董飚，王健，，孫國波，，紀榮超，張干生，

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2. 國家級水禽基因庫，江蘇 泰州 225300)

近年來，國家把種源安全提升到關(guān)系國家安全的戰(zhàn)略高度，要求行業(yè)集中力量突破瓶頸，補短板，強化優(yōu)勢，實現(xiàn)種源自主可控。我國鴨養(yǎng)殖量約占全球的74.2%，帶動了羽絨、食品、餐飲等行業(yè)發(fā)展，對我國畜牧業(yè)發(fā)展具有重要的作用?！秶倚笄葸z傳資源品種名錄(2021年版)》中收錄了我國地方鴨品種37個，培育配套系10個。隨著人們生活水平的提升，生活習慣的改變，目前擁有的鴨種源尚不能滿足市場需求。為解決鴨產(chǎn)業(yè)種源制約問題，需要加強開展鴨種質(zhì)資源的收集、鑒定與評價工作，進而根據(jù)市場需求開展種源創(chuàng)制工作。

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid bingding protein，A-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員之一，主要在脂肪細胞中表達[1]。A-FABP是甘油三酯的貯存庫，在甘油三酯的形成以及脂溶解的過程中A-FABP儲存或釋放出大量的脂肪酸，從而參與調(diào)控生成及溶解的生化循環(huán)[2-3]。因此，A-FABP基因常常作為候選基因用于探討其與畜禽動物脂肪沉積相關(guān)的研究。趙旭庭等[4]發(fā)現(xiàn)A-FABP基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)對櫻桃谷鴨腹脂重、腹脂率、皮脂率和腿肌脂肪含量有顯著性影響。張海波等[5]發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子1序列中2個單核苷酸突變與番鴨胸肌率、肌肉pH值以及胸肌肌內(nèi)脂肪含量有顯著相關(guān)性。秦豪榮等[6]也在A-FABP基因內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)了另外1個單核苷酸突變，其可影響番鴨脂肪沉積能力和胸肌肌苷酸含量。楊軍等[7]在荊江麻鴨A-FABP基因內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了3種基因型，AA型和BB型的活重、腿肌率、瘦肉率以及皮脂率存在顯著性差異。董飚等[8]發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子2的A-C突變對番鴨腹脂重和腹脂率均有顯著性影響，同時還與公鴨的體重和部分屠宰性能指標有關(guān)聯(lián)。

鴨A-FABP基因多態(tài)性的研究集中在少數(shù)鴨品種上，而我國擁有豐富的地方鴨品種。鑒于此，本試驗以巢湖鴨、廣西小麻鴨、高郵鴨等9個地方鴨品種為素材，采用PCR-SSCP方法檢測鴨A-FABP基因部分序列多態(tài)性，統(tǒng)計不同品種的基因型和等位基因頻率，分析品種之間的差異和群體遺傳參數(shù)，為我國地方鴨品種保護和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試鴨群及基因組

試驗動物為國家級水禽基因庫(江蘇)內(nèi)保存的巢湖鴨、廣西小麻鴨、高郵鴨、金定鴨、荊江麻鴨、靖西大麻鴨、臨武鴨、山麻鴨和攸縣麻鴨，每個品種隨機挑選60只進行翅靜脈采血2 mL，公母比例為1∶1，血液采用肝素鈉抗凝。血液離心留取紅細胞，根據(jù)血液基因組DNA提取試劑盒的操作步驟完成每個樣品的DNA提取工作，并測定其質(zhì)量和濃度，樣品DNA濃度調(diào)整為50～100 ng/μL，置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank中鴨A-FABP基因序列設計了1對引物，序列為F：5′-TCTTCAGTCCATAGCACCCC-3′，R：5′-AAAAGGAACTCACCACCACC-3′，可擴展A-FABP基因的部分內(nèi)含子2序列和完整的外顯子3序列，擴展長度為171 bp，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 PCR擴增程序

PCR反應體系:10×PCR buffer(含 Mg2+)2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μLrTaq酶0.16 μL，50～100 ng/μL DNA模板1 μL，用滅菌雙蒸水補至25 μL。

PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，溫度降至室溫即完成。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，符合要求后再進行SSCP檢測。

1.4 SSCP分析及DNA測序

5 μL PCR 產(chǎn)物和4 μL加樣緩沖液混勻(主要成分為去離子甲酰胺)，98 ℃加熱變性10 min，然后冰水浴5 min。經(jīng)過前處理的PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠在電壓150 V條件下電泳12～14 h，銀染顯條帶后判別各個樣品的基因型。

根據(jù)PCR-SSCP的結(jié)果，每種基因型隨機選擇代表個體2～3個進行PCR產(chǎn)物純化回收，并送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果用軟件DNAMAN進行分析查找不同基因型間單核苷酸突變情況。運用Excel編輯公式計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)，用卡方檢驗(χ2)各品種群體是否處于哈代溫伯格平衡以及基因型頻率在各品種間差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測

利用引物對每只鴨DNA進行 PCR-SSCP檢測，共檢測到4個等位基因，8種基因型，分別定義為CC、CD、CE、CF、DD、DE、DF、EE型，部分基因型結(jié)果見圖1。

圖1 部分樣品A-FABP基因PCR-SSCP檢測

2.2 多態(tài)性基因片段的克隆和測序

將測序結(jié)果進行比對發(fā)現(xiàn)不同基因型間共出現(xiàn)了6個位點變化，其中DD型序列與GenBank中鴨A-FABP基因(HQ640428.1)序列一致，其他基因型序列與DD型序列相比出現(xiàn)了突變位點，分別為1 692位點的C→A突變，第1 705、1 706位點的缺失，1 708位點的T→C突變，1 787位點的T→C突變，1 814位點的G→A突變(圖2)。1 692、1 705、1 706、1 708 位點處于內(nèi)含子2中，1 787、1 814位點處于第3外顯子中，外顯子中的突變?yōu)橥x突變。

圖2 不同基因型間核苷酸序列比對

2.3 不同基因型(等位基因)頻率在不同品種鴨中的分布

每個個體確定基因型后，對每個品種的基因型頻率和等位基因頻率進行統(tǒng)計。由表1可知，大致分為3類，其中靖西大麻鴨以DD、DE基因型為主，巢湖鴨、高郵鴨和荊江麻鴨以CD、DD基因型為主，廣西小麻鴨、金定鴨、臨武鴨、山麻鴨、攸縣麻鴨以DD基因型為主。9個鴨品種均以D等位基因頻率最高，均在0.5以上；靖西大麻鴨以E等位基因頻率次之，而其他8個鴨品種以C等位基因頻率次之。

表1 不同鴨品種基因型頻率及等位基因頻率結(jié)果

不同基因型在鴨品種間分布χ2檢驗結(jié)果見表2。靖西大麻鴨A-FABP的基因型分布與巢湖鴨、臨武鴨存在顯著差異(P<0.05)，與其他6個鴨品種存在極顯著差異(P<0.01)。其他鴨品種間基因型分布無顯著性差異。

表2 不同鴨品種間基因型分布χ2檢驗

2.4 群體遺傳信息分析和哈代溫伯格平衡檢驗

群體遺傳參數(shù)分析和哈代溫伯格平衡χ2檢驗見表3。廣西小麻鴨、金定鴨、臨武鴨、山麻鴨、攸縣麻鴨 5個世代群體的純合度都超過了0.5以上，表現(xiàn)為較高的純合度；巢湖鴨、高郵鴨、荊江麻鴨和靖西大麻鴨的純合度在0.4～0.5之間。巢湖鴨的多態(tài)信息含量高于0.5，為高度多態(tài)；其他8個鴨品種的多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間，為中度多態(tài)。攸縣麻鴨偏離了哈代溫伯格平衡狀態(tài)，其他8個鴨品種均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)。

表3 不同鴨群體遺傳參數(shù)和哈代溫伯格平衡檢驗

3 討論

SNP標記是目前使用比較多的分子標記之一，在育種中可實現(xiàn)早期選擇，節(jié)省大量的人力和物力，已被廣泛應用于動植物分子標記輔助育種實踐。SNP檢測的方法包括了全基因組測序、DNA芯片、酶切和PCR-SSCP等。本試驗采用PCR-SSCP方法在9個地方鴨品種A-FABP基因部分內(nèi)含子2和外顯子3序列上發(fā)現(xiàn)了6個變化，分別為C1692A、T1708C、T1787C、G1814A點突變和第1 705、1 706位點的缺失，T1787C、G1814A的變化沒有引起氨基酸序列變化。這與團隊之前在番鴨上的研究結(jié)果存在較大差異，番鴨群體內(nèi)含子2中存在1個A-C點突變，與GenBank中的序列(HQ640428.1)相比在內(nèi)含子2上還存在其他2個點突變[8]。這是因為番鴨屬于棲鴨屬，原產(chǎn)于南美洲和中美洲的熱帶地區(qū)，其瘦肉率高，肉質(zhì)鮮香，而本試驗所用的9個鴨品種均為河鴨屬，是我國地方鴨品種，它們在進化上存在較大差異，生活習性、生長速度和生產(chǎn)性能也存在較大差別[9-10]。

9個鴨品種均以D等位基因頻率最高，E為靖西大麻鴨的第二高頻率等位基因，而其他8個鴨品種的第二高頻率等位基因為C，這是不同鴨在品種形成過程中受到了自然和人為選擇的結(jié)果。χ2檢驗顯示靖西大麻鴨的基因型分布與巢湖鴨、臨武鴨存在顯著性差異，與其他品種存在極顯著差異，其他鴨品種之間基因型分布無顯著性差異。董飚等[11]在A-FABP基因內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)了多個突變位點，對同樣的群體進行了分析發(fā)現(xiàn)，靖西大麻鴨的基因型分布與其他鴨群體之間的差異情況與本試驗的研究結(jié)果一致，但是部分其他群體之間也存在顯著性或極顯著性差異。不同鴨品種在A-FABP基因上形成了特有的基因型頻率，這可能與鴨品種的脂肪沉積形成有關(guān)，但是機理尚不明確。在鴨品種保護工作中需要對不同的群體加強保護。本試驗結(jié)果顯示靖西大麻鴨在A-FABP基因多態(tài)性具有其獨特性，具有較高的保護和作為育種材料的價值。

不同的鴨品種在品種形成過程中受到自然選擇、人工長期的選種和選配作用下，逐漸形成了各具特色的群體特征特性。品種在某些基因座上逐漸趨于純合的程度往往與選擇壓力大小有關(guān)，如果選擇壓較小，基因座會表現(xiàn)出更為豐富的多態(tài)性。雜合度和多態(tài)信息含量分析是衡量群體基因多態(tài)性和群體變異程度的方法之一。本試驗中巢湖鴨、高郵鴨、荊江麻鴨和靖西大麻鴨的雜合度在0.5以上，廣西小麻鴨、金定鴨、臨武鴨、山麻鴨、攸縣麻鴨 5個群體的雜合度在0.5以下。巢湖鴨的多態(tài)信息含量高于0.5，為高度多態(tài)；其他8個鴨品種的多態(tài)信息含量在0.25～0.5之間，為中度多態(tài)。雜合度和多態(tài)信息含量的結(jié)果說明這9個鴨品種在A-FABP基因位點具有較高的多態(tài)信息含量，品種內(nèi)遺傳變異大，持有較多的遺傳信息，符合品種保護的要求。在育種中，如果考慮脂肪沉積和肉質(zhì)方面可根據(jù)這些品種的基因型頻率和等位基因頻率分布情況選擇有明顯區(qū)別的群體作為育種材料，可獲得較為廣泛的遺傳基礎(chǔ)。攸縣麻鴨偏離了哈代溫伯格平衡狀態(tài)，可能是該群體保存數(shù)量不足引起了基因漂泊，需要適當提高群體規(guī)模以達到保種要求。這與之前同樣的群體不同位點的研究結(jié)果不同，在A-FABP基因內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)的突變結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)山麻鴨和臨武鴨偏離了哈達溫伯格平衡[11]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，我國9個地方鴨品種在A-FABP基因部分內(nèi)含子2和外顯子3序列中存在6個點突變，2個點突變位于外顯子3中，為同義突變。從等位基因頻率、基因型頻率和χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，靖西大麻鴨和其他8個鴨品種存在顯著差別。群體遺傳參數(shù)結(jié)果表明A-FABP基因在不同鴨品種中具有較豐富的多態(tài)性。