張曉娜，趙曼，豐亞敏，周海旭

1.新鄉(xiāng)工程學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）；2.河南科技學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）

構(gòu)樹(shù)（Paper mulberry，Broussonetia papyrifera）也稱楮樹(shù)，為?？茦?gòu)樹(shù)屬多年生闊葉落葉喬木，廣泛分布于我國(guó)黃河、長(zhǎng)江流域[1]。構(gòu)樹(shù)病蟲害少，在自然環(huán)境中的抗逆性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，成活率高[2]。構(gòu)樹(shù)葉中維生素、蛋白質(zhì)、黃酮類、多糖等成分含量豐富[3]，有研究表明構(gòu)樹(shù)葉所含的多糖具有預(yù)防腫瘤、抗溶血活性、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)肝臟等重要的生理功能[4-6]。

構(gòu)樹(shù)葉主要作為飼料喂養(yǎng)家畜[7]，從構(gòu)樹(shù)葉中提取黃酮的研究較多，關(guān)于構(gòu)樹(shù)葉多糖提取的研究較少，多糖的主要提取方法有水提醇沉法、加熱回流提取法和酵母發(fā)酵法[8-10]，多糖得率較低，原因可能是多糖與構(gòu)樹(shù)葉中的木質(zhì)素等成分存在共價(jià)酯鍵，多糖較難溶出。在堿性條件下，多糖和木質(zhì)素等形成的共價(jià)酯鍵容易被破壞，可以增加多糖的溶出量[11]，因此，通常使用堿液來(lái)提取麩皮、米糠和葉子中的多糖[12]。選用NaOH溶液提取構(gòu)樹(shù)葉中的多糖，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)構(gòu)樹(shù)葉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為構(gòu)樹(shù)葉綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

構(gòu)樹(shù)葉（2022年11月采自新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)）；濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、葡萄糖等（均為分析純）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

JA5003電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；H1850高速離心機(jī)（湘儀離心儀器有限公司）；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠）；723N可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；BXH-65電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 構(gòu)樹(shù)葉多糖堿提工藝流程

構(gòu)樹(shù)葉→洗凈烘干（105 ℃，3 h）→粉碎→稱量→配制溶液→加入NaOH溶液→水浴→離心（4 200 r/min，10 min）→取上清液→多糖含量測(cè)定

1.3.2 構(gòu)樹(shù)葉多糖的測(cè)定

分別移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL 0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液至20 mL比色管，用蒸餾水將比色管補(bǔ)至1.0 mL。分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，快速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，混勻，于30 ℃水浴反應(yīng)20 min，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.020 7x-0.035 3（R2=0.993 3），見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖提取液經(jīng)過(guò)離心，吸取上清液，稀釋一定倍數(shù)后，按照上述操作方法操作，多糖含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（W）計(jì)，數(shù)值以百分率（%）表示，按式（1）計(jì)算。

式中：V1為樣品定容體積，mL；V2為比色測(cè)定時(shí)所移取樣品測(cè)定液體積，mL；m1從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中的含糖量，μg；m2為樣品質(zhì)量，g；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在料液比1︰20 g/mL、堿提時(shí)間60 min、堿提溫度60 ℃、NaOH溶液濃度0.1 mol/L的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)多糖得率的影響

由圖2可知，隨著溶液量增加，多糖得率逐漸上升，這與提取液量增大溶液黏度會(huì)降低，從而使構(gòu)樹(shù)葉多糖容易擴(kuò)散出來(lái)有關(guān)。溶液量過(guò)大，用水量增加，廢液濃縮成本會(huì)增高。因此，綜合考慮多糖提取的整體效益，最適料液比選擇1︰30 g/mL。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 堿提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3可知，多糖得率總體上升，但隨著提取時(shí)間的變長(zhǎng)，多糖大量溶出會(huì)導(dǎo)致提取液總黏度增大，由于黏度影響，剩余未溶解的多糖溶解速率會(huì)有所下降。因此，考慮到成本和提取效率，綜合最適堿提時(shí)間選擇160 min。

圖3 堿提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.3 堿提溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖4可知，隨著溫度增高，構(gòu)樹(shù)葉多糖得率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，80 ℃后有所減緩。這可能是因?yàn)闇囟壬吆螅崛∫旱酿ざ茸冃?，分子運(yùn)動(dòng)會(huì)加快，構(gòu)樹(shù)葉多糖更易溶出，但溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)和造成其生物活性喪失[14]，所以最適提取溫度選擇80 ℃。

圖4 堿提溫度對(duì)多糖得率的影響

2.1.4 NaOH溶液濃度對(duì)多糖得率的影響

由圖5可知，NaOH溶液濃度大于0.15 mol/L時(shí)，構(gòu)樹(shù)葉多糖得率增加緩慢，總體看來(lái)，NaOH溶液濃度越高，構(gòu)樹(shù)葉多糖的得率也就越大，主要原因可能是NaOH溶液的存在溶解了構(gòu)樹(shù)葉的細(xì)胞膜，能夠促進(jìn)構(gòu)樹(shù)葉多糖的釋放[13]，但提高堿液濃度會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，影響多糖活性，同時(shí)堿液濃度高還會(huì)造成廢液處理難度，提高生產(chǎn)成本。因此，NaOH溶液濃度選取0.10 mol/L。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

由表2可以得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=12.77+0.62A+0.62B+0.68C+0.30AB-0.28AC+0.080BC-0.56A2-0.76B2-0.27C2。

表2 響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1 建立回歸方程及方差分析

由表3可知，該模型P＜0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P為0.470 7，不顯著，模型與試驗(yàn)值較符合。R2=0.976 5，表明模型響應(yīng)值的變化97.65%來(lái)自所選變量，未知因數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小。由F值可見(jiàn)，各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)镹aOH溶液濃度＞料液比＞堿提溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互項(xiàng)解析

料液比、提取溫度與NaOH溶液濃度這3個(gè)單因素的相互作用對(duì)構(gòu)樹(shù)葉多糖得率的影響由圖6～圖8反映。通過(guò)Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析得出曲面圖存在中心點(diǎn)，存在最佳條件。

圖6 料液比與堿提溫度對(duì)多糖得率影響的等高線和響應(yīng)曲面

由圖6可知，AB交互項(xiàng)等高線呈橢圓且密集，響應(yīng)曲面坡面陡峭，交互作用顯著，說(shuō)明料液比（A）與堿提溫度（B）的交互作用對(duì)多糖得率Y影響較大，這與回歸模型的交互項(xiàng)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

由圖7可知，AC交互項(xiàng)等高線接近橢圓形，曲面坡度陡峭，表明料液比（A）與NaOH溶液濃度（C）的交互作用對(duì)多糖得率Y影響顯著，但AC等高線密集程度小于AB，所以交互項(xiàng)AC對(duì)Y的影響小于交互項(xiàng)AB。

圖7 液料比與NaOH溶液濃度對(duì)多糖得率影響的等高線和響應(yīng)曲面

由圖8可知，隨著堿提溫度（B）、NaOH溶液濃度（C）的增加，多糖得率均緩慢上升，這與單因素結(jié)果相同，所以堿提溫度（B）與NaOH溶液濃度（C）交互作用不顯著。

圖8 堿提溫度與NaOH溶液濃度對(duì)多糖得率影響的等高線和響應(yīng)曲面

綜合分析顯示各因素對(duì)多糖得率的影響存在一定交互作用，AB、AC相互疊加影響顯著，BC不顯著，影響順序?yàn)锳B＞AC＞BC。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在Design-Expert 10.0.7軟件中對(duì)堿提構(gòu)樹(shù)葉多糖的擬合進(jìn)行分析，在提取160 min時(shí)，預(yù)測(cè)的該試驗(yàn)最佳提取工藝為料液比1︰33.408 g/mL、堿提溫度88.483℃，NaOH溶液濃度0.117 mol/L，此時(shí)，構(gòu)樹(shù)葉多糖得率的理論值為13.243%。

為檢驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，綜合考慮成本及現(xiàn)有條件，按照料液比1︰33 g/mL、堿提溫度88 ℃、NaOH溶液濃度0.12 mol/L的條件，提取160 min，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)做平行及空白試驗(yàn)，多糖得率平均值為13.21%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值13.243%非常接近。結(jié)果表明，使用該方法優(yōu)化構(gòu)樹(shù)葉多糖堿提工藝的研究有良好的可行性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用堿液提取構(gòu)樹(shù)葉多糖，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)镹aOH溶液濃度＞料液比＞堿提溫度。根據(jù)預(yù)測(cè)模型，堿提時(shí)間以160 min計(jì)，最佳提取工藝為料液比1︰33 g/mL、堿提溫度88 ℃、NaOH溶液濃度0.12 mol/L。3次驗(yàn)證試驗(yàn)得到的多糖平均得率為13.21%，與響應(yīng)面理論值13.243%非常接近，說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)構(gòu)樹(shù)葉多糖的堿提工藝條件的優(yōu)化研究合理且可行。