蘇鈺，陳棟梁，馬慧，2，王霄旸，王春梅，周文，張可煜*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用化學(xué)藥物與制劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201100；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000)

當(dāng)外界各種病原微生物感染機(jī)體時，病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)的生物分子能被體內(nèi)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)識別[1]，啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞活化，誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng)細(xì)胞分子和分泌受體[2]。各種細(xì)胞因子的過量激活將引起細(xì)胞因子風(fēng)暴和嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步損傷機(jī)體。脂多糖(LPS)是最具代表性的革蘭陰性菌產(chǎn)生的PAMPs。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ)及其主要代謝產(chǎn)物替唑尼特(tizoxanide，TIZ)能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)途徑來調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]。由于新型冠狀病毒的大流行，人們在尋找抗新冠病毒藥物時發(fā)現(xiàn)NTZ能夠減輕新型冠狀病毒感染引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴，降低病毒感染對機(jī)體造成的免疫損傷[4-6]。實(shí)驗(yàn)室前期研究也顯示NTZ能有效地在中早期抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)在體內(nèi)外的復(fù)制[7]，但其發(fā)揮抗乙腦病毒的作用機(jī)制尚未明確。

為治療絳蟲感染而面世的NTZ是一種四氫噻唑類化合物，由勒馬克實(shí)驗(yàn)室的Rossignol等[8]首先合成并在拉丁美洲、非洲等國家被廣泛用于治療隱孢子蟲和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲引起的腹瀉。經(jīng)過多年臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn)NTZ具有廣譜抗多種寄生蟲、細(xì)菌和病毒的活性，但是NTZ對不同病原體的作用機(jī)制卻仍不清楚[9-10]。對于不同病原體或PAMPs激活的天然免疫，NTZ是否采取了相同或相似的調(diào)節(jié)應(yīng)對機(jī)制，從而發(fā)揮廣泛的病原體抑制作用需要進(jìn)一步研究和探討[11]。因此，本研究比較了NTZ體外抑制JEV和LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的差異，為NTZ作用機(jī)制研究和臨床的合理科學(xué)使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、乳倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21)均由本實(shí)驗(yàn)室保存，JEV VA毒株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所豬傳染病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警與阻斷技術(shù)團(tuán)隊(duì)饋贈。

1.2 藥品與試劑

NTZ由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)合成，純度大于98%。將藥物溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配制成100 mmol/L的儲備液并使用有機(jī)相濾器(0.22 μm)過濾除菌，-20 ℃分裝避光保存，使用前用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的工作濃度。LPS購自MERCK公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、青霉素與鏈霉素雙抗溶液購自Gbico公司；TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；GoScript Reverse PCR 試劑盒購自Promega試劑公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)購自Yeason公司；細(xì)胞活力檢測(CCK8)試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒、細(xì)胞裂解液(強(qiáng))、蛋白酶抑制劑(PMSF)、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、小鼠白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒均購自碧云天生物公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)、Tris/甘氨酸/SDS電泳緩沖液(10×)、TBS/Tween緩沖液(10×)、Omni-Flash免冰浴快速轉(zhuǎn)膜緩沖液(10×)均購自雅酶生物公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)抗體購自美國CST生物科技公司；非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)抗體購自Gene Tex公司；β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔(鼠)IgG(H+L)購自碧云天生物公司。

本研究所用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 病毒效價(jià)的測定及感染復(fù)數(shù)(MOI)的計(jì)算

將BHK-21細(xì)胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁生長良好時接種病毒，將JEV VA毒株按照10-1～10-10的濃度進(jìn)行倍比稀釋并接種于培養(yǎng)孔，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，100 μL/孔；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后加入2% FBS DMEM培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)并記錄終點(diǎn)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)。

按照公式(MOI=0.7TCID50/感染細(xì)胞數(shù))計(jì)算MOI值。本研究以MOI=10的劑量感染RAW264.7細(xì)胞開展相關(guān)研究。

1.4 細(xì)胞活力的檢測

取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，1×104個/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入1 μg/mL的LPS或MOI=10的JEV以及不同濃度的NTZ處理，每組設(shè)置6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，吸棄原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液與CCK8，置于培養(yǎng)箱中孵育2～4 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm下的吸光度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5 體外炎癥模型的建立

將細(xì)胞以2×106～3×106個/孔接種到六孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，分別用1 μg/mL的LPS和MOI=10的JEV誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥，隨后給予不同濃度(15、25和50 μmol/L)的NTZ處理。將孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，收集細(xì)胞上清液并提取蛋白和細(xì)胞總RNA，-80 ℃保存。

1.6 炎癥因子mRNA表達(dá)水平的檢測

1.6.1 細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取RAW264.7細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后將cDNA置于-20 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃，5 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min，-20 ℃保存。

1.6.2 實(shí)時熒光定量PCR

實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系配制參照Hieff qPCR SYBR Green Mix (Low Rox Plus)試劑盒說明書。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個循環(huán)。

1.7 炎癥因子蛋白水平的檢測

1.7.1 Western blot檢測

收集細(xì)胞，以每孔100 μL的量配制裂解液，PMSF與RIPA比例為1∶100，冰上裂解15 min，用干凈的細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，將細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并標(biāo)記。12 000 r/min，4 ℃離心10 min后收集上清液至新的離心管中，加入5×蛋白上樣緩沖液(1∶4)，之后將混勻的蛋白放入100 ℃的金屬浴中，10 min后取出，并放于-20 ℃保存。樣品采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定其蛋白含量，上樣前調(diào)整至3 mg/mL，上樣量均為10 μL。首先將電壓調(diào)整為80 V，電泳約30 min，待泳道樣品下降至分離膠中；然后將電壓調(diào)至150 V，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤w移至距分離膠底部約1 cm時，停止電泳(約50 min)，取出玻璃板準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)。將蛋白從SDS-PAGE轉(zhuǎn)至活化的PVDF膜上，以250 mA電流轉(zhuǎn)印45 min，結(jié)束后用TBST洗去膜上的轉(zhuǎn)印緩沖液，然后用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h。封閉完成后，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。次日用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min；之后加入二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗滌條件同上。最后將條帶置于ECL發(fā)光顯色液中，瀝去多余發(fā)光液后放入Tanon全自動發(fā)光儀中成像。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.7.2 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平

參照碧云天ELISA試劑盒說明書，檢測RAW264.7細(xì)胞上清液中IL-6的分泌水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 6.0分析處理，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較組間差異。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NTZ最佳作用濃度范圍篩選

LPS與NTZ共同孵育18 h后，細(xì)胞活力變化如圖1a所示，當(dāng)NTZ濃度在50 μmol/L及以下時細(xì)胞活力在80%左右，但是當(dāng)NTZ濃度升至75 μmol/L時，細(xì)胞活力降至68%。對于LPS誘導(dǎo)的炎癥模型，后續(xù)試驗(yàn)將采用50 μmol/L以下的藥物濃度進(jìn)行。JEV感染細(xì)胞2 h，后給予不同濃度NTZ處理，細(xì)胞活力變化如圖1b，當(dāng)NTZ劑量高于25 μmol/L時，細(xì)胞活力只有60%。后續(xù)選擇25 μmol/L以下的藥物濃度進(jìn)行JEV侵染RAW264.7細(xì)胞試驗(yàn)。比較上述結(jié)果可見，相同藥物濃度下，MOI=10劑量的JEV侵染對RAW264.7的毒性大于1 μg/mL的LPS刺激。

***表示NTZ處理組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖1 LPS(a)和JEV(b)誘導(dǎo)并給予NTZ處理后細(xì)胞活力變化的比較

2.2 NTZ抑制JEV的復(fù)制

將RAW264.7細(xì)胞以MOI=10的劑量感染JEV，2 h后給予不同濃度的NTZ處理。18 h后采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot分別檢測細(xì)胞中病毒NS1 mRNA和NS3蛋白表達(dá)變化。如圖2所示，與對照組相比，病毒感染組中NS1 mRNA和NS3蛋白的表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01)，表明JEV感染RAW264.7細(xì)胞成功。NTZ處理JEV感染后的細(xì)胞，各個處理組的病毒mRNA和NS3蛋白的表達(dá)水平顯著低于JEV感染組(P<0.01)，其中10和15 μmol/L處理組的下降幅度又進(jìn)一步低于5 μmol/L處理組(P<0.01)，即病毒mRNA和NS3蛋白的表達(dá)水平與NTZ呈劑量依賴性降低。以上結(jié)果說明NTZ能夠抑制JEV在RAW264.7細(xì)胞中的復(fù)制，即具有抗JEV作用。

a.NTZ抑制JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 mRNA的轉(zhuǎn)錄；b. NTZ抑制JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3在RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)；c. NS3蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。###表示JEV處理組與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)，***表示NTZ處理組與JEV模型組相比具有極顯著差異(P<0.01)，下同。圖2 NTZ抑制JEV在RAW264.7細(xì)胞中的復(fù)制

2.3 NTZ對JEV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響

2.3.1 NTZ對炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

JEV侵染RAW264.7細(xì)胞后的相關(guān)炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平見圖3。JEV侵染RAW264.7細(xì)胞能夠引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子mRNA的表達(dá)量顯著上升(P<0.01)。JEV侵染的RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)NTZ處理后，細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，且當(dāng)NTZ濃度為15 μmol/L時，細(xì)胞中TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平僅為JEV侵染組的20%左右。結(jié)果提示，NTZ可抑制JEV刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄炎癥因子。IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平較低，未檢測到(結(jié)果未顯示)。

圖3 NTZ抑制JEV誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α(a)和IL-1β(b)mRNA的表達(dá)

2.3.2 NTZ對炎癥及JNK蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示(圖4)，與空白對照組相比，JEV刺激后細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)升高，具有顯著差異(P<0.01)。然而，與JEV模型組相比，不同濃度的NTZ處理組中炎癥相關(guān)蛋白iNOS和COX-2的表達(dá)并未下降，表明NTZ對iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)幾乎沒有抑制作用。除此之外，JEV模型組中磷酸化JNK(pJNK)蛋白的表達(dá)與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.01)，給予不同濃度的NTZ處理后并未抑制JNK蛋白的磷酸化。以上結(jié)果表明，JNK信號通路參與JEV誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但NTZ對JEV誘導(dǎo)的JNK通路并無抑制作用。

a.NTZ對JEV誘導(dǎo)的iNOS、COX-2、JNK以及pJNK蛋白的影響；b. iNOS蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；c. COX-2蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；d. pJNK蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖4 NTZ對JEV誘導(dǎo)的炎癥蛋白及JNK蛋白的影響

2.4 NTZ抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

2.4.1 NTZ對炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

NTZ對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的影響如圖5所示。與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)顯著上升(P<0.01)，說明LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型成功。給予不同濃度NTZ處理后，細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)呈劑量依賴性地顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖5 NTZ抑制LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞中IL-6(a)、IL-1β(b)和TNF-α(c)mRNA的表達(dá)

2.4.2 NTZ對炎癥及JNK蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，Western blot結(jié)果顯示，LPS刺激可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)(P<0.01)。給予不同濃度NTZ處理后，iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)被下調(diào)。其中，NTZ對iNOS蛋白的表達(dá)抑制效果最顯著，當(dāng)NTZ濃度為12.5 μmol/L時，iNOS的表達(dá)就已被完全抑制；而對于COX-2的表達(dá)，則與NTZ的濃度有關(guān)。隨著藥物濃度升高，COX-2蛋白的表達(dá)逐漸下降，當(dāng)藥物濃度為50 μmol/L時，COX-2的表達(dá)降至30%左右。以上結(jié)果表明NTZ對LPS誘導(dǎo)的炎癥具有良好的抑制效果。此外，LPS誘導(dǎo)后，MAPKs信號通路中pJNK蛋白與對照組相比顯著上調(diào)(P<0.01)，給予不同濃度NTZ處理后，pJNK蛋白表達(dá)量下降，當(dāng)藥物濃度高于25 μmol/L時，pJNK的表達(dá)已被完全抑制。以上結(jié)果表明NTZ通過抑制JNK信號通路調(diào)控LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

a.NTZ抑制LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2、JNK以及pJNK蛋白的表達(dá)；b. iNOS蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；c. COX-2蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；d. pJNK蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖6 NTZ對LPS誘導(dǎo)的炎癥蛋白及JNK蛋白的影響

2.5 NTZ對JEV和LPS誘導(dǎo)IL-6的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證JEV組中IL-6的水平，以及LPS與JEV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的區(qū)別，采用實(shí)時熒光定量PCR和ELISA檢測了JEV和LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)量變化。如圖7所示，LPS誘導(dǎo)組中IL-6的表達(dá)量與對照組和JEV誘導(dǎo)組相比顯著上升(P<0.01)，而JEV組中IL-6的mRNA表達(dá)與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。ELISA結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)后IL-6的表達(dá)量比對照組顯著上調(diào)(P<0.01)，經(jīng)不同濃度NTZ處理后，IL-6的分泌量逐漸下降；而JEV處理組中IL-6的分泌量與對照組相比上升，但無差異性顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)可激活巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-6的表達(dá)，而JEV并不能激活巨噬細(xì)胞中的IL-6；此外，NTZ處理后能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)后的炎癥因子IL-6(P<0.01)。提示JEV和LPS通過不同的途徑激活巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。

a.LPS和JEV模型組中IL-6 mRNA的表達(dá)變化；b. LPS模型組中NTZ抑制IL-6的分泌；c. JEV模型組中NTZ處理后IL-6的分泌變化。圖7 NTZ對JEV和LPS誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞中IL-6的調(diào)控作用

3 討論

NTZ化學(xué)名為2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2噻唑基)苯甲酰胺，在體內(nèi)迅速被血漿酯酶水解為TIZ[12]，而其主要代謝產(chǎn)物TIZ與NTZ具有一致的生物活性。2002年美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)NTZ用于治療隱孢子蟲和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲引起的腹瀉，并在拉丁美洲和印度等地區(qū)廣泛用于治療腸道寄生蟲感染[8]，在我國被批準(zhǔn)用于犬絳蟲的防治。除抗寄生蟲外，NTZ及TIZ還被發(fā)現(xiàn)對多種細(xì)菌和病毒具有廣泛的活性[13]。新冠病毒肆虐全球以來，體外篩選抗新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的評估認(rèn)為NTZ的EC50達(dá)2.12 μmol/L，具有潛在的抗新型冠狀病毒活性[14]。NTZ對多種病原體的藥理活性成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

NTZ對大腸桿菌等革蘭陰性需氧或微需氧細(xì)菌幾乎沒有抗菌活性[13]。但是研究顯示，LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)卻可以被NTZ所抑制[3，15]。本研究也證實(shí)，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞所導(dǎo)致的IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子可以被NTZ顯著抑制，其機(jī)制可能涉及JNK等信號通路途徑。

JEV是一種重要的人畜共患病毒，我國是該病的高發(fā)區(qū)[16]。主要通過蚊媒傳播，感染后會引起宿主神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，目前尚無特效藥物治療[17]。研究顯示，NTZ能有效地在中早期抑制JEV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制，并提高JEV感染小鼠的存活率[7]。本研究中，JEV相關(guān)基因NS1的轉(zhuǎn)錄和翻譯都受到NTZ顯著的抑制，再次證明NTZ的抗JEV活性；同時研究還發(fā)現(xiàn)，JEV侵染RAW264.7細(xì)胞所刺激的炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)也受到NTZ有效抑制。然而，相較于NTZ對LPS所誘導(dǎo)的各種細(xì)胞炎性因子的全面抑制，NTZ對JEV誘導(dǎo)的炎性因子抑制作用譜仍非常有限。JNK誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB p65蛋白(NF-κB p65)、轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ELK-1)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的因子c-Fos和c-Jun基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)的活化，這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)病毒感染的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，NTZ能顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的JNK磷酸化激活，卻并未能有效阻止JEV激活的JNK信號激活，這可能也與本研究中的病毒感染量偏大有關(guān)。

作為革蘭陰性菌的主要PAMPs，LPS是Toll樣孕體4(TLR4)的配體，在受體識別之后經(jīng)MyD88-TRAF6途徑在胞內(nèi)激活NF-κB、MAPK等信號通路，最終上調(diào)多種炎癥因子mRNA的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[19]。TLR4-NF-κB信號通路是一條經(jīng)典的炎癥反應(yīng)信號通路，廣泛參與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)。而病毒的PAMPs主要指非甲基化寡核苷酸CpGDNA、單鏈RNA等病毒成分，主要被TLR3和TLR9等模式識別受體所識別，但TLR4也可以識別某些病毒的蛋白[20]。已有研究證明，JEV感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞能誘導(dǎo)TLR3和RIG-I受體蛋白表達(dá)量升高，RNA干擾TLR3和RIG-I的表達(dá)能降低細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)量，證明TLR3、RIG-I參與JEV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[21]。本研究中，JEV和LPS都能誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β等炎性因子，但有別于LPS，JEV并未顯著誘導(dǎo)IL-6的增加。IL-6作為經(jīng)典的促炎因子，能夠被LPS刺激后表達(dá)，且涉及多條炎癥相關(guān)的信號通路，在炎癥進(jìn)程中起著重要作用。有文獻(xiàn)表示，NTZ對LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞中IL-6的分泌具有抑制作用[15]。因此本研究重點(diǎn)分析了LPS和JEV誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后，NTZ對IL-6分泌的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，JEV并不能上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中IL-6的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，說明兩種炎癥刺激模式存在關(guān)聯(lián)又各有特點(diǎn)。NTZ對IL-6的抑制作用充分說明其調(diào)節(jié)天然免疫的作用主要依賴于對NF-κB、MAPK等信號通路的調(diào)控作用，這些調(diào)控可能通過各種信號通路之間的串?dāng)_抑制JEV誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β等炎性因子的表達(dá)，也可能是NTZ的藥物靶點(diǎn)位于兩種PAMPs激活模式的通路的交匯點(diǎn)導(dǎo)致的。

總之，NTZ對不同PAMPs誘導(dǎo)的天然免疫都具有調(diào)控作用，鑒于其對病毒抑制的復(fù)雜性，其抗病毒機(jī)理和調(diào)控天然免疫的機(jī)制仍需要繼續(xù)探索，這將為NTZ應(yīng)用于病毒等病原體的感染和相關(guān)炎癥的治療提供有力的支撐。