余晚霞，陳勇杏，董奎奎，郭磊，魯斌，華燕

西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實驗室（昆明 650224）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl）是百合科黃精屬植物，藥食兩用植物之一[1]，其根莖功效始見于《名醫(yī)別錄》，述其“調(diào)養(yǎng)心臟、脾胃、腎，祛除風(fēng)濕，長期服用有益于身心健康、延長壽命、且能作為充饑食物”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為其具有調(diào)節(jié)免疫功能、提高記憶和學(xué)習(xí)的能力，并具有抗氧、延緩衰老的功用，起到延長壽命的作用，另具有緩解疲乏、勞累，保護(hù)心臟和肝功能，亦可降低血糖濃度、抗癌、治療骨頭松散等多種藥用功能[3-4]。

滇黃精主要成分為甾體皂苷、三萜皂苷、異黃酮、多糖、苯丙素類、生物堿及揮發(fā)油等多種活性成分，具有降血糖、抗炎等功能[5-6]。

竹葉黃酮是從淡竹葉中提取出的生物黃酮，具有保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、消炎抗菌、有效降低血小板集、防止血栓形成和延緩皮膚衰老等藥理作用[7]。同時，竹葉黃酮還可作風(fēng)味增強(qiáng)劑、甜味劑、色素在食品行業(yè)中應(yīng)用[8]。

已有學(xué)者研究了黃精保健酒、黃精速溶茶、黃精橙汁復(fù)合飲料等產(chǎn)品[9-11]，其中以皂苷為主要原料的產(chǎn)品有三七皂苷固體速溶顆粒劑[12]、滇黃精皂苷微膠囊[13]。以滇黃精皂苷、竹葉黃酮制作復(fù)合飲料的報道鮮少，試驗在滇黃精提取物（皂苷）中添加自然風(fēng)味增強(qiáng)劑竹葉黃酮制成飲料，向當(dāng)前大眾響應(yīng)的自然、綠色、低糖等產(chǎn)品方向發(fā)展。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

Hleidolph Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph Group，德國）；ZK-100 B型高速萬能粉碎機(jī)（北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司）；BSA224S十萬分之一電子天平（Sartorius集團(tuán)，德國）；Evolution 300分光光度計（賽默飛世爾科技）；BCD-215KS海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；DHG-9140 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（金壇市丹瑞電器廠）；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）。

薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（云南西力生物技術(shù)股份有限公司）；甲醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；香草醛（上海麥克林生化科技有限公司）；冰醋酸（四川西隴科學(xué)有限公司）；高氯酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；乙醇（四川西隴科學(xué)有限公司）；以上均為分析純。

1.2 試驗原料

滇黃精于2022年9月26日采自云南臨滄，樣品程度新鮮飽滿；竹葉黃酮（云奇生物），包裝完好無損，避光保存；甜菊糖苷（食品級，河南萬邦化工科技有限公司），符合國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。

2 滇黃精皂苷飲料的生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

2.1 工藝流程

新鮮黃精→預(yù)處理→醇提水沉→滇黃精皂苷提取液→竹葉黃酮→甜菊糖苷→調(diào)配→蜂蜜→均質(zhì)→裝罐→檢測→殺菌→成品

2.2 試驗操作要點(diǎn)

2.2.1 滇黃精皂苷提取液的制備

將新鮮滇黃精洗凈，切片，經(jīng)干燥，并稱取一定量樣品，按料液比1︰20 g/mL用醇提水沉法提取，得到滇黃精皂苷提取液。以薯蕷皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛冰醋酸-高氯酸法[14]測定皂苷含量，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=26.684x+0.018 2（R2=0.999 3）。

2.2.2 調(diào)配飲料

通過預(yù)試驗對產(chǎn)品配方進(jìn)行組合研究后，將滇黃精皂苷提取液、竹葉黃酮和甜菊糖苷溶液分別按一定比例混合，調(diào)配出口感適宜的飲料，并進(jìn)行風(fēng)味評價。

2.2.3 裝罐，檢測，成品

將調(diào)配好的滇黃精天然飲料裝入玻璃容器，密封，在一定溫度、時間條件下滅菌，制成成品。

2.3 飲料調(diào)配單因素試驗

影響滇黃精皂苷天然飲料風(fēng)味的因素為黃精皂苷提取液、竹葉黃酮、甜菊糖苷，確定其中任意兩個因素，改變單個變量，以感官評價為參考指標(biāo)開展單因素試驗。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取每個因素的三個水平，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以調(diào)配出滇黃精皂苷飲料的最佳配方比例。

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 感官評價指標(biāo)與試驗方法

將調(diào)配好的飲料邀請12位學(xué)生，按感官評價標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 滇黃精皂苷天然飲料的感官評價標(biāo)準(zhǔn)

3.1.1 竹葉黃酮提取液添加量對滇黃精皂苷天然飲料的影響及結(jié)果

在滇黃精皂苷提取液添加量30%、甜菊糖苷添加量0.04%的條件下，分別添加20%，25%，30%，35%和40%竹葉黃酮提取液進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見表2。

表2 竹葉黃酮添加量對滇黃精天然飲料的影響

由表2可知，竹葉黃酮添加量對滇黃精皂苷天然飲料的風(fēng)味影響，以30%的添加量最適宜。

3.1.2 甜菊糖苷添加量對滇黃精天然飲料的影響及結(jié)果

當(dāng)竹葉黃酮的添加量為30%、滇黃精皂苷溶液添加量為35%時，選取0.03%，0.04%，0.05%，0.06%和0.07%甜菊糖苷進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見表3。

表3 甜菊糖苷添加量對滇黃精天然飲料的影響

由表3得出：甜菊糖苷添加量為0.04%時最好。

3.1.3 滇黃精皂苷提取液添加量對滇黃精天然飲料風(fēng)味的影響及結(jié)果

當(dāng)竹葉黃酮添加量為30%、甜菊糖苷添加量為0.04%時，選取25%，30%，35%，40%和45%滇黃精皂苷提取液進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見表4。

表4 滇黃精皂苷提取液對滇黃精天然飲料的影響

由表4得出：當(dāng)竹葉黃酮添加量為30%、甜菊糖苷添加量為0.04%時，滇黃精皂苷提取液最佳添加量為35%。

3.2 檢測指標(biāo)

3.2.1 理化指標(biāo)檢測方法

可溶性固形物，采用手持折光儀法[15]；pH測定，利用pH計進(jìn)行測定。

3.2.2 微生物檢測方法

飲料微生物指標(biāo)參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》及GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》。

3.2.3 DPPH自由基清除率的測定

①大江大河治理滯后，防洪工程體系薄弱。黑龍江沒有經(jīng)過系統(tǒng)的規(guī)劃和治理，防洪體系不健全，干流堤防防洪標(biāo)準(zhǔn)大部分不足20年一遇，沙基沙堤多且部分堤段不閉合。嫩江、松花江干流堤防有1/3沒有達(dá)到規(guī)劃標(biāo)準(zhǔn)，豐滿、察爾森等骨干水庫還存在病險問題，胖頭泡、月亮泡蓄滯洪區(qū)建設(shè)明顯滯后。

參考Mc Cue等[16]的方法并略修改，采用分光光度法對DPPH自由基清除率進(jìn)行測定，取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和2 mL DPPH溶液（濃度為0.5 mmol/mL）充分混勻后，避光靜置30 min后在517 nm波長處分別測定其吸光度A1，同法，測定2.0 mL乙醇加2 mL（不同質(zhì)量濃度的）樣品溶液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液，加入2.0 mL甲醇，測定其吸光度A0，以甲醇為空白。DPPH清除率（%）按式（1）計算：

3.3 滇黃精皂苷天然飲料配方的優(yōu)選

為使配制的飲料具有良好的口感、風(fēng)味、色澤及穩(wěn)定性，在以竹葉黃酮、甜菊糖苷、滇黃精皂苷提取液三個單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗篩選最佳飲料配方。

3.3.1 響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗設(shè)計與試驗結(jié)果

采用響應(yīng)面（Box-Behnken）優(yōu)化試驗設(shè)計，以滇黃精皂苷提取液、竹葉黃酮、甜菊糖苷的添加量為自變量，以滇黃精皂苷天然飲料的感官評分為響應(yīng)值繪制響應(yīng)面，分析出滇黃精皂苷飲料的最佳配方。

以滇黃精皂苷飲料的感官評分（Y）為響應(yīng)值，在配方優(yōu)化的單因素試驗基礎(chǔ)上，選取竹葉黃酮添加量（A）、甜菊糖苷添加量（B）、滇黃精皂苷提取液添加量（C）為影響因素。Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，回歸模型方差分析見表6。

表5 飲料配方優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 飲料配方優(yōu)化回歸模型方差分析

由表6中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次項回歸擬合，得到以感官評價（Y）為響應(yīng)值，以竹葉黃酮添加量（A）、甜菊糖苷添加量（B）、滇黃精皂苷提取液添加量（C）為自變量的二次項回歸方程：Y=91.06+1.69A-0.875 0B+0.937 5C+1.87AB-1.50AC-1.62BC-5.28A2-5.66B2-2.78C2。

響應(yīng)面二次回歸方差及顯著性分析結(jié)果（模型的P＜0.000 1）說明該方程模型級為顯著，失擬項（Lack of it）檢驗為不顯著，說明該方程對試驗擬合性較好。在此試驗條件下，回歸模型所考察的因素足以反映各成分對滇黃精皂苷飲料口感的影響，判定系數(shù)R2=0.986 6，Radj2=0.969 4，說明回歸模型與試驗值擬合較好，可用于滇黃精皂苷飲料感官評分的理論推測和分析。

應(yīng)用多元二次回歸方程，擬合表6的試驗數(shù)據(jù)分析，該方程可推算出試驗因素在響應(yīng)面曲面中所覆蓋的區(qū)域并進(jìn)行初步篩選因素的最佳取值范圍，根據(jù)多元二次回歸方程模型分別做出試驗因素間交互作用的3-D響應(yīng)曲面和等高線（見圖1～圖3）以評價竹葉黃酮與滇黃精皂苷、竹葉黃酮與甜菊糖苷、滇黃精皂苷與甜菊糖苷之間因素作用試驗評分的影響。

圖1 試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

由圖1可知，滇黃精皂苷在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗感官評分隨甜菊糖苷和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，研究發(fā)現(xiàn)滇黃精皂苷天然飲料感官評分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，色澤清亮、狀態(tài)具穩(wěn)定性。

由圖2可知，甜菊糖苷在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗感官評分隨滇黃精皂苷和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，滇黃精皂苷天然飲料感官評分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，飲料具自然的風(fēng)味。

圖2 試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

由圖3可知，竹葉黃酮在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗感官評分隨滇黃精皂苷提取液和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，滇黃精皂苷天然飲料感官評分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，風(fēng)味獨(dú)特。

圖3 試驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

4 驗證試驗

依據(jù)Design-Expert 13.0軟件得出滇黃精皂苷飲料最優(yōu)配比：滇黃精皂苷36.59%，竹葉黃酮31.22%，甜菊糖苷0.048 3%，接近于天然飲料，此條件下，感官評分預(yù)測值為91.27分。且A2B2C2的數(shù)值P值均為顯著，對感官評價的影響為顯著。為最大化降低滇黃精皂苷固有苦澀味，故加0.5%的蜂蜜，以蜂蜜的醇香味掩蓋其不良風(fēng)味。

為便于生產(chǎn)和實際操作，故將配方修改為滇黃精皂苷為36%、竹葉黃酮30%、甜菊糖苷0.04%，選取該組合做進(jìn)一步的驗證試驗，得出滇黃精皂苷飲料的感官評分為90.43分，與預(yù)測值相近，證明了該方法的可行性。

5 滇黃精皂苷飲料的質(zhì)量評價

5.1 感官指標(biāo)

色澤：呈淡茶色，色澤均一飲料穩(wěn)定，富有較好光澤，口感純正，甜度適中，無異味，流動性好；滋味：有滇黃精氣味和竹葉黃酮特有風(fēng)味。

5.2 理化指標(biāo)

飲料的主要理化指標(biāo)檢測結(jié)果如表7所示。

表7 飲料的主要理化指標(biāo)檢測結(jié)果

5.3 微生物指標(biāo)

微生物指標(biāo)及結(jié)果如表8所示。

表8 微生物指標(biāo)及結(jié)果

5.4 滇黃精皂苷飲料對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除能力可以作為天然抗氧化劑抗氧化活性的衡量指標(biāo)[17]。不同質(zhì)量濃度滇黃精皂苷飲料對DPPH自由基清除能力見圖4。

圖4 滇黃精皂苷飲料溶液質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除能力的影響

由圖4可知，不同質(zhì)量濃度（0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50和2.00 mg/mL）的滇黃精皂苷飲料溶液對DPPH自由基均有一定的清除作用，且隨著提取液濃度的增加清除率也隨之身高，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)1.50 mg/mL時，清除率趨于平衡。通過測定發(fā)現(xiàn)其對DPPH自由基清除率為59.81%，說明該飲料具有一定體外抗氧化活性。

滇黃精主要含有多糖、皂苷類、黃酮類、生物堿類等成分。趙明等[18]已研究并證實滇黃精具有抗氧化活性及對人體具有安全性；陳斌等[19]研究含滇黃精的組合物，亦表明其具有抗氧化作用；以滇黃精與玉米須、苦瓜等制備滇黃精飲料，具有止渴、降糖作用[20]。結(jié)合試驗，推測滇黃精皂苷飲料抗氧化性除了與其自身含有的甾體皂苷發(fā)揮主要效用外，還可能與黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

6 結(jié)論

通過單因素試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定滇黃精皂苷天然飲料的最佳配方：滇黃精皂苷提取液36%，竹葉黃酮30%，甜菊糖苷0.04%，蜂蜜0.5%。配制的滇黃精皂苷天然飲料呈淡茶色，有光澤，入口甘甜，口感適宜、清爽細(xì)膩，有竹葉黃酮、皂苷自然風(fēng)味，其中可溶性固形物含量為0.8%，pH為5.43，總皂苷含量為1.75 mg/100 mL，飲料對DPPH自由基清除率達(dá)到59.81%，具有良好的抗氧化性，是一種含天然風(fēng)味劑的低糖、營養(yǎng)型飲料，具有可觀的發(fā)展前景。