用貓砂盆、食碗、水碗等現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)個體感染，極易引起群體暴發(fā)感染。繁育貓舍寵物貓數(shù)量過多，寵主難免會照顧不周，忽視其健康問題。建議繁育貓舍控制飼養(yǎng)密度，加強環(huán)境的清潔，定期對貓砂盆進行消毒清潔，更換貓砂，及時對食碗、水碗進行清洗消毒。

在本試驗中，來自寵物市場的寵物貓隱孢子蟲的感染率也較高，這些寵物貓與外界環(huán)境接觸較為頻繁，部分寵物貓是從外地引進，對之前的生活飼養(yǎng)史了解甚少，有可能之前已經(jīng)感染了隱孢子蟲，但由于沒有明顯癥狀出現(xiàn)，無法進行判斷。對于寵物醫(yī)院樣本，調(diào)查寵物貓病史可知，有超過30%的寵物貓就診前出現(xiàn)過不同程度的腹瀉，平時散養(yǎng)在家，偶有誤飲生活用水和啃食盆栽的習慣，這也有可能造成隱孢子蟲感染。

3.2 不同季節(jié)感染差異分析

據(jù)統(tǒng)計，夏季隱孢子蟲的感染率偏高，這可能與當?shù)貧夂颦h(huán)境因素有關。蘭州市位于我國西北部，甘肅省的中部，屬于溫帶大陸性氣候，年平均氣溫10.3 ℃，降水主要集中在6至9月，溫暖潮濕的環(huán)境十分適合寄生蟲病的發(fā)生與傳播。很多寵主認為寵物貓平常不出門，沒有必要進行體內(nèi)外驅(qū)蟲，但從本試驗結果可知，寵物貓感染體內(nèi)寄生蟲的現(xiàn)象還是普遍存在的，尤其在夏季多發(fā)，因此做好體內(nèi)外驅(qū)蟲是十分重要的。

3.3 不同年齡段感染差異分析

分析發(fā)現(xiàn)，3～10月齡的寵物貓隱孢子蟲感染率為6.16%(9/146)，顯著高于其他年齡組。此結論與委磊等[20]在蘭州市流浪犬蠕蟲感染情況調(diào)查中的結論一致。對于3月齡的幼貓幼犬，可以進行初次免疫，整個免疫過程長達42～56 d。免疫疫苗屬于弱毒疫苗，注射后，會造成機體抵抗力下降，在此期間極易感染其他疾病。本試驗中感染隱孢子蟲的寵物貓在2月齡至4歲不等，可見隱孢子蟲可以感染不同年齡段的寵物貓，且成貓感染后癥狀不明顯，往往不能及時發(fā)現(xiàn)，故更要引起重視。

3.4 不同動物隱孢子蟲的感染情況

在我國，隱孢子蟲已在多種動物及人類身上檢出，但感染率之間差距較大。國內(nèi)對于飼養(yǎng)經(jīng)濟動物及寵物的隱孢子蟲感染報道較為多見，詳見表3。飼養(yǎng)經(jīng)濟類動物如馬、山羊、豬等可感染不同種類的隱孢子蟲。國內(nèi)現(xiàn)有報道均表明寵物貓僅感染貓隱孢子蟲，且暫未發(fā)現(xiàn)其他種類。值得注意的是，犬貓隱孢子蟲亞型均為人獸共患，需引起高度重視。

表3 中國不同地區(qū)不同動物隱孢子蟲感染情況

3.5 寵物貓隱孢子蟲防治建議

隱孢子蟲作為重要的介水傳播病原微生物，其卵囊在水中可存活數(shù)月，故被美國環(huán)境保護署(EPA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)列為規(guī)定的飲用水必檢病原微生物。寵物貓飲用自來水或誤飲生活廢水也會增加感染隱孢子蟲的風險[9]。張曉等[6]在2014年檢測了我國部分地區(qū)的水源水和末梢水中隱孢子蟲，結果顯示，水源水及末梢水中均有隱孢子蟲的蟲卵存在，因此本試驗中的寵物貓隱孢子蟲極有可能是介水傳播感染。建議條件允許的情況下，勿用未加熱的自來水喂養(yǎng)寵物貓，可以選用涼開水或者純凈水喂養(yǎng)[6]。同時盡量避免喂食生肉，可加工煮熟后飼喂。在家中無人時圈養(yǎng)寵物貓，避免誤食和誤飲。

據(jù)統(tǒng)計，發(fā)展中國家人的隱孢子蟲感染率在4%～20%，鑒于本試驗寵物貓感染率較高，且貓隱孢子蟲屬于可感染人類的5種隱孢子蟲種之一[3]，人貓接觸頻繁，關系密切，人畜共患的風險也隨之升高。目前為止還沒有針對隱孢子蟲的疫苗或者預防性藥物，因此需要引起重視。在實際臨床病例中，醫(yī)生有責任和義務對寵主進行知識普及，通過糞便檢查對隱孢子蟲進行篩查，及時發(fā)現(xiàn)并治療，從而避免人畜共患病的發(fā)生。

4 結論

本研究結果表明，甘肅省蘭州市寵物貓存在感染隱孢子蟲的情況，感染率為3.97%，且感染率與寵物貓品種、樣品來源地、采樣季節(jié)這幾個因素有關。鑒于隱孢子蟲為人畜共患寄生蟲，寵物與寵主接觸頻繁，需引起高度重視。