張永志，郝東敏，藍(lán)勝芝，嵇康，馬海營(yíng)，邵紅霞，秦愛建*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.法國(guó)詩(shī)華動(dòng)物保健公司，浙江 杭州 310020；3.安徽強(qiáng)英鴨業(yè)集團(tuán)，安徽 碭山 200040；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的一種對(duì)雛鴨呈高度致死性的疾病，臨床上以肝臟腫大、出血為主要病變特征，并具有很強(qiáng)的傳染性，2周齡以內(nèi)雛鴨感染時(shí)，死亡率可高達(dá)90%[1-3]。

鴨肝炎病毒(DHV)分為Ⅰ型(DHV-1)、Ⅱ型(DHV-2)和Ⅲ型(DHV-3)3種血清型，根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第九次病毒分類報(bào)告，DHV-1被劃為微RNA病毒科(Picornaviridae)的新屬禽肝炎病毒屬(Avihepatovirus)，重新命名為鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)。之后研究人員通過(guò)中和試驗(yàn)及衣殼蛋白編碼區(qū)序列分析，又將DHAV可分為3個(gè)血清型或基因型，即DHAV-1型(傳統(tǒng)血清Ⅰ型)，DHAV-2型(中國(guó)臺(tái)灣新型)和DHAV-3 (韓國(guó)新型)[4-6]。

DHAV是導(dǎo)致我國(guó)鴨肝炎發(fā)生的主要病原，據(jù)報(bào)道我國(guó)大陸DHAV-1和DHAV-3均有流行，DHAV-2僅在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)存在。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示DHAV-3型的檢出比例正逐年升高，目前已經(jīng)成為優(yōu)勢(shì)流行型，對(duì)很多鴨場(chǎng)健康養(yǎng)殖造成嚴(yán)重威脅[7-11]。雖然近年來(lái)對(duì)DHAV-3的重視程度有了一定的提高，致病機(jī)制方面的研究也取得一定的進(jìn)展，但由于之前DHAV的研究主要集中于DHAV-1，對(duì)DHAV-3的研究較少，特別是對(duì)血清生化指標(biāo)變化方面的研究資料更為匱乏。本研究以DHAV-3感染商品代雛鴨，對(duì)其引起的主要病理變化和血清生化指標(biāo)變化進(jìn)行了觀察和測(cè)定，以期為DHAV-3致病機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康、體重均勻，無(wú)DHAV感染的1日齡商品代強(qiáng)英鴨40只，購(gòu)自安徽強(qiáng)英鴨業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 攻毒毒株

攻毒用DHAV-3強(qiáng)毒SD20株由浙江詩(shī)華諾倍威生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室分離制備保存，毒種效價(jià)為107.5DELD50/0.2 mL。

1.3 試劑與設(shè)備

血清生化指標(biāo)檢測(cè)相關(guān)試劑盒為上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司產(chǎn)品；伊紅、蘇木素為上海藍(lán)季公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀BS2000M由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將40只健康的強(qiáng)英鴨商品代雛鴨，在隔離器中飼養(yǎng)至10日齡，隨機(jī)平均分為2組，每組20只。第1組為攻毒組，每只雛鴨采用滴口方式接種DHAV-3型強(qiáng)毒SD20株1 mL(含106.5DELD50)；第2組為對(duì)照組，每只雛鴨分別接種等量生理鹽水。攻毒后24和48 h，試驗(yàn)組和對(duì)照組各隨機(jī)選取5只雛鴨采集血液樣品(攻毒后攻毒組存活數(shù)不足5只時(shí)全部采血)，分離血清后置-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)攻毒后死亡的雛鴨分別采集肝、脾、腎、腦、胰腺和法氏囊組織，并置于10%福爾馬林溶液固定，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.5 血清生化指標(biāo)

將分離的血清用全自動(dòng)生化分析儀分別進(jìn)行肝功能、腎功能、血糖水平等相關(guān)的15項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定。具體測(cè)定分析項(xiàng)目包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白蛋白/球蛋白(A/G)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、ALT/AST、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、葡萄糖(GLU)。

1.6 組織病理學(xué)觀察

將固定好的組織樣品按常規(guī)方法包埋切片，HE染色后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)病變觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)血清生化指標(biāo)采用 SPSS 26軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHAV-3強(qiáng)毒感染商品肉鴨的發(fā)病情況

攻毒后第 2 天，攻毒組內(nèi)部分雛鴨開始出現(xiàn)縮脖、精神沉郁、拉稀等臨床癥狀，攻毒后36 h開始出現(xiàn)死亡，7 d內(nèi)累計(jì)死亡17只，死亡率為85%。感染后發(fā)病雛鴨死前伴有典型的角弓反張姿勢(shì)，剖檢病變主要為肝臟出現(xiàn)大小和數(shù)量不等的出血點(diǎn)和出血斑，并且部分病死鴨還出現(xiàn)腎臟和脾臟腫脹，如圖1所示；對(duì)照組雛鴨在整個(gè)試驗(yàn)期間均全部健康，采食、飲水、精神狀態(tài)等均正常，說(shuō)明攻毒模型成立。

A1.攻毒死亡雛鴨肝臟嚴(yán)重出血，存在大小和數(shù)量不等的出血點(diǎn)和出血斑；B1.部分攻毒死亡雛鴨腎臟腫脹，出現(xiàn)尿酸鹽沉積；C1.部分攻毒死亡雛鴨脾臟腫脹，呈斑駁狀；D.攻毒組雛鴨死亡前出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，呈角弓反張姿勢(shì)；A2、B2、C2.分別為對(duì)照組雛鴨剖檢的肝臟、腎臟和脾臟，均無(wú)肉眼可見病變。圖1 DHAV-3型強(qiáng)毒攻毒死亡雛鴨的病理變化和臨床癥狀

2.2 DHAV-3強(qiáng)毒感染鴨組織病理觀察

組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，攻毒后死亡雛鴨的肝細(xì)胞變性腫脹、壞死，呈灶狀或彌漫性分布，部分病變肝組織中有大量紅細(xì)胞；脾臟紅髓充血、出血，白髓結(jié)構(gòu)模糊，組織細(xì)胞變性壞死，淋巴細(xì)胞減少；腎小管上皮細(xì)胞腫脹，呈顆粒變性，間質(zhì)充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腦組織膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元變性壞死；胰腺上皮細(xì)胞灶狀變性壞死，并見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；法氏囊濾泡皮、髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞壞死、數(shù)量減少，具體病理變化見圖2。

A1.攻毒死亡雛鴨肝臟充血、出血，肝細(xì)胞變性壞死，壞死呈灶狀或彌漫性分布；B1.攻毒死亡雛鴨脾臟紅髓充血、出血，白髓結(jié)構(gòu)模糊，組織細(xì)胞變性壞死，淋巴細(xì)胞減少；C1.攻毒死亡雛鴨腎小管上皮細(xì)胞變性腫脹、腎間質(zhì)充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D1.攻毒死亡雛鴨腦組織膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元變性壞死；E1.攻毒死亡雛鴨胰腺上皮細(xì)胞灶狀變性壞死，并見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；F1.攻毒死亡雛鴨法氏囊濾泡皮、髓質(zhì)淋巴細(xì)胞壞死，減少。A2、B2、C2、D2、E2、F2分別為對(duì)照組肝臟、脾臟、腎臟、腦、胰腺和法氏囊組織切片，均組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞輪廓清晰，形態(tài)完好。圖2 DHAV-3型強(qiáng)毒攻毒死亡雛鴨的病理組織學(xué)變化(HE，200×)

2.3 DHAV-3強(qiáng)毒感染鴨血清生化指標(biāo)變化

對(duì)DHAV-3強(qiáng)毒SD20攻毒雛鴨后不同時(shí)段的血清生化指標(biāo)采用常規(guī)方法測(cè)定，結(jié)果顯示，滴口攻毒后24 h，攻毒組與對(duì)照組相比，DBIL顯著下降(P<0.05)，GGT顯著升高(P<0.05)，CR顯著升高(P<0.05)，其他所檢測(cè)的血清生化指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。然而，攻毒后48 h結(jié)果顯示，攻毒組ALB、DBIL 2項(xiàng)指標(biāo)顯著升高，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；與對(duì)照組相比，A/G、ALT、AST、GGT、BUN、CR 6項(xiàng)指標(biāo)均極顯著升高(P<0.01)；ALT/AST、GLU 2項(xiàng)指標(biāo)均極顯著下降(P<0.01)；其他所檢測(cè)的血清生化指標(biāo)TP、GLO、TBIL、IBIL和ALP與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。具體檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 DHAV-3型強(qiáng)毒攻毒后雛鴨血清生化指標(biāo)比較

3 討論

DHAV-3對(duì)雛鴨具有很強(qiáng)的致病性，其感染后的發(fā)病進(jìn)程與組織病理?yè)p傷程度和血液生化指標(biāo)變化密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，DHAV-3感染除對(duì)雛鴨肝臟造成嚴(yán)重病變外，對(duì)腎臟、脾臟、腦、胰腺、法氏囊也會(huì)造成廣泛的組織病變和損傷，從而從整體上影響機(jī)體各組織器官的功能。DHAV-3感染鴨的血清生化指標(biāo)中與肝炎相關(guān)的指標(biāo)會(huì)發(fā)生顯著變化。DBIL、GGT、CR是DHAV-3感染的早期敏感性指標(biāo)；ALB、DBIL、A/G、ALT、AST、GGT、BUN、CR、ALT/AST、GLU也會(huì)隨著肝炎的發(fā)展和病理進(jìn)程發(fā)生明顯改變。這些血清生化指標(biāo)的變化與人的肝炎相類似，提示雛鴨甲型肝炎有作為人肝炎疾病研究模型的潛力。

肝臟是機(jī)體含酶最豐富的器官，這些酶在全身物質(zhì)代謝及生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用，并且一些酶具有一定的組織特異性，是肝膽疾病診斷的重要指標(biāo)和依據(jù)[12-13]。攻毒后48 h，ALT升高了約9倍，AST升高了約138倍，說(shuō)明DHAV-3感染導(dǎo)致雛鴨出現(xiàn)了急性重癥肝炎，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，從而使這些酶類釋放進(jìn)入血液，血清中的酶活性出現(xiàn)了升高。DHAV-3感染后ALT、AST的變化趨勢(shì)，與多數(shù)學(xué)者關(guān)于鴨病毒性肝炎的研究結(jié)果一致[14-16]，也與本研究中肝臟組織切片顯示的肝細(xì)胞損傷情況相符，但與陳陽(yáng)等[17]對(duì)金定鴨感染研究中AST的變化規(guī)律存在差異，推測(cè)可能與不同攻毒毒株致病特性或鴨的品種等因素有關(guān)。同時(shí)，也有一些研究也表明，采用注射途徑攻毒時(shí)，雛鴨血清生化指標(biāo)的變化要早于滴口感染途徑[18]。

血清中的肌酐和尿素氮是判斷腎小球損害的重要指標(biāo)。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受到損害，腎小球?yàn)V過(guò)率下降時(shí)，肌酐和尿素氮濃度就會(huì)急劇上升。DHAV-3攻毒后，雛鴨血清中肌酐和尿素氮短期內(nèi)的急劇上升，表明腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，這與剖檢和組織病變鏡檢結(jié)果相一致。

DHAV-3滴口接種后48 h，雛鴨血清TP有所上升，GLO略有下降；但ALB檢測(cè)顯示在接種后48 h時(shí)上升明顯，與對(duì)照組差異極顯著，推測(cè)TP和ALB的上升與病毒感染后急性失水或腎上腺皮質(zhì)功能減退，導(dǎo)致失水后血清單位容積蛋白濃度增高，血液出現(xiàn)濃縮有關(guān)。另外，感染后48 h時(shí)，攻毒組GLO含量降低，說(shuō)明肝臟功能下降。

血糖濃度測(cè)定結(jié)果顯示，攻毒后24 h血液中GLU濃度略有下降，攻毒后48 h時(shí)下降更為明顯，并與同期對(duì)照組相比差異極顯著，表明隨著病程的不斷發(fā)展，肝臟調(diào)節(jié)糖代謝的機(jī)能出現(xiàn)紊亂，這一結(jié)果與其他研究人員有關(guān)DHAV-1型毒株感染后的血糖檢測(cè)結(jié)果相一致[19]。

4 結(jié)論

DHAV-3對(duì)雛鴨致病性較強(qiáng)，感染可引起多種組織病變，并導(dǎo)致多項(xiàng)血清生化指標(biāo)發(fā)生顯著改變，這些變化與鴨病毒性肝炎的發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)。