周煜凡，馮疆濤，白冰瑤

1.阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心（阿克蘇 843000）；2.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（阿拉爾 843300）

核桃分心木（Diaphragma juglandisFructus）又稱核桃夾，是果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜。新疆少數(shù)民族醫(yī)學(xué)記載，分心木可改善體寒、腎虛的生理虛弱，在臨床上主要用于治療遺精滑泄、尿頻遺尿、崩漏、帶下、泄瀉、痢疾[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，核桃分心木中富含黃酮、多酚、多糖、皂苷、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸及微量元素等營養(yǎng)成分[2-3]，具有良好的藥理作用。

紙皮核桃因皮薄如紙、易取整仁而得名，又名露仁核桃，在我國主要產(chǎn)地分布在新疆和云南，又以新疆阿克蘇的產(chǎn)品為佳。紙皮核桃中含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)和微量元素及維生素[4]，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，在脫貧攻堅及鄉(xiāng)村振興中具有重要地位。當(dāng)前，新疆紙皮核桃分心木多以丟棄為主，利用率極低，造成生物資源的極大浪費和一定程度的環(huán)境破壞，因此，通過化學(xué)方法建立分心木黃酮提取工藝是解決資源浪費的重要手段之一。科研工作者對核桃分心木中各種具有藥用價值物質(zhì)提取研究較多[5-9]，但對于新疆紙皮核桃分心木報道較少，因此，采用新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取分心木中的總黃酮，通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為深入開發(fā)紙皮核桃分心木提供研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

新疆紙皮核桃（購自阿克蘇市三角地農(nóng)貿(mào)市場），將核桃分心木清洗后放置在陰涼處充分干燥，干脆后粉碎，過0.250 mm（60目）篩，置于保鮮袋中妥善保存；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純）。

GX-20多功能粉碎機（浙江高鑫工貿(mào)有限公司）；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器（金華市醫(yī)療儀器廠）；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；QENE單道移液器（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）；LE204E萬分之一天平（梅特勒托利多集團）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻[10]方法，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品充分干燥后精確稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液將稱取的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品定容在100 mL容量瓶中，搖勻后作為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。將配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為母液，在10 mL容量瓶中按梯度精準(zhǔn)配制質(zhì)量濃度為0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別加入0.3 mL 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaNO2溶液和10% Al(NO3)3，混合均勻后靜置6 min，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液定容。靜置15 min，待定容好的溶液充分混合均勻，在510 nm波長下測定樣品的吸光度，平行測定3次。

可根據(jù)紫外-可見分光光度法測得各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（X）對應(yīng)的吸光度（Y），對結(jié)果進行擬合，得到回歸方程Y=11.779X+0.067 6，R2=0.999 4。結(jié)果表明在0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度之間具有良好線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 總黃酮提取工藝

采用熱回流法提取分心木中的黃酮，稱取1 g核桃分心木粉末置于圓底燒瓶，用一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，冷凝回流，在一定溫度下以1 000 r/min磁力攪拌一段時間，待回流結(jié)束后將圓底燒瓶中的混合溶液倒出并抽濾，得黃酮粗提液。以30%乙醇將收集的粗提液定容至100 mL，備用，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方案，測定分心木黃酮粗提液的吸光度，平行測定3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算黃酮濃度，按式（1）計算黃酮提取率。

式中：Y為黃酮提取率，%；C為黃酮質(zhì)量濃度，g/mL；V為黃酮提取液體積，mL；m為紙皮核桃分心木質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取溫度進行單因素試驗，分別考察4個不同因素對黃酮吸光度的影響，單因素試驗設(shè)計表見表1。

表1 單因素試驗設(shè)計

1.2.4 紙皮核桃總黃酮提取工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 12.0.3.0軟件，在單因素試驗基礎(chǔ)上，分別將乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度4個影響因素組合，形成四因素三水平響應(yīng)面試驗，以總黃酮提取率為響應(yīng)值進行Box-Behnken試驗設(shè)計，因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗所有數(shù)據(jù)測定3次，取平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差值；繪圖采用Origin 2019b軟件；響應(yīng)面分析軟件為Design-Expert 12.0.3.0；采用IBM SPSS Statistics 26進行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對紙皮核桃分心木總黃酮提取的影響。對不同乙醇的體積分?jǐn)?shù)（30%，40%。50%，60%和70%）進行單因素試驗。試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)開始增大時，吸光度增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時總黃酮提取率為3.83%，達到最大，但乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，黃酮提取率降低。可能的原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，溶液極性較大，提取物溶出的雜質(zhì)較多，黃酮得率較低[11]，濃度增大時，極性開始減小，分心木中黃酮的極性與此體積分?jǐn)?shù)乙醇極性接近，提取率增大，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，醇溶性的雜質(zhì)開始增多，而黃酮的溶出量減少[12]。由此得出乙醇體積分?jǐn)?shù)60%較為適宜。

2.1.2 不同料液比對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑的用量會對總黃酮的提取率產(chǎn)生影響?？疾炝瞬煌弦罕龋?︰20，1︰30，1︰40，1︰50和1︰60 g/mL）對核桃分心木總黃酮的提取率的影響，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，料液比從1︰20（g/mL）變化至1︰40（g/mL）時，總黃酮提取率從2.75%增大至3.83%，繼續(xù)增加料液中液體占比，總黃酮提取率呈降低趨勢，1︰60（g/mL）時，總黃酮提取率3.04%。主要是由于溶劑對分心木中的黃酮具有溶解和擴散作用，溶劑用量增大時，黃酮溶解得越多，提取率越高[13]，隨著溶劑體積繼續(xù)增大，黃酮溶解基本達到飽和，但醇溶性雜質(zhì)的溶解也逐漸增多[14]，黃酮提取率隨之降低，因此，料液比選擇1︰40（g/mL）。

2.1.3 不同提取時間對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑萃取法提取總黃酮中，提取時間也會有重要影響。將核桃分心木分別浸泡1，2，3，4和5 h，試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增長，總黃酮提取率顯著增加，提取時間達到3 h時，總黃酮提取率達到最大，提取時間超出3 h時，提取率呈降低趨勢。可能的原因是隨著時間的延長，紙皮核桃分心木中的雜質(zhì)析出增多，黃酮提取率降低[15]。因此，提取時間選擇3 h。

2.1.4 不同提取溫度對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溫度的升高有利于溶劑分子熱運動，加快反應(yīng)速率。在核桃分心木提取總黃酮中，分別考察提取溫度為40，50，60，70和80 ℃時的總黃酮提取率，試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度對紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大，提取溫度70 ℃時為最大，提取溫度大于70 ℃時，提取率卻隨之降低。可能的原因是隨著提取溫度的升高，小分子運動加快，有利于紙皮核桃分心木黃酮的溶出[16]，但溫度繼續(xù)增加，有可能導(dǎo)致部分黃酮的結(jié)構(gòu)受到破壞[17]，此外，高溫下乙醇揮發(fā)，濃度降低也會導(dǎo)致黃酮提取率下降[18]。因此選擇提取溫度為70 ℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分心木總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken Design試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)表3所示的試驗數(shù)據(jù)，運用Design-Expert 12.0.3.0軟件進行回歸分析，得到回歸方程Y=3.86+0.149 2A+0.133 3B+0.717 5C+0.1D-0.18AB-0.172 5AC+0.21AD+0.157 5BC-0.322 5BD+0.057 5CD-0.276 2A2-0.262 5B2-0.323 8C2-0.387 5D2。

2.2.2 方差分析

從方差分析可以看出模型的P值小于0.000 1，響應(yīng)面回歸模型為極顯著水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義，失擬項的P值大于0.05，影響不顯著，試驗?zāi)Ｐ蛿M合良好，說明各因素選擇合理。從表4可以看出，交互項BD，二次項A2，B2的P值小于0.05，說明對紙皮核桃分心木總黃酮提取影響顯著，一次項C，二次項C2，D2的P值小于0.01，說明對總黃酮提取影響極顯著，其他因素不顯著。根據(jù)F值和P值可以得到各因素影響分心木總黃酮提取率的順序：提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取溫度。

表4 方差分析

模型的多元相關(guān)系數(shù)R2=0.914 7，說明所構(gòu)建的模型相關(guān)性較好；Radj2=0.829 4，Rpred2=0.683 3，Radj2-Rpred2＜0.2，回歸模型能充分說明工藝過程；C.V.為7.50%（＜10%），表明試驗的可信度和精確度較高；精密度為11.438 4（＞4），用此模型預(yù)測紙皮核桃分心木中總黃酮提取率合適[19-21]。

2.2.3 交互作用分析

為考察各個因素交互作用對總黃酮提取率的影響，根據(jù)二次方程分別作出任意2個試驗因素間交互作用三維響應(yīng)面圖和等高線圖。

等高線和響應(yīng)曲面圖能直觀反映交互作用對響應(yīng)值的影響程度，等高線越密集，曲面越陡，則交互作用的影響越顯著，且等高線越接近橢圓，2個因素的交互作用越強[22-23]。從圖6可以看出，料液比和提取溫度的交互作用最強，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用次之，對應(yīng)的響應(yīng)面圖坡度陡峭，與方差分析中的結(jié)論一致。

圖6 各因素交互作用對總黃酮提取率影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.2.4 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert 12.0.3.0預(yù)測結(jié)果可得：乙醇體積分?jǐn)?shù)56.110%、料液比1︰43.334（g/mL）、提取時間3.631 h、提取溫度69.312 ℃時，總黃酮提取率為4.200%。參照預(yù)測得到的最優(yōu)試驗條件，同時為驗證試驗易于操作，將各條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、料液比1︰43（g/mL）、提取時間3.6 h、提取溫度69℃，此時紙皮核桃分心木總黃酮提取率為4.131%±0.045%（n=3），預(yù)測值與實際值之間相差1.64%，結(jié)果吻合度高，說明該模型的可靠性良好，工藝具有良好的穩(wěn)定性和可行性。

3 結(jié)論

以新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取總黃酮，可以發(fā)現(xiàn)紙皮核桃分心木總黃酮的提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度有直接關(guān)系，并且運用單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化紙皮核桃分心木總黃酮提取工藝，得到總黃酮提取的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，料液比1︰43（g/mL）、提取時間3.6 h、提取溫度69 ℃，黃酮提取率為4.131%±0.045%。該方法簡單易行，產(chǎn)率較可觀，適用于新疆紙皮核桃分心木中黃酮的提取。