謝欣怡，陳俊赫，王文浩

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

肉品質(zhì)受許多因素的影響，主要有環(huán)境和遺傳兩個(gè)大的方面。肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)，是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)化生長因子，該基因起源于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族[1]。該基因包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其前體由375個(gè)氨基酸組成[2]。它主要存在于肌肉組織中，在肌肉生長中發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)骨骼生長和脂肪沉積及代謝，甚至對(duì)肌腱和韌帶的強(qiáng)硬度有一定影響[3-4]。該基因發(fā)生突變，可能導(dǎo)致肌細(xì)胞的過度生長以及肌纖維的肥大，直接影響畜禽生長性能。有研究表明，家畜由于該基因缺失或突變，可能表現(xiàn)出十分發(fā)達(dá)的“雙肌性狀”[5]。G→A突變錯(cuò)譯是皮埃蒙特牛產(chǎn)生“雙肌”現(xiàn)象的原因之一，由于機(jī)體基因表達(dá)的變化，不能合成正常的MSTN蛋白，導(dǎo)致體重增加[6]。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠缺乏MSTN基因，肌肉明顯增加，體重比野生小鼠大1倍。豬敲除MSTN基因后，除了能增加肌肉的質(zhì)量外，隨著年齡的增長，脂肪含量會(huì)明顯降低[8]。研究還發(fā)現(xiàn)比利時(shí)藍(lán)牛因MSTN基因發(fā)生移碼突變，在缺失堿基后的第14個(gè)密碼子開始，停止翻譯[8]。Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中年小鼠缺失MSTN基因后，肌肉增加顯著，脂肪含量呈大幅度下降，這表明通過敲除MSTN基因可以減輕由于衰老引起的病理癥狀。

康樂黃雞原產(chǎn)于江西省宜春市萬載縣康樂鎮(zhèn)，有著1 500多年的養(yǎng)殖歷史，表觀特點(diǎn)是“腳黃、毛黃、皮膚黃”，易于飼養(yǎng)管理，溫順，耐粗飼，鮮嫩肉味[10-11]。目前關(guān)于康樂黃雞MSTN基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)及其遺傳表達(dá)規(guī)律、作用機(jī)制等研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探討康樂黃雞MSTN基因第一外顯子區(qū)域SNP，采用全血基因組提取和分子生物學(xué)的方法，對(duì)康樂黃雞MSTN基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序、分析變異情況，研究其對(duì)康樂黃雞上市體重性狀的遺傳效應(yīng)，篩選出優(yōu)良基因(分子標(biāo)記)，為這一優(yōu)良地方雞種資源的保護(hù)以及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為180日齡生長狀況良好的康樂黃雞母雞，試驗(yàn)樣本量為200，飼養(yǎng)于宜春學(xué)院生態(tài)養(yǎng)殖基地。采用常規(guī)翅下靜脈采血的方法，在無菌環(huán)境下操作，加入檸檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝劑，制成1.5 mL抗凝血液，-20 ℃下保存?zhèn)溆?。同時(shí)稱取180 d上市體重，用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析。

1.2 主要試劑

引物，抗凝劑ACD，耐熱DNA聚合酶(Taq酶)，10 mmol/L的Tris-HCl Buffer，dNTPs，瓊脂糖，DNA裂解液，75%乙醇，冰醋酸，氯仿-異戊醇(24∶1)，氨基丁三醇(Tris)，HCl，氨基丁三醇-乙二胺四乙酸(TE)溶液，3 mol/L 醋酸鈉(pH=5.2)，異丙醇，TAE溶液，甘油上樣緩沖液，核染料，0.1%巰基乙醇，0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)等試劑，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 康樂黃雞血液采集及基因組DNA提取

對(duì)受試雞進(jìn)行DNA采集，采集雞翅靜脈血1 mL，并用ACD抗凝劑處理，存放于-20 ℃冰箱備用。采用天根生化科技(北京)有限公司血液基因組DNA提取試劑盒對(duì)試驗(yàn)雞血液基因組DNA進(jìn)行抽提，隨后以超微量紫外分光光度計(jì)檢測其濃度及質(zhì)量。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳測定基因組

取DNA溶液5 μL，加入5 μL甘油上樣緩沖液(已加核染)混勻，滴入點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣。在90 V電壓，60 mA左右電流下，電泳50 min，使用Image Lab核酸凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察條帶分布并分析電泳結(jié)果。

1.5 設(shè)計(jì)MSTN基因引物

依據(jù)GenBank中cDNA文庫所提供的雞MSTN基因序列，在Primer 5.0軟件中設(shè)計(jì)上下游引物。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為495 bp。引物序列為，MSTN-1s：5′-TTGCATTTGCAGTCACGGAT-3′；MSTN-1a：5′-ACGAAAGCAGCAGGGTTGTT-3′。

M. DNA Marker DL5000；1、2. 雞基因組DNA；3.MSTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；紅色標(biāo)記為系統(tǒng)自動(dòng)加強(qiáng)。圖1 全血DNA與MSTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

1.6 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系25 μL：18.0 μL ddH2O，2.0 μL dNTPs(10 μmol/L)，2.5 μL含有Mg2+的buffer(10 μmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),模板DNA 1 μL，Taq酶 0.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Image Lab核酸凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果，拍照保存[12]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行群體等位基因頻率分析、基因型頻率分析、哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)等，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 全血基因組電泳分析

Image Lab核酸凝膠成像系統(tǒng)顯示目的條帶明顯清晰，分布集中，無彌散分離、拖尾、出現(xiàn)多重條帶等不良現(xiàn)象(見圖1A)，表明DNA提取成功，全血基因組完整，可用作后續(xù)PCR擴(kuò)增模板。

2.2 擴(kuò)增片段的電泳分析

使用Image Lab核酸凝膠成像系統(tǒng)分析PCR擴(kuò)增MSTN基因的條帶，結(jié)果如圖1B所示。目的條帶清晰明顯，具有較強(qiáng)的特異性，產(chǎn)物片段大小在500 bp左右，符合預(yù)期，可用于后續(xù)分析。

2.3 擴(kuò)增片段測序結(jié)果及比對(duì)分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物送于測序公司(安徽滁州通用生物公司)進(jìn)行純化，并雙端測序，將測序結(jié)果與基因庫中MSTN序列(GenBank登錄號(hào)：NC_052538)進(jìn)行BLAST在線比對(duì)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相似度超過99%，說明 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與目標(biāo)序列相同。使用Chromas軟件分析堿基突變情況，結(jié)果表明第一外顯子中存在1個(gè)SNP位點(diǎn)，該突變位于7號(hào)染色體上252 542 bp處，該位點(diǎn)發(fā)生的突變是C→G突變(圖2)。

2.4 不同基因型對(duì)康樂黃雞體重的遺傳效應(yīng)分析

經(jīng)過測序得到MSTN基因1個(gè)C→G突變，其中C、G等位基因頻率以及其包含的3個(gè)基因型頻率見表1。MSTN基因經(jīng)哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)，該群體χ2為1.03，該群體處于平衡狀態(tài)。將試驗(yàn)的200個(gè)個(gè)體不同基因型上市日齡的康樂黃雞體重進(jìn)行分類，分析不同基因型個(gè)體間體重的差異程度(表2)，結(jié)果表明突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC純合子以及CG雜合子(P<0.05)，CG與CC差異不顯著(P>0.05)。

表1 MSTN基因C→G突變等位基因頻率及基因型頻率

表2 不同基因型與上市日齡康樂黃雞體重性狀的關(guān)聯(lián)分析 g

3 討論

生長特性一般受微效應(yīng)多基因控制，微效多基因不僅受單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的影響，且還受多態(tài)位點(diǎn)之間聚合效應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因與皮下脂肪厚度、肌肉重量、屠宰率等性狀均有顯著關(guān)聯(lián)性[13-16]，而這些性狀正是影響雞上市體重性狀的主要因素。目前關(guān)于MSTN基因SNP位點(diǎn)的研究有許多，包括豬、牛、羊、雞等均有涉及。在雞上研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因突變對(duì)其生產(chǎn)性能的影響主要集中在第一外顯子上：李維等[17]對(duì)赤水烏骨雞 MSTN 基 因的外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在赤水烏骨雞MSTN基因的外顯子1中檢測到1個(gè)SNP位點(diǎn)C324T，得出MSTN基因?qū)Τ嗨疄豕请u pH 值和剪切力具有較大的遺傳效應(yīng)的結(jié)論；龍廣麗等[18]在貴州地方白羽雞種MSTN基因的第一外顯子處篩查到6個(gè)SNPs，其中4個(gè)SNPs位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變，可作為改良貴州地方白羽雞肉質(zhì)品質(zhì)的分子遺傳標(biāo)記進(jìn)一步研究；張賢嫻等[19]研究發(fā)現(xiàn)，大恒肉雞MSTN基因的第一外顯子序列上有5個(gè)SNPs位點(diǎn)，且其中的4個(gè)位點(diǎn)對(duì)肉雞的生長與與肉質(zhì)有重要的影響；張麗等[20]以構(gòu)建DNA混合池，通過分段擴(kuò)增獲得靜寧雞MSTN基因編碼序列，并對(duì)其進(jìn)行SNPs篩查和生物信息學(xué)分析的方法，發(fā)現(xiàn)靜寧雞MSTN基因編碼區(qū)全長1 128 bp，編碼375個(gè)氨基酸，該蛋白為親水性蛋白，編碼區(qū)共篩查到3個(gè)SNPs，均位于第一外顯子(exon1),分別為exon1-c.60G>A、exon1-c.195C>G和exon1-c.234G>A。本試驗(yàn)對(duì)康樂黃雞MSTN進(jìn)行了基因多態(tài)性檢測，篩選到的突變亦位于第一外顯子區(qū)域，與上述文獻(xiàn)吻合，該突變?yōu)镃→G無義突變，通過突變體群里與原始群體的上市日齡體重比較分析發(fā)現(xiàn)突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC型和CG型，推測可能是由于該突變引起了基因組空間構(gòu)像的改變，進(jìn)而影響了基因的表達(dá)，最終影響了上市日齡的體重。該突變作為提高康樂黃雞上市日齡體重的一個(gè)潛在分子標(biāo)記，可以借助目前已在雞上成功運(yùn)用的基因編輯等新技術(shù)來進(jìn)一步研究[21]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)使用PCR擴(kuò)增的方法，測定康樂黃雞MSTN基因的第一外顯子區(qū)域的堿基序列，結(jié)果表明該區(qū)域存在一個(gè)SNP位點(diǎn)。這個(gè)SNP位點(diǎn)突變純合子GG型的上市日齡體重顯著高于CC型和CG型，可以作為康樂黃雞后續(xù)品種改良潛在的候選分子標(biāo)記，值得進(jìn)一步研究。