趙 展

(開(kāi)封大學(xué)，河南 開(kāi)封 475004)

煙酰胺(Nicotianamine，NA)是一種非蛋白質(zhì)性氨基酸，最早在煙草中發(fā)現(xiàn)[1]，到目前為止，已被發(fā)現(xiàn)存在于所有高等植物中。NA是一種金屬螯合劑，對(duì)植物體內(nèi)金屬(鐵、鋅、錳、銅)螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用[2]。煙酰胺合成酶(Nicotianamine synthase，NAS)是植物體內(nèi)NA合成過(guò)程中一種重要的酶，參與植物體內(nèi)多種調(diào)控機(jī)制，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用，能夠?qū)?個(gè)s-腺苷蛋氨酸分子轉(zhuǎn)化成NA[3]。大量研究表明，NAS基因的過(guò)表達(dá)不僅能夠增強(qiáng)植物體內(nèi)NA的含量，而且能夠增加鐵、鋅等金屬離子的含量，目前該結(jié)論已在大豆、水稻、玉米等多個(gè)作物中被證實(shí)，如，在CaMV35S啟動(dòng)子的控制下，hvnas1過(guò)表達(dá)會(huì)引起轉(zhuǎn)基因大豆籽粒中NA濃度是未轉(zhuǎn)基因大豆的4倍，而Fe和Zn濃度分別是NT植株的2倍和1.45倍[4]。NAS基因參與植物體內(nèi)多種作用機(jī)制，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)控作用。如，Zhu等[5]在hap5a突變體中發(fā)現(xiàn)AtNAS1基因顯著下調(diào)表達(dá)，但與Fe的狀態(tài)不相關(guān)，進(jìn)一步酵母單雜交和ChIP分析表明，HAP5A直接結(jié)合到NAS1的啟動(dòng)子區(qū)域，且在缺鐵條件下，過(guò)表達(dá)NAS1可以挽救hap5a的褪綠表型。

據(jù)報(bào)道，目前關(guān)于NAS基因家族已經(jīng)在玉米、小麥、花生等多個(gè)物種中進(jìn)行了全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析。Zhou等[2]在玉米的基因組中共鑒定出9個(gè)NAS基因家族成員，并測(cè)定了其在不同器官(包括發(fā)育中的種子)中的表達(dá)模式，根據(jù)ZmNAS基因的進(jìn)化關(guān)系和組織特異性表達(dá)譜，將其分成了2類，并推測(cè)2類ZmNAS基因可能在轉(zhuǎn)錄水平上受到不同鐵攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)態(tài)需求的調(diào)控。Bonneau等[6]在小麥的基因組中鑒定出21個(gè)NAS基因，并對(duì)TaNAS基因在種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、生殖發(fā)育過(guò)程、缺鐵響應(yīng)的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了詳細(xì)研究，研究結(jié)果增加了人們對(duì)禾本科植物NAS基因家族的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)面包小麥鐵營(yíng)養(yǎng)遺傳學(xué)基礎(chǔ)的理解。羅艷芳等[7]在對(duì)花生NAS基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定和生物信息學(xué)分析，共鑒定出6個(gè)AhNAS基因，并通過(guò)對(duì)AhNAS基因家族進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、順式作用元件、表達(dá)模式及花生響應(yīng)缺鐵和鎘脅迫中的作用等進(jìn)行分析，指出AhNAS2.1和AhNAS2.2主要參與黃色條紋樣蛋白3(YSL3)介導(dǎo)的鐵的木質(zhì)部運(yùn)輸，而AhNAS1.2、AhNAS3.1和AhNAS3.2可能參與花生對(duì)鎘的解毒機(jī)制，為揭示NAS在花生(Arachis hypogaea)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

西瓜是世界十大水果之一，隨著西瓜基因組的測(cè)序完成，西瓜的基因組學(xué)研究也越來(lái)越深入，但是目前關(guān)于西瓜NAS基因家族的全基因組鑒定和分析研究尚不深入。本研究以西瓜NAS基因家族為研究對(duì)象，利用HMMER、MEGA、TBtools等工具對(duì)西瓜NAS基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定與生物信息學(xué)分析，其中包括西瓜NAS基因家族的染色體定位、蛋白保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、啟動(dòng)子順式作用元件和共線性等，該研究能夠?yàn)檫M(jìn)一步探討西瓜NAS基因的功能和分子機(jī)制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 西瓜NAS基因家族成員的鑒定與染色體定位

西瓜基因組數(shù)據(jù)集來(lái)源于葫蘆科基因組CuGenDB數(shù)據(jù)庫(kù)(Cucurbit Genomics Database(CuGenDB))。利用InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ebi.ac.uk/interpro/)查找并下載NAS基因的特征結(jié)構(gòu)域文件PF03059。在Linux系統(tǒng)中利用HMMER的hmmbuild功能構(gòu)建NAS蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型，并利用hmmsearch掃描西瓜蛋白數(shù)據(jù)集。獲得的NAS家族成員分別通過(guò)SMART蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(SMART：Main page(embl-heidelberg.de))和NCBI-CDD(Home -Conserved Domains-NCBI(nih.gov))網(wǎng)站進(jìn)行確認(rèn)，在2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均包含NAS家族成員作為候選，并對(duì)候選NAS家族成員進(jìn)行命名。利用DNAMAN軟件對(duì)候選NAS家族成員的蛋白質(zhì)分子量大小、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行分析。對(duì)已獲取的候選NAS家族成員的位置信息利用MG2C_v2.1在線軟件(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)進(jìn)行染色體定位。

1.2 西瓜NAS基因家族編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA網(wǎng)站(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)對(duì)西瓜NAS家族編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.rcsb.org/)中的PSI-BLAST篩選模板，利用SWISS MODLE網(wǎng)站(https：//swissmodel.expasy.org/)，以PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選的模板對(duì)西瓜NAS家族編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3 西瓜NAS基因家族編碼蛋白保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)西瓜NAS家族蛋白的保守基序利用MEME 5.5.0在線工具(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)進(jìn)行分析，最大檢索保守基序數(shù)量設(shè)為10，其他參數(shù)默認(rèn)。利用MEGA7.0對(duì)候選NAS家族成員間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，并采用TBtools對(duì)候選NAS家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。

1.4 西瓜NAS基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//plants.ensembl. org/Arabidopsis_thaliana/Info/Index)分別下載擬南芥、水稻、番茄和甜瓜4個(gè)物種的NAS基因的蛋白序列，利用MEGA 7.0內(nèi)置的ClustalW，采用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)，對(duì)已獲得的擬南芥、水稻、番茄、甜瓜、西瓜的NAS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將自展法系數(shù)(Booststrap)設(shè)置為1000次重復(fù)，其他參數(shù)采用默認(rèn)值，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，并利用ITOL軟件(https：//itol.embl.de/)進(jìn)行展示。

1.5 西瓜NAS家族的順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取西瓜候選NAS家族成員基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的序列。利用PlantCARE對(duì)已獲得的西瓜NAS家族成員基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并通過(guò)TBtools對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 西瓜NAS家族的共線性分析

利用TBtools軟件對(duì)西瓜基因組內(nèi)的ClaNAS基因進(jìn)行物種內(nèi)的共線性分析以及西瓜與擬南芥、番茄基因組間的NAS基因進(jìn)行共線性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜NAS基因家族成員的鑒定與染色體定位

通過(guò)InterPro工具搜索，HMMER構(gòu)建和查找，SMART和NCBI-CDD確認(rèn)，共鑒定出4個(gè)西瓜NAS家族成員，分別命名為ClaNAS1～ClaNAS4，見(jiàn)表1。利用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)西瓜NAS家族成員編碼氨基酸序列長(zhǎng)度從277aa到356aa，平均長(zhǎng)度311aa；分子量變化范圍從30.68kDa到39.88kDa，平均34.55kDa；理論等電點(diǎn)PI從4.71到7.46，其中ClaNAS1的等電點(diǎn)最小為4.71，該結(jié)果說(shuō)明西瓜NAS家族成員編碼的蛋白質(zhì)含有較多酸性氨基酸。染色體定位結(jié)果顯示，ClaNAS家族成員主要分布于第2號(hào)染色體、3號(hào)染色體、6號(hào)染色體上，其中2號(hào)染色體上有2個(gè)ClaNAS基因家族成員，分別是ClaNAS1和ClaNAS3，且2個(gè)基因在染色體上的位置很近；3號(hào)染色體和6號(hào)染色體上的西瓜ClaNAS家族成員分別是ClaNAS2和ClaNAS4。

表1 西瓜NAS基因家族成員信息

表2 西瓜NAS基因家族編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)

2.2 西瓜ClaNAS基因家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

為了了解西瓜ClaNAS基因家族編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SOPMA進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，4個(gè)西瓜ClaNASs家族成員編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲組成，均不含有β-折疊；ClaNAS1～ClaNAS4 4個(gè)成員中，與其他二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，α-螺旋的數(shù)量均最多，β-轉(zhuǎn)角數(shù)量均最少；與ClaNAS1、ClaNAS3和ClaNAS4相比，ClaNAS2的延伸鏈數(shù)量最多為55；對(duì)于無(wú)規(guī)則卷曲，ClaNAS1和ClaNAS2的數(shù)量分別為112和119，而ClaNAS3和ClaNAS4的數(shù)量分別為72和86。

圖1 西瓜NAS基因家族成員在染色體上的分布

為了進(jìn)一步了解西瓜ClaNAS基因家族編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用SWISS-MODEL，以PDB中3fpf.1.A為模板，進(jìn)行分析預(yù)測(cè)并構(gòu)建模型。結(jié)果表明，ClaNAS1和ClaNAS3編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度較高，具有較復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)；而ClaNAS2、ClaNAS4與ClaNAS1和ClaNAS3編碼的蛋白質(zhì)整體相似度差異較大，可能與ClaNAS2和ClaNAS4 2個(gè)成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有的延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)量差異較大有關(guān)。

2.3 西瓜ClaNAS基因家族蛋白保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析

為了探究西瓜ClaNAS家族的進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守基序與基因結(jié)構(gòu)，分別利用MEGA7.0、MEME、TBtools進(jìn)行分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，西瓜4個(gè)ClaNAS家族成員主要分為I、II、III 3個(gè)亞家族，其中ClaNAS1和ClaNAS3為I類，成員ClaNAS2屬于II類，ClaNAS4屬于III類；蛋白保守基序結(jié)果顯示，4個(gè)ClaNAS家族成員中ClaNAS1和ClaNAS2均含有從Motif1到Motif10共10個(gè)Motif，而ClaNAS3和ClaNAS4均含有7個(gè)Motif，從Motif1到Motif7；基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，4個(gè)ClaNAS家族成員的外顯子數(shù)均只有1和2，其中ClaNAS1和ClaNAS2均含有2個(gè)外顯子，且具有相同的外顯子-內(nèi)含子排列方式，而ClaNAS3和ClaNAS4的外顯子數(shù)均為1，說(shuō)明ClaNASs家族成員的基因結(jié)構(gòu)整體比較簡(jiǎn)單。

圖2 西瓜NAS基因家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 西瓜ClaNASs家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為了理解ClaNASs的功能和進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA7.0及其內(nèi)置的ClustalW對(duì)5個(gè)擬南芥AtNASs，3個(gè)水稻OsNASs，4個(gè)甜瓜SlNASs，1個(gè)番茄SlNASs和4個(gè)西瓜ClaNASs的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，見(jiàn)圖3，并構(gòu)建擬南芥、水稻、甜瓜、番茄和西瓜5個(gè)物種中NAS基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，5個(gè)物種的NAS基因家族可分成3個(gè)亞家族，分別為I、II和III，其中I和II亞族均不含西瓜ClaNASs成員，而在III亞族中均是葫蘆科植物，能夠找到4個(gè)西瓜ClaNASs成員，分別是ClaNAS1～ClaNAS4，說(shuō)明葫蘆科植物與其他植物的差異較大。

圖3 西瓜NAS基因家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 西瓜ClaNASs家族啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了探究西瓜ClaNASs家族啟動(dòng)子中可能的順式作用元件及其作用，利用TBtools軟件獲取西瓜ClaNASs家族轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的序列，并進(jìn)行順式作用元件分析，見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，西瓜ClaNASs啟動(dòng)子區(qū)含有激素應(yīng)答、光響應(yīng)、脅迫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等多種順式作用元件，其中ClaNAS1～ClaNAS4中均含有光響應(yīng)和脫落酸應(yīng)答相關(guān)的響應(yīng)元件；除了ClaNAS4，ClaNAS1～ClaNAS3還均含有水楊酸應(yīng)答元件；ClaNAS1和ClaNAS3的啟動(dòng)子區(qū)均含有赤霉素應(yīng)答元件，而ClaNAS2和ClaNAS4中均含有生長(zhǎng)素應(yīng)答元件；對(duì)于低溫脅迫應(yīng)答元件，僅在ClaNAS1和ClaNAS4中含有；此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)序列均集中在ClaNAS1、ClaNAS3和ClaNAS4中，說(shuō)明西瓜ClaNASs基因家族可能對(duì)激素、脅迫等多種信號(hào)有響應(yīng)。

圖4 西瓜NAS基因家族編碼蛋白的保守基序和基因結(jié)構(gòu)析

圖5 西瓜、擬南芥、水稻和番茄的NAS基因家族進(jìn)化樹(shù)分析

圖6 西瓜NAS基因家族啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

2.6 西瓜ClaNASs家族共線性分析

利用TBtools對(duì)西瓜基因組內(nèi)以及西瓜與擬南芥、番茄基因組間的NAS基因進(jìn)行共線性分析，見(jiàn)圖7、圖8，結(jié)果表明，在西瓜基因組內(nèi)NAS基因沒(méi)有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制，見(jiàn)圖7；在西瓜與擬南芥基因組間共鑒定出2個(gè)ClaNAS基因與擬南芥存在共線性關(guān)系，分別是ClaNAS1與AT1G09240.1、ClaNAS1與AT1G56430.1、ClaNAS2與AT1G09240.1、ClaNAS2與AT1G56430.1；在西瓜與番茄基因組間同樣鑒定出2個(gè)ClaNAS基因與番茄存在共線性關(guān)系，分別是ClaNAS1與Solyc01g100490.3.1、ClaNAS2與Solyc01g100490.3.1。

圖7 西瓜NAS基因家族成員的共線性分析

圖8 NAS基因在西瓜、擬南芥、番茄基因組間的共線性分析

3 討論與結(jié)論

NAS是麥根酸(mugineic acid，MA)類家族生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化三分子的S-腺苷甲硫氨酸形成一分子的NA，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)在水稻、玉米、小麥、花生等多個(gè)物種中進(jìn)行了NAS基因的鑒定和分析，并發(fā)現(xiàn)不同物種中NAS基因的數(shù)量與表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)度和功能均存在顯著差異[2，6]，而NAS基因在西瓜中的研究及其功能尚不清楚。

本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)西瓜NAS基因家族進(jìn)行了全基因組的鑒定和分析，共鑒定出4個(gè)NAS基因家族成員，與水稻、玉米、小麥和花生相比，基因數(shù)量差異較大，其中水稻基因組中共鑒定出3個(gè)OsNAS基因[9]，玉米全基因組中鑒定出9個(gè)ZmNAS基因[2，10]，花生全基因組中鑒定出6個(gè)AhNAS基因[7]，在面包小麥中共鑒定出21個(gè)TaNAS基因[6]。編碼氨基酸的理化性質(zhì)與其他物種差異也較大，本研究中西瓜NAS基因家族成員編碼的氨基酸數(shù)量277～356aa，分子量30.68～39.88kDa，等電點(diǎn)4.71～7.46；而花生中AhNAS基因編碼的氨基酸數(shù)量284～320aa，分子量32.03～35.65kDa，等電點(diǎn)5.37～6.37[7]。西瓜ClaNAS家族蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲，而不含β-折疊，該結(jié)果與水稻SBP家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成一致[11]；對(duì)西瓜ClaNAS家族蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建時(shí)，最優(yōu)模板是3fpf.1，該結(jié)果與花生AhNAS蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建時(shí)獲得的最佳模板一致[7]。對(duì)西瓜4個(gè)NAS基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析顯示，ClaNAS1和ClaNAS2均含有2個(gè)外顯子，且具有相同的外顯子-內(nèi)含子排列方式，而ClaNAS3和ClaNAS4的外顯子數(shù)均為1，該結(jié)果與花生中AhNAS1.1和AhNAS1.2的編碼區(qū)含有2個(gè)外顯子，AhNAS2.1、AhNAS2.2、AhNAS3.1和AhNAS3.2只有1個(gè)外顯子的結(jié)果一致[7]。對(duì)擬南芥、水稻、番茄、西瓜、甜瓜5個(gè)物種共14個(gè)NAS蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，禾本科、葫蘆科植物與其他植物均單獨(dú)聚為一類，其中在禾本科與其他非禾本科單獨(dú)聚為一類方面與羅艷芳等[7]、Zhou等[2]的研究結(jié)果一致。

西瓜NAS基因家族啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件主要含有激素應(yīng)答、光響應(yīng)、脅迫應(yīng)答等；其中，激素應(yīng)答順式作用元件主要包括脫落酸、赤霉素、水楊酸、生長(zhǎng)素等；脅迫應(yīng)答主要是低溫脅迫應(yīng)答，而花生的NAS基因家族啟動(dòng)子區(qū)還包含茉莉酸甲酯激素應(yīng)答，脅迫應(yīng)答還包括干旱脅迫應(yīng)答[7]。本研究中，在西瓜基因組內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NAS基因的串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制，類似結(jié)果同樣在其他物種中也存在，如紅花基因組內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)SPL基因的串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制[12]，但在花生基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)A組的AhNAS1.1、AhNAS2.1和AhNAS3.1分別與B基因組AhNAS1.2、AhNAS2.2和AhNAS3.2存在片段復(fù)制。西瓜NAS基因與擬南芥、番茄的NAS基因間分別存在2個(gè)共線性基因?qū)?，ClaNAS1與ClaNAS2分別連鎖了2個(gè)基因?qū)Γ砻鰿laNAS1與ClaNAS2可能是保守的，在進(jìn)化中發(fā)揮著重要的作用。