袁光蔚，莫紫梅，王海波，李銳，韋蘭青

廣西-東盟食品檢驗檢測中心（南寧 530025）

堅果是一類具有堅硬外殼的植物果實，其風味獨特，并含有大量功能性生物活性成分，具有抗衰老、預防糖尿病、減肥等多重保健作用，備受消費者青睞[1-2]。然而，堅果在整個生長周期以及生產(chǎn)、加工、貯藏、銷售過程中極易受真菌侵染，產(chǎn)生并積累多種毒性代謝產(chǎn)物，這些毒素大多具有致畸、致癌、致突變等毒性，給食品安全及人類健康造成巨大的安全隱患[3]。

鑒于真菌毒素的危害，許多國家和地區(qū)均制定了嚴格的限量標準和檢測方法[4-5]。在真菌毒素的檢測技術中，基于免疫學的快速篩查技術體系已基本建成[6-8]，在精準定量檢測方面，液相色譜法作為當前實驗室的主流檢測技術，特別是與質譜技術的聯(lián)用，憑借其強大的分離能力和較高的靈敏度、準確性、穩(wěn)定性，成為當前真菌毒素檢測領域最為可靠的檢測技術[9-17]。研究在相關文獻中真菌毒素提取、凈化技術的基礎上，分別以板栗和核桃作為淀粉類堅果和油性堅果的代表基質[18]，綜合對比了幾款針對性較強的固相萃取小柱及QuEChERS技術的前處理效果，并結合UPLC-MS/MS的優(yōu)勢，建立了堅果中較易受污染、國內外關注度較高且毒性較強的7種主要真菌毒素的檢測方法，以期為堅果中真菌毒素的質量控制提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

樣品分別購自廣西區(qū)內農(nóng)貿市場、超市等。

黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）混合標準溶液（AFB1、AFG2=0.3 μg/mL，AFB2、AFG2=1.0 μg/mL）（上海安譜璀世標準技術服務有限公司）；赭曲霉毒素A（OTA）（10.05 μg/mL，美國o2si smart solutions公司）；T-2（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；玉米赤霉烯酮（ZEN）（1 120 μg/mL，德國Witega公司）。

Anybond SinCHERS-Myco14 凈化小柱（Myco14，天津安邦鍵合科技有限公司）；MFC 100固相凈化柱[MFC100普瑞邦（北京）科技有限公司]；Mycosep?228多功能凈化柱（簡稱Mycosep228，美國ROMER公司）；QuEChERS基質分散樣品制備包（4 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，美國Waters公司）；分散型SPE凈化包（150 mg MgSO4，50 mg PSA和50 mg C18；貨號：60105-204，美國賽默飛公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，美國賽默飛公司）；乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

MS3002SE 電子天平（美國梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Milli-pore公司）；KS260多管式渦旋震蕩器（德國 IKA公司）；S300H型超聲清洗儀（德國Elma公司）；ROTANTA460/460R型離心機（德國Hettich公司）；ACQUITY I-Class高效液相色譜儀（美國Waters公司）；TQ-XS質譜儀[配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及Masslynx 4.2工作站，美國Waters公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品經(jīng)粉碎，過0.425 mm篩后，混勻備用。稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準確加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超聲或者劇烈振蕩20 min，插入Myco14專用凈化小柱（小柱使用演示圖和實際操作圖見圖1上），下壓小柱至小柱內壓出2 mL液體，將小柱內凈化液體混勻，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾到進樣小瓶中，上機測定。

圖1 凈化小柱使用演示圖（上為Myco14小柱，下為MFC100、Mycosep228小柱）

1.3.2 標準溶液配制

空白基質溶液：取未檢出目標物的板栗、核桃空白樣品，按1.3.1小節(jié)進行處理，得空白基質濾液。

混合標準溶液配制：將各原始標準物質分別用乙腈溶解或稀釋，搖勻備用；分別準確吸取7種真菌毒素標準溶液適量于容量瓶中，用乙腈定容，搖勻即得。

基質匹配混合工作曲線溶液：取空白基質溶液將混合標準溶液逐級稀釋，配制成濃度比例為1∶2∶4∶10∶20∶40的系列混合工作曲線溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters CORTECSTM? UPLC? C18柱（1.6 μm，100 mm×2.1 mm）；柱溫40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量2 μL；流動相A為含0.1%（體積分數(shù)）的甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液，流動相B 為甲醇。梯度洗脫條件：0～0.5 min，90% A；0.5～6.0 min，90% A～50% A；6.0～7.0 min，50% A；7.0～9.0 min，50% A～5% A；9.0～12.0 min，5% A；12.0～12.1 min，5% A～90% A；12.1～15.0 min，90% A。

1.3.4 質譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：正離子；檢測模式：多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：500 ℃；霧化氣壓力：7.0 Bar；干燥氣流量：1 000 L/hr；氣簾氣流量：150 L/hr。

PIC參數(shù)：激活閾值：20倍背景；最小激活：5 000個計數(shù)點；重置閾值：50%激活值；質量范圍：10 Da以上；最小質量：40 Da；數(shù)據(jù)類型：棒狀圖；PIC持續(xù)時間：1秒。碰撞能量（eV）：與化合物所選定量離子碰撞能一致。

2 結果與分析

2.1 液相條件和質譜條件的確定

色譜柱、流動相、柱溫見文獻[19]。因為此次試驗采集的化合物較少，故洗脫梯度在參考文獻的基礎上進行了調整，縮短了洗脫時間，節(jié)省了分析時間，各化合物保留時間見表1。

表1 7種真菌毒素的質譜參數(shù)

取混合標準溶液直接進樣，利用Q1 MS Scan掃描模式確定各目標物的最佳電離模式以及加合形式；利用Q2 MS/MS Daughter Scan掃描模式將母離子打碎，得到二級碎片離子，結合Mass Frontier 7.0軟件推測的化合物可能的質譜轉換裂解途徑，確認其二級特征碎片離子[19]，選擇響應較高的兩個離子分別為定量離子和定性離子。試驗發(fā)現(xiàn)，除T-2響應最強分子離子峰為[M+NH4]+外，其余均為[M+H]+，7種化合物質譜參數(shù)見表1，MRM圖譜見圖2。PIC，即Product Ion Confirmation（產(chǎn)物離子確認），當目標離子的響應達到設定的閾值時，即可觸發(fā)一次Daughter Scan模式進行數(shù)據(jù)采集，在進行復雜基質中痕量毒素的檢測時增加一種確證的手段，降低假陽性的風險。

圖2 7種真菌毒素提取離子色譜圖

2.2 前處理方法的研究

2.2.1 提取溶劑的考察

目前，真菌毒素一般選擇有機溶劑和水的混合溶液進行提取，甲醇和乙腈作為最常用的兩種有機溶劑，甲醇雖比乙腈具有更好的溶解性，但也易將樣品中的有機酸、蛋白質、脂肪、酚等物質提取出來，導致提取液中雜質較多，不利于后續(xù)凈化、分析，而乙腈對蛋白質的沉淀作用較強且共提物少，因此乙腈作為首選。物質的解離度跟其pKa值和環(huán)境pH有直接關系[20]，提取溶劑的pH會顯著影響真菌毒素的解離狀態(tài)，進而影響其回收率。此次研究中OTA為含羧基毒素，以QuEChERS方法對不同提取溶劑進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，當提取溶劑中加入1%的甲酸時，OTA在兩種基質中的回收率由不加酸時的1%～5%提升到93%～97%，應該是甲酸能使溶劑保持較低pH，進而抑制目標物的離子化，使其更易溶于有機相，達到增高提取效率和保持穩(wěn)定回收率的效果，同時，參考文獻[11,21]，最終確定提取溶劑為乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）。

2.2.2 凈化方式的確定

此次研究主要通過回收率指標分別考察Myco14、MFC100、Mycosep228凈化小柱及QuEChERS的凈化效果。（1）Myco14凈化小柱：見1.3.1小節(jié)；（2）MFC100、Mycosep228：樣品經(jīng)粉碎，過0.425 mm篩后，混勻備用；稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準確加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超聲或者劇烈振蕩20 min，按4 600 r/min離心5 min，取4 mL上清液至配套玻璃管中，然后用小柱推壓至液體全部通過，混勻，經(jīng)0.22 μm有機濾器過濾即得（小柱使用演示圖見圖1下）；（3）QuEChERS：在文獻[22]的基礎上進行了適當改進，稱取2 g樣品，加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，振蕩提取20 min，加入QuEChERS基質分散樣品制備包，渦旋1 min，離心，取1.5 mL上清液，加入分散型SPE凈化包，渦旋1 min，離心，經(jīng)0.22 μm有機濾器過濾即得。

試驗過程發(fā)現(xiàn)，在以板栗為基質進行研究時，經(jīng)MFC100、Mycosep228、QuEChERS處理的濾液，均呈現(xiàn)不同程度的黃色，可直觀看出凈化效率欠佳，可對后續(xù)測定的色譜、質譜系統(tǒng)造成污染，而以核桃為基質進行研究時，各濾液均為澄清。如圖3所示。

圖3 4種凈化方式的凈化效果（上為板栗基質，下為核桃基質）

取板栗、核桃空白樣品，加入適量混合標準溶液，分別按上述前處理步驟進行處理，得各前處理方法回收溶液。然后取各方法空白基質溶液稀釋混合標準溶液至恰當濃度，利用單點法分別考察其前處理方法的回收率，結果見圖4和圖5。對回收率數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Myco14凈化小柱在兩種基質中的回收率為83%～106%，所有化合物均有較好的回收率。MFC100凈化小柱在兩種基質中的回收率為48%～115%，回收率在70%～80%之間的占比為64%，回收率低于60%的化合物是OTA，分別為48%和50%。Mycosep228凈化小柱在兩種基質中的回收率為0～121%，除OTA的回收率為0外，其余化合物回收率均大于87%。取適量混合標準溶液直接過各款凈化小柱，結果發(fā)現(xiàn)MFC100、Mycosep228對OTA具有極強的吸附作用，吸附率分別高達99.3%和97.2%，但可能由于共提取雜質和填料之間的相互作用，使得在OTA在MFC100中的回收率仍有50%左右。QuEChERS前處理對板栗基質進行考察時回收率為83%～104%，而在核桃基質中的回收率僅為48%～104%，AFBs類化合物回收率普遍較低，為48%～70%，應該是因為試驗中凈化材料對油脂性基質適用程度不高。因此，此次研究最終選擇以Myco14為凈化小柱進行下一步的方法學研究。

圖4 4種凈化方式在板栗基質中回收率統(tǒng)計

圖5 4種凈化方式在核桃基質中回收率統(tǒng)計

2.3 方法學研究

2.3.1 基質效應

基質效應是ESI源受離子化機制的影響，目標物與共流出物產(chǎn)生競爭性電離，導致目標物響應增強或者降低的現(xiàn)象，通常以目標物在空白基質液中的峰面積與在純溶劑中峰面積的百分比來評估基質效應。高于100%說明有基質增強效應，低于100%則說明有基質抑制效應。為降低或消除基質效應的影響，通常的手段是采用穩(wěn)定同位素稀釋法或基質加標曲線法進行定量[19]。試驗結果顯示：目標物在板栗中的基質效應為81%～102%，主要為基質抑制效應；在核桃中基質效應為85%～97%，基質效應不明顯?？紤]到堅果基質的多樣性，研究仍采用基質加標曲線法進行定量計算。

2.3.2 方法的線性及范圍

將基質匹配混合工作曲線溶液上機檢測，以待測化合物定量離子峰面積對其濃度進行線性擬合，獲得各目標物的線性方程。7種化合物在各自濃度區(qū)間范圍內線性關系良好，相關系數(shù)r均大于0.996，各具體數(shù)據(jù)見表2和表3。

表2 7種化合物在板栗基質中的線性范圍、線性方程、定量限及在三個不同加標濃度水平下的回收率與相對標準偏差（SRSD）

表3 7種化合物在核桃基質中的線性范圍、線性方程、定量限及在三個不同加標濃度水平下的回收率與相對標準偏差（SRSD）

2.3.3 檢出限、準確度和精密度

試驗采用逐級稀釋空白加標樣品至儀器能檢出的最低含量為各化合物的檢出限，并以檢出限的3倍量為方法定量限。取板栗、核桃空白樣品，進行了曲線最低點（低水平：加標量為1.5～28 μg/kg）、曲線第二低點（中水平：加標量為3.0～56 μg/kg）、曲線第三低點（高水平：加標量為6～112 μg/kg）濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6份樣品，同時對回收率精密度進行考察，回收率在80%～107%之間，SRSD為0.7%～4.9%，表明該方法具有良好的準確性和精密度，具體結果見表2和表3。

2.3.4 樣品檢測

采用試驗方法對購自廣西區(qū)內農(nóng)貿市場和超市的板栗、核桃、巴旦木、開心果、腰果、碧根果、花生共35批樣品（每種堅果5批）進行檢測，其中1批花生檢出了AFB1，含量為1.48 μg/kg，符合GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[23]的要求，其余均未檢出。可見雖然市售堅果中存在一定的真菌毒素污染風險，需給予持續(xù)關注，但是整體狀況還是相對安全的，可放心購買、食用。

2 結論

研究以代表性較強的板栗、核桃為基質，通過考察了Myco14等三款毒素專用小柱和QuEChERS技術的提取、凈化效果，建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜測定堅果中7種常見真菌毒素的檢測方法，經(jīng)驗證，方法檢出限、準確度、精密度等方法學指標均能達到確證檢測和痕量分析的要求。該方法前處理所采用的擠壓通過式固相萃取小柱較傳統(tǒng)的保留、洗脫模式固相萃取小柱更為簡便、高效，凈化效果較QuEChERS技術更為徹底，儀器檢測手段靈敏、準確、穩(wěn)定，可為市場監(jiān)管部門和堅果生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)對堅果風險的監(jiān)測和評估提供有效的技術手段。