孫樂凡，趙祎，王卓，張君正，戢爽

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

延邊黃牛是中國五大良種黃牛之一，與秦川牛、南陽牛、魯西牛、晉南牛齊名。延邊黃牛與韓牛有著似的性狀與指標(biāo)，有著良好的耐粗飼和遺傳性能穩(wěn)定的特點(diǎn)，肉質(zhì)鮮嫩、口感細(xì)膩多汁，是我國十分優(yōu)秀的肉牛品種。

血管生成素樣蛋白(angiopoietin-like protein，ANGPTL)是一類與血管生成有關(guān)的基因。ANGPTL與血管生成素結(jié)構(gòu)相似，但不能與血管生成素的酪氨酸激酶受體結(jié)合，表明ANGPTL家族具有不同功能。ANGPTL家族共包含8個(gè)成員，家族成員之一的ANGPTL5只在人類基因當(dāng)中才能夠表達(dá)，而其余ANGPTL基因家族成員是可以在其他物種(如小鼠)中表達(dá)[1]。ANGPTL具有相似結(jié)構(gòu)，但是功能不同，功能差異較大。ANGPTL8是ANGPTL基因家族中的非典型成員，缺乏N端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和C端纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域[2]。ANGPTL在基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上與血管生成素極為相似，區(qū)別在于它并不與血管生成素的經(jīng)典受體TIE1和TEK/TIE2結(jié)合[3-5]。人類的ANGPTL2基因定位在第9條染色體，ANGPTL6基因定位于第19條染色體[6]。ANGPTL2蛋白是一種分泌型糖蛋白，與血管生成素同源，可通過自分泌或旁分泌作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮功能[7]。ANGPTL2基因通過激活ERK1/2信號(hào)通路部分抑制成骨細(xì)胞的分化，作為骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子[8]，這表明ANGPTL2在成骨細(xì)胞的分化中起著不可或缺的作用。ANGPTL2在脂肪細(xì)胞中大量表達(dá)，與脂肪細(xì)胞分化的穩(wěn)定性有關(guān)[2]。ANGPYL6基因被認(rèn)為與葡萄糖分解代謝、胰島素敏感度等有著某些關(guān)聯(lián)[9]。ANGPTL6基因被認(rèn)為是與多種疾病相關(guān)，目前主要的研究是關(guān)于治療肥胖和糖尿病方面[10-11]，與家族性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、脂肪肝等代謝類疾病相關(guān)[12]，還參與人體血糖調(diào)節(jié)[13]。ANGPTL6與代謝和血管生成相關(guān)，推斷ANGPTL6基因?qū)τ诩倚蟮纳L和疾病的預(yù)防有著重要意義。

高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)，是依賴于單核苷酸熔解溫度差的不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的一種基因解析[14]。HRM技術(shù)是一種用于SNP檢測(cè)手段分析的方法，對(duì)于試驗(yàn)進(jìn)行、基因研究、育種選育等方向有實(shí)踐意義[15]。育種的根本目的是為了加強(qiáng)種群的生產(chǎn)性能，故生產(chǎn)性能測(cè)定屬于育種過程中最基礎(chǔ)的工作[16]。本文通過檢測(cè)延邊黃牛相關(guān)基因ANGPTL2、ANGPTL6多態(tài)位點(diǎn)，分析其對(duì)延邊黃牛體尺性狀是否存在影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇延邊黃牛國家核心育種場(chǎng)120頭24月齡，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同的延邊黃牛母牛作為試驗(yàn)研究對(duì)象。分別采取頸靜脈血，按6∶1的比例加入ACD抗凝劑，最終冷凍至-80 ℃?zhèn)溆?。利用測(cè)仗、卷尺以及其他測(cè)量工具統(tǒng)一對(duì)母牛進(jìn)行體重、體斜長、胸寬、腰角寬、髖寬、臀端寬、體高、腰高、臀端高、胸圍、腹圍、管圍等12個(gè)生長性狀指標(biāo)的測(cè)定，測(cè)定方法參考NY/T 2660—2014《肉牛生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒、HRM分析試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqPCR Master Mix購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 基因組DNA提取與檢測(cè)

首先將試驗(yàn)材料(120份延邊黃牛血樣)進(jìn)行解凍，操作時(shí)依照DNA提取試劑盒的說明書嚴(yán)格進(jìn)行。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)試出其純度與濃度。將完整的DNA樣本稀釋至20 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上牛ANGPTL2(登錄號(hào)為：NC_037338.1)與ANGPTL6(登錄號(hào)：NC_037334.1)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件對(duì)該基因的外顯子部分序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)HRM分型引物。引物按表1交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR和HRM檢測(cè)引物

1.5 PCR擴(kuò)增

隨機(jī)抽取30份DNA樣品構(gòu)建DNA混池，PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×TaqPCR Analysis PreMix 25.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA混池模板1 μL，ddH2O 22.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上110 V電泳30 min，取鑒定正確的PCR產(chǎn)物至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 HRM反應(yīng)程序

HRM反應(yīng)體系20 μL：2×HRM Analysis PreMix 10 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，ddH2O 7.8 μL。HRM反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，49.35 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，40 ℃ 60 s后升溫至65 ℃持續(xù)10 s，升溫過程中，溫度每增加1 ℃，采集25次熒光信號(hào)。結(jié)束后用ECO軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

ANGPTL2、ANGPTL6基因與生長性狀關(guān)聯(lián)分析，運(yùn)用SAS軟件(Ver.6.12)，結(jié)合單因素方差分析和鄧肯模型進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)各個(gè)基因型與生長性狀的相關(guān)性，P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用模型：Yijk=u+fysj+gi+eijk，其中Yijk為生長性狀，u為群體均值，gj為基因效應(yīng)，eijk為觀測(cè)值對(duì)應(yīng)的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，與預(yù)期目的條帶大小一致，并且無雜合條帶，滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

M.DL2000 DNA Marker；1～3. ANGPTL2；4～6. ANGPTL6圖1 延邊黃牛ANGPTL6與ANGPTL2基因PCR擴(kuò)增

2.2 測(cè)序驗(yàn)證

測(cè)序結(jié)果顯示，ANGPTL2基因rs207929155位點(diǎn)存在T/C突變，產(chǎn)生C和T 2個(gè)等位基因，構(gòu)成CC、CT和TT 3種基因型(圖2)。ANGPTL6基因rs209550852位點(diǎn)發(fā)生A>G突變，構(gòu)成AA、AG和GG 3種基因型(圖3)。

圖2 ANGPTL2基因rs207929155突變位

圖3 ANGPTL6基因rs209550852突變位

2.3 HRM分型

HRM聯(lián)合測(cè)序確認(rèn)位點(diǎn)位置，基因HRM的分型結(jié)果顯示存在3種熔解曲線，其中相互匯聚成一簇的為相同基因型。ANGPTL2基因分別對(duì)應(yīng)著3種基因型：CC、CT和TT(圖4)，ANGPTL6基因分別對(duì)應(yīng)著3種基因型：AA、AG和GG(圖5)。

圖5 ANGPTL6 HRM分型

2.4 基因多態(tài)性分析

由表2可見，延邊黃牛的ANGPTL2基因存在T/C突變位點(diǎn)，TT(0.533)、T(0.622)分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因。ANGPTL6基因存在A/G突變位點(diǎn)，AG(0.533)、A(0.656)分別為優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)等位基因，卡方檢驗(yàn)(χ2)結(jié)果顯示出該突變位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 各位點(diǎn)基因頻率和等位基因頻率

遺傳變異參數(shù)如表3所示，突變位點(diǎn)的遺傳純合度(Ho)高于雜合度(He)，有效等位基因數(shù)(Ne)較小，說明在群體中等位基因均勻分布，變異程度低，該基因的多態(tài)信息含量(PIC)為中度多態(tài)(0.25

表3 ANGPTL6 和ANGPTL2基因遺傳變異參數(shù)

2.5 基因變異與延邊黃牛生長性狀的相關(guān)性

對(duì)120頭24月齡延邊黃牛的生長性狀以及ANGPTL2、ANGPTL6基因突變位點(diǎn)的不同基因型之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表4、表5。ANGPTL2基因rs207929155位點(diǎn)攜帶CC基因型個(gè)體管圍顯著高于CT基因型(P<0.05)，其余生長性狀影響均不顯著(P>0.05)。ANGPTL6基因rs209550852位點(diǎn)攜帶AG基因型的個(gè)體髖寬顯著高于GG基因型(P<0.05)，攜帶GG基因型個(gè)體臀端寬顯著高于AA基因型(P<0.05)，攜帶AA和AG基因型個(gè)體腰高顯著低于GG基因型(P<0.05)。

表4 ANGPTL2基因突變位點(diǎn)不同基因型與延邊黃牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

表5 ANGPTL6基因突變位點(diǎn)不同基因型與延邊黃牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

ANGPTL2是一種具有刺激炎癥功能的分泌信號(hào)蛋白因子，在脂肪細(xì)胞和韌帶成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，ANGPTL6基因是一種既與血管生成有關(guān)又與代謝、胰島素敏感性密切相關(guān)，是由肝臟來分泌的一種蛋白肽。ANGPTL2在糖尿病、腎病的發(fā)病機(jī)制中高度參與，血清中ANGPTL2水平是糖尿病、腎病的標(biāo)靶基因之一，也有研究表示其與小鼠動(dòng)脈脈瓣發(fā)育相關(guān)[17]。黃牛的ANGPTL6基因存在內(nèi)含子保留(intron retention，IR)的選擇性剪接[18]。研究表明ANGPTL6基因的表達(dá)與動(dòng)物體重的調(diào)控相關(guān)[19]。由此推測(cè)，ANGPTL2與ANGPTL6基因與動(dòng)物的生長發(fā)育之間存在著相關(guān)。

已有試驗(yàn)證明ANGPTL2基因顯著影響2型糖尿病患者血糖控制水平[20]。研究表明在小鼠中，ANGPTL2能夠顯著影響甘油三酯、脂肪酸在血漿中的水平，從而干擾其脂質(zhì)代謝平衡[21]。對(duì)于脂質(zhì)代謝平衡的影響最終會(huì)影響脂肪沉積，進(jìn)而影響動(dòng)物生產(chǎn)。ANGPTL2在梅山豬與肉鴨的胸部皮下脂肪和腹部脂肪組織中高效表達(dá)[22-23]，但在牛上還未見報(bào)道。

有研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL6基因的突變會(huì)影響動(dòng)物生長發(fā)育。李愛民等[6]發(fā)現(xiàn)了在ANGPTL6基因上C2403A位點(diǎn)、T2359C和G3258T多態(tài)性位點(diǎn)與魯西牛的生長性狀存在關(guān)聯(lián)。ANGPTL6基因(bANGPTL6)存在內(nèi)含子保留的選擇性剪接[18]。Legry等[24]探討了ANGPTL6基因的遺傳變異型發(fā)現(xiàn)，rs6511435的G等位基因與較低的血漿葡萄糖水平有關(guān)，SNP位點(diǎn)與生物體代謝之間相關(guān)。Wu等[18]克隆并測(cè)序了bANGPTL6基因同種型，說明其在肉牛育種計(jì)劃中具有必要性。

除ANGPTL2與ANGPTL6以外，其他的家族成員也有基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)分析。李亞星等[25]發(fā)現(xiàn)秦川牛ANGPTL3基因g.-38T>C和g.509A>G位點(diǎn)突變與秦川牛胴體重相關(guān)；而李彥宏等[26]探究家兔ANGPTL4基因第6外顯子內(nèi)的多態(tài)性及其與家兔部分生長性狀的關(guān)聯(lián)性，c.823 G>A，c.867 T>C和c.975 T>C等突變與3個(gè)品種兔生長性狀相關(guān)。ANGPTL具有相似結(jié)構(gòu)但是功能不同，推測(cè)其家族內(nèi)其他成員可能對(duì)延邊黃牛體尺性狀也存在關(guān)聯(lián)性，所有家族成員具有2個(gè)不同功能領(lǐng)域：羧基端纖維樣域和一氨基末端卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域[27]，前者有利于多聚體的形成和介導(dǎo)脂肪代謝[28-29]，后者介導(dǎo)與血管生成有關(guān)的功能[30]。

延邊黃牛本身為延邊地區(qū)役肉兼用牛，后經(jīng)時(shí)代發(fā)展轉(zhuǎn)型為肉用牛，而在這樣的前提背景下延邊黃牛的生長性狀成為了育種選擇的重要依據(jù)。綜上所述，ANGPTL2與ANGPTL6基因與動(dòng)物體生長發(fā)育、疾病、代謝相關(guān)。因此，對(duì)于ANGPTL2與ANGPTL6基因的研究十分必要。我們的研究結(jié)果表明ANGPTL2與ANGPTL6在延邊黃牛群體中存在基因位點(diǎn)與生長性狀的相關(guān)，對(duì)于延邊黃牛育種方向有著參考意義，后續(xù)可配合延邊黃牛體內(nèi)外生理機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

ANGPTL2基因rs207929155位點(diǎn)存在T/C突變，該位點(diǎn)基因型影響個(gè)體管圍。ANGPTL6基因rs209550852位點(diǎn)存在A/G突變，基因型可顯著影響延邊黃牛髖寬、臀端寬和腰高。試驗(yàn)結(jié)果證明，ANGPTL6與ANGPTL2基因多態(tài)位點(diǎn)和延邊黃牛的生長性狀之間存在相關(guān)性，可作為延邊黃牛生長選育的潛在候選基因。