邵彪，許晶晶，高利亭，王琳琳，徐陳紅，陳剛

1.南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所（南通 226011）；2.南通市食品危害因子分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南通 226011）

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是一類毒性很強(qiáng)的海洋生物毒素，廣泛存在貝類產(chǎn)品中，能通過(guò)影響鈉離子通道而抑制神經(jīng)的傳導(dǎo)，造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙，產(chǎn)生麻痹作用[1-2]。PSP化學(xué)結(jié)構(gòu)上是四氫嘌呤的三環(huán)化合物，基本結(jié)構(gòu)為含有2個(gè)胍基的多疊六元環(huán)，如圖1所示，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)50多種，毒素結(jié)構(gòu)的差異主要是R1～R44個(gè)位點(diǎn)取代基的不同，根據(jù)基團(tuán)的相似性，主要分為氨基甲酸酯類毒素、N-磺酰氨甲酰基類毒素、脫氨甲酰基類毒素、脫氧脫氨甲?；惗舅豙3-6]。其中石房哈毒素（STX）作為該類毒素中最主要的代表，備受關(guān)注。PSP極性強(qiáng)，易溶于水，熱穩(wěn)定性好，對(duì)酸穩(wěn)定但在堿性條件下易分解。

圖1 PSP化學(xué)結(jié)構(gòu)式

作為神經(jīng)毒素，PSP毒性強(qiáng)烈，嚴(yán)重情況下可造成死亡，且具有高發(fā)性，因此，對(duì)貝類等動(dòng)物性水產(chǎn)品中PSP監(jiān)測(cè)非常重要。目前，常用的檢測(cè)方法有小鼠生物測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-11]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因在靈敏度、穩(wěn)定性及定性確證上的優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)代分析選擇的趨勢(shì)。然而，由于動(dòng)物生物體基質(zhì)復(fù)雜，干擾因素多，導(dǎo)致分析檢測(cè)過(guò)程常帶來(lái)難以確定的結(jié)果，甚至假陰性或假陽(yáng)性的出現(xiàn)，同時(shí)還會(huì)對(duì)高靈敏的分析儀器造成污染。因而，樣品中目標(biāo)物的有效提取及凈化富集至關(guān)重要。根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，PSP凈化前處理主要有HLB固相萃取、C18固相萃取、石墨化碳黑固相萃取柱[12-15]，其中HLB固相萃取柱采用親水親脂平衡填料，除了能吸附親水化合物外，對(duì)脂溶性物質(zhì)也能吸附，C18固相萃取柱是以十八烷基硅膠為填料，能通過(guò)疏水作用保留非極性化合物而對(duì)PSP本身無(wú)保留。

硅膠是一種非晶態(tài)二氧化硅，其化學(xué)式可表述為mSiO2·nH2O，分子中具有硅氧烷交聯(lián)的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面分布具有吸附力的硅羥基活性基團(tuán)，是最常見(jiàn)的固體吸附劑[16]。硅膠種類很多，根據(jù)其孔徑的大小分為大孔硅膠、粗孔硅膠、B型硅膠、細(xì)孔硅膠，因孔隙結(jié)構(gòu)的不同，它們的吸附性能各有特點(diǎn)。由于化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性能高、熱穩(wěn)定性好且具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，硅膠及其修飾改性材料在生產(chǎn)、科研領(lǐng)域具有廣泛用途[17-20]。為給PSP檢測(cè)前處理方式提供更多選擇，以標(biāo)稱的硅膠為對(duì)象，分析其作為PSP前處理材料的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硅膠（孔徑12 nm、直徑50 μm，美國(guó)Sepax Technologies公司）；石房蛤毒素（saxitoxins，STX）、新石房蛤毒素（neosaxitoxins，neoSTX）、脫氨甲?；扛蚨舅兀╠ecarbamoylsaxitoxin，dc STX）、脫氨甲酰基新石房蛤毒素（decarbamoylneosaxitoxin，dcNEO）：標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大NRC；甲酸銨（色譜純，德國(guó)CNW公司）；甲酸（≥96.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；水相針式濾器（0.22 μm，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（Gemini SEM 300，德國(guó)蔡司公司）；紅外光譜儀（Spectrum Two，美國(guó)PE公司）；差示掃描量熱儀（DSC 8000，美國(guó)PE公司）；熱重分析儀（TGA 8000，美國(guó)PE公司）；超高效液相色譜（LC，30AD，日本島津公司）；質(zhì)譜聯(lián)用儀（MS，Sciex Triple Quad 5500+，美國(guó)AB公司）；電子分析天平（感量0.000 01 g，SQP，德國(guó)賽多利斯公司）；電子分析天平（感量0.000 1 g，BSA224S，德國(guó)賽多利斯公司）；高速冷凍離心機(jī)（3K15臺(tái)式，德國(guó)Sigma公司）；超純水機(jī)（Milli-Q，德國(guó)默克公司）；TSKgel Amide-80色譜柱（63 μm，2.0 mm×150 mm，日本TOSOH公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形貌特征觀測(cè)

利用掃描電子顯微鏡直接觀測(cè)硅膠的形貌特征及尺寸大小。

1.3.2 紅外光譜分析

采用紅外光譜儀衰減全反射（ATR）模式直接對(duì)硅膠進(jìn)行掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.3 熱學(xué)性能分析

分別使用差示掃描量熱儀、熱重分析儀分析硅膠的熱穩(wěn)定性。差示掃描量熱儀程序：起始溫度30 ℃，保持1 min；30～500 ℃，升溫速率20 ℃/min；氮?dú)?0.0 mL/min。熱重分析儀程序：起始溫度30 ℃，保持1 min；30～500 ℃，升溫速率20 ℃/min；氮?dú)?0.0 mL/min。

1.3.4 吸附性能研究

1.3.4.1 液相色譜條件

TSKgel Amide-80色譜柱（3 μm，2.0 mm×150 mm），流動(dòng)相A為5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.5%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.5%甲酸），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。采用梯度洗脫進(jìn)行樣品分析，具體洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.4.2 質(zhì)譜參數(shù)

采用電噴霧（ESI）離子源，正電離模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)掃描定量分析目標(biāo)化合物。氣簾氣壓力30 psi，霧化氣壓力55 psi，輔助加熱氣壓力60 psi，源溫度600 ℃，離子化電壓5 500 V，碰撞氣medium，碰撞能量（collision energy，CE）、去簇電壓（declustering potential，DP）經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 硅膠吸附與解吸附試驗(yàn)

稱取200 mg硅膠，加入2 mL去離子水，渦旋混勻30 s，室溫靜置30 min，按10 000 r/min離心3 min，棄去上清液。沉淀加入麻痹性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋30 s混勻，按10 000 r/min離心3 min，獲得硅膠吸附后上清液，用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析麻痹性貝類毒素殘留情況。

沉淀部分加入去離子水，渦旋混勻30 s，按10 000 r/min離心3 min，棄去上清液。加入0.1%乙酸水溶液，混勻后按10 000 r/min離心3 min，上清液即為硅膠吸附后解吸附液，用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析麻痹性貝類毒素殘留情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠形貌特征觀測(cè)結(jié)果

根據(jù)所選用硅膠說(shuō)明書(shū)，直徑為50 μm，利用掃描電子顯微鏡在不同放大倍數(shù)視野觀察硅膠表面形貌特征，結(jié)果如圖2所示。

圖2 硅膠掃描電子顯微鏡圖

由圖2（A）可以看出，在100倍放大倍數(shù)下觀測(cè)到所用硅膠呈球形，直徑介于30～60 μm，尺寸相對(duì)均一，但與標(biāo)稱尺寸略有差異。由圖2（B）可以看出，在500倍放大倍數(shù)下觀測(cè)到硅膠表面不光滑。

2.2 硅膠紅外光譜掃描結(jié)果

采用紅外光譜儀衰減全反射（ATR）模式直接對(duì)硅膠進(jìn)行掃描，紅外吸收光譜如圖3所示。

圖3 硅膠紅外光譜圖

在圖3中，1 063 cm-1處強(qiáng)吸收峰為二硅氧烷（Si—O—Si）反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，968 cm-1處的峰為硅羥基，在800 cm-1左右的吸收峰是Si—O—Si鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，在456 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是Si—O鍵的彎曲振動(dòng)所致，其中，硅羥基被認(rèn)為是硅膠吸附的活性基團(tuán)。

2.3 硅膠熱穩(wěn)定性分析結(jié)果

使用差示掃描量熱儀、熱重分析儀分析硅膠的熱穩(wěn)定性，分別獲得DSC曲線圖與TG曲線圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 硅膠DSC曲線圖與TG曲線圖

由圖4（A）可以看出，DSC曲線在100 ℃前出現(xiàn)吸熱峰。圖4（B）中，TG曲線在100 ℃前出現(xiàn)失重，這是由于硅膠表面因氫鍵所吸附的水分蒸發(fā)所致。150 ℃開(kāi)始DSC曲線緩慢上升而TG曲線緩慢下降，即出現(xiàn)緩慢吸熱及失重，推測(cè)是硅膠硅醇基脫水縮合轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，逐漸失去少量結(jié)合水。

2.4 硅膠對(duì)麻痹性貝類毒素吸附性能

2.4.1 4種麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-MS/MS分析結(jié)果

以STX、neoSTX、dc STX、dcNEO這4種麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液為目標(biāo)，按照1.3.1和1.3.2所優(yōu)化的液相色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)分析4種麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如圖5所示。

圖5 4種麻痹性貝類毒素總離子流圖及提取離子流圖

在給定色譜條件下，4種麻痹性貝類毒素總離子流圖重疊，這是由于它們?yōu)橥谎苌铮Y(jié)構(gòu)差異細(xì)微，性質(zhì)相似，故色譜保留時(shí)間基本一致，在5.1 min出峰，但由于以質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行分析，4種毒素所監(jiān)測(cè)的離子對(duì)各不相同，所以不影響對(duì)4種組分的分析結(jié)果。

2.4.2 硅膠對(duì)麻痹性貝類毒素的吸附與解吸附

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析硅膠吸附后麻痹性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液中毒素殘留情況及經(jīng)0.1%乙酸水溶液處理后解吸附液中毒素情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 硅膠對(duì)麻痹性貝類毒素吸附與解吸附

由圖6（A）可以看出，麻痹性貝類毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)過(guò)硅膠處理后，檢測(cè)不到所含4種毒素成分，表明毒素均被硅膠吸附。由圖6（B）可以看出，經(jīng)0.1%乙酸水溶液處理后，解吸附液中4種麻痹性貝類毒素均檢出，被硅膠吸附的均釋放出來(lái)，其含量與混合標(biāo)準(zhǔn)液含量的差異不大，屬于試驗(yàn)處理過(guò)程合理誤差。

由于麻痹性貝類毒素對(duì)酸穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定易分解，進(jìn)一步考察不同pH條件下硅膠吸附性能，結(jié)果表明吸附條件應(yīng)控制在pH 6～7范圍，才能確保硅膠吸附效果。

3 結(jié)論與討論

隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等高靈敏儀器在食品安全檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，樣品凈化前處理成為分析過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對(duì)于動(dòng)物性水產(chǎn)品中麻痹性貝類毒素檢測(cè)，蛋白質(zhì)、脂類等生物基質(zhì)效應(yīng)明顯，復(fù)雜的成分不僅干擾結(jié)果分析，還造成儀器污染。為尋找合適的前處理材料，研究了硅膠顯微形貌、基團(tuán)結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性以及吸附性能。分析表明：所選用硅膠直徑大小基本分布30～60 μm，尺寸大小適合常壓下用于固相填充介質(zhì)；表面結(jié)構(gòu)中富含硅羥基團(tuán)，為吸附提供了活性位點(diǎn)；良好的熱穩(wěn)定性，確保使用過(guò)程不受制于環(huán)境條件；在弱酸或中性條件下對(duì)麻痹性貝類毒素的有效吸附能力，以及0.1%酸性條件下解吸附，為其用于吸附材料提供了客觀依據(jù)。綜合分析結(jié)果，揭示硅膠吸附麻痹性貝類毒素機(jī)理可能是其表面的硅羥基與毒素分子中氨基、亞氨基之間形成氫鍵的作用，而通過(guò)加入酸破環(huán)氫鍵實(shí)現(xiàn)硅膠與毒素間解吸附。試驗(yàn)雖然僅以STX、neoSTX、dc STX、dcNEO這4種麻痹性貝類毒素作為代表，研究硅膠吸附性能，但由于PSP基本結(jié)構(gòu)為含有2個(gè)胍基的多疊六元環(huán)，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基、亞氨基基團(tuán)，因此，可以推測(cè)硅膠對(duì)其他麻痹性貝利毒素具有同樣吸附性能。鑒于此，硅膠有望用于動(dòng)物性水產(chǎn)食品中麻痹性貝類毒素檢測(cè)凈化前處理，適用于固相萃取填料。