楊靜遠(yuǎn) 李永鑫 張新★

截止2022 年11 月，由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引發(fā)的新冠疫情已導(dǎo)致全球超過6.28 億人確診，650 萬人死亡［1］。目前世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）已經(jīng)公布了5 種關(guān)切變異株（variants of concern，VOCs），分別是B.1.1.7（Alpha）、B.1.351（Beta）、P.1（Gamma）、B.1.6.7.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）［2］。由于SARS-CoV-2屬于RNA 病毒，無互補(bǔ)鏈進(jìn)行矯正，因此十分容易發(fā)生突變［3］。當(dāng)突變出現(xiàn)在棘突（spoke，S）蛋白受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）中，使得變異株對宿主細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的親和力增加，從而大大提高了病毒的感染能力［4］。鑒于SARS-CoV-2 變異株有著快速的突變頻率和超強(qiáng)的傳播能力，實現(xiàn)變異株的實時監(jiān)測對公共衛(wèi)生預(yù)防十分必要。本文主要圍繞當(dāng)前對SARSCoV-2 變異株分子診斷的方法及其基本原理和在SARS-CoV-2 變異株檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，探討快速、高效監(jiān)測病毒突變的技術(shù)手段。

1 核酸擴(kuò)增技術(shù)

1.1 實時熒光PCR

實時熒光PCR 檢測是確診新型冠狀病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，但是常規(guī)的實時熒光PCR 很難準(zhǔn)確地鑒別變異株。目前一些研究者在PCR 基礎(chǔ)上進(jìn)行變異株檢測，下面主要介紹常見的幾種檢測SARS-CoV-2 變異株的PCR 方法。

1.1.1 基于分子信標(biāo)探針的實時熒光PCR

分子信標(biāo)（molecular beacon，MB）探針是一段形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列，當(dāng)探針與靶序列相連，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離后發(fā)出熒光，使得MB 探針對于點突變的識別有著非常高的特異性。Hadjinicolaou 等［6］通過使用特異識別基因突變位點的MB 探針，對25 例樣本進(jìn)行變異株的檢測，結(jié)果表明，MB 探針表現(xiàn)出超高的靶向檢測能力和特異性。Chrysostomou 等［7］通過MB 探針方法檢測了534 例核酸樣本，經(jīng)測序驗證該方法具有100%的靈敏度和特異性，表明MB 探針可以準(zhǔn)確地檢測已知變異株。當(dāng)出現(xiàn)新的變異株時，需要重新設(shè)計MB 探針，因此，該方法在檢測未知變異株方面還存在一定的局限性。

1.1.2 基于熔解曲線的實時熒光PCR

熔解曲線是完成擴(kuò)增反應(yīng)后逐漸增加溫度，熒光信號隨溫度變化而形成的曲線。由于不同核酸分子的長度以及GC 含量不同，在加熱變性時就會有自己的熔解曲線以及特征峰，通過特征峰就能判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。Barua 等［8］應(yīng)用高分辨率熔融曲線技術(shù)鑒定Delta 變異株，試驗中Delta陽性樣本的熔解溫度（melting temperature，Tm）為56.1℃，而非Delta 的Tm 低于52.5℃。因此，Delta與非Delta 的Tm 存在明顯差異，可以對Delta 變異株進(jìn)行區(qū)分。Sit 等［9］評估了TIB MOLBIOL 熔融曲線法對S371L/S373P 和E484A 兩個突變位點的檢測性能，研究顯示，該方法對以上兩個突變位點檢測的靈敏度分別為100%和96.6%，特異性均為100%?；谌劢馇€的實時熒光PCR 可以檢測出單個堿基的差異，并且不受檢測位點的局限。但熔解曲線易受到擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，當(dāng)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物時，熔解曲線便會出現(xiàn)雜峰而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.1.3 基于小溝結(jié)合物探針的實時熒光PCR

小溝結(jié)合物（minor groove binder，MGB）是一種化學(xué)基團(tuán)，在常用的TaqMan 探針的3'端插入一個MGB，它能夠選擇性地結(jié)合到DNA 螺旋結(jié)構(gòu)中的淺溝，可以增加TaqMan 探針的Tm 值，提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，從而可以有效鑒別點突變。Chan等［10］利用MGB 探針特異檢測168 例SARS-CoV-2陽性樣本，正確鑒定了34 份樣本為N501Y 型突變，其中20 例為B.1.1.7，12 例為B.1.351 以及2 例P.3，其余134 份樣本為野生型，該方法的靈敏度和特異性均達(dá)到100%。雖然MGB 探針對于點突變檢測有著良好的靈敏度和特異性，但是其與MB 探針方法存在共同的局限性，即當(dāng)出現(xiàn)新的變異株時，需要重新設(shè)計探針。

1.1.4 等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)

等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)（allele-specific PCR，AS-PCR）又稱擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)，是指在擴(kuò)增過程中只有當(dāng)引物3`末端的堿基與SNP 位點的等位基因互補(bǔ)配對時，才能正常延伸擴(kuò)增，由此對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光PCR 檢測，則可確定突變點位的基因型。Brito-Mutunayagam 等［11］使用AS-PCR體系檢測Delta、Alpha 和Beta 的靈敏度分別為99.45%、100%和66.67%，檢測三種VOC 的特異性均為100%，并且AS-PCR 檢測結(jié)果要比全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）快1.3 天。Wang 等［12］利用AS-PCR 對SARS-CoV-2 變異株D614G 和N501Y 的兩個突變核酸片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，結(jié)果提示AS-PCR 對于突變檢測有較好的靈敏度和特異性。AS-PCR 是一種簡單、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的檢測方法，但是與常規(guī)實時熒光PCR 比較，其擴(kuò)增效率較低，且需要開蓋進(jìn)行產(chǎn)物分析，易造成實驗室污染。

1.1.5 其他基于實時熒光PCR 檢測平臺

自疫情爆發(fā)以來，實時熒光PCR 聯(lián)合其他實驗室診斷技術(shù)而開發(fā)的檢測平臺已用于SARSCoV-2 變異株檢測。Gomez-Martinez 等［13］利用側(cè)流免疫層析法與PCR 中的擴(kuò)增子形成復(fù)合物后進(jìn)而產(chǎn)生特異的顯色條帶來檢測變異株。該試驗選取了9 例SARS-CoV-2 陽性患者的樣本，結(jié)果均產(chǎn)生了明顯和特定的條帶信號，同時驗證其與實時熒光PCR 符合率為100%。Hernandez 等［14］借助實時熒光PCR/MALDI-TOF-MS 檢測平臺對60 例SARS-CoV-2 陽性患者的唾液標(biāo)本進(jìn)行檢測，靈敏度和特異性分為97.14%和100%。綜合檢測平臺在當(dāng)前變異株檢測中能夠節(jié)約大量的成本，適合區(qū)域內(nèi)大面積篩選。但是這類方法均需將樣本直接暴露在實驗室當(dāng)中，加大了實驗室污染的風(fēng)險。

1.2 等溫擴(kuò)增技術(shù)

等溫擴(kuò)增技術(shù)能在恒定的溫度下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增，與實時熒光PCR 相比，等溫擴(kuò)增技術(shù)操作流程更加簡單。等溫擴(kuò)增技術(shù)包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（transcription-mediated amplification，TMA）、缺口酶輔助反應(yīng)（nicking enzyme-assisted reaction，NEAR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）以及規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）等 技術(shù)［15］，本文介紹三種用于SARS-CoV-2 變異株檢測的重要技術(shù)。

1.2.1 LAMP 技術(shù)

LAMP 技術(shù)通常使用4～6 對引物，在目的基因上鑒定出6～8 個特定區(qū)域，在恒溫條件下可以實現(xiàn)高效擴(kuò)增。LAMP 擴(kuò)增主要使用內(nèi)引物和外引物，環(huán)引物的加入大大提高了反應(yīng)速率。Yang 等［16］利用LAMP 技術(shù)對84 例Delta 變異株鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測，該方法靈敏度和特異性均為100%。Iijima 等［17］利用LAMP 技術(shù)對18 例核酸樣本（包含5 種呼吸道病毒和4 種呼吸道細(xì)菌）進(jìn)行Delta 的篩選，結(jié)果表明，使用該方法僅檢測到Delta，所得結(jié)果與預(yù)期一致。因此，LAMP 技術(shù)對于檢測SARS-CoV-2 變異株能夠展現(xiàn)出較好的特異性。盡管LAMP 反應(yīng)體系復(fù)雜，但操作簡單且靈敏度、特異性高，在常規(guī)核酸實驗室就能夠便捷地對SARS-CoV-2 變異株進(jìn)行檢測。

1.2.2 CRISPR 技術(shù)

CRISPR 技術(shù)是利用CRISPR RNA 特異性結(jié)合靶序列，激活Cas 酶進(jìn)行序列特異性切割，從而實現(xiàn)靶序列核酸的突變檢測。Fasching 等［18］利用CRISPR-Cas12 系統(tǒng)對261 例SARS-CoV-2 陽性樣本進(jìn)行點突變識別，同時與WGS 作為對比。結(jié)果顯示，該方法與WGS 有著98.9%的譜系分類一致性，表明CRISPR-Cas12 系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確識別SARSCoV-2 變異株。Liang 等［19］利用CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)對32 例SARS-CoV-2 陽性樣本進(jìn)行點突變檢測，檢測結(jié)果與基因測序的一致性達(dá)到了100%。CRISPR-Cas 系統(tǒng)對于基因點突變的識別有著較高的靈敏度和特異性，但CRISPR-Cas 存在脫靶性現(xiàn)象，且反應(yīng)體系中會有Cas 酶的殘留干擾，因此限制了該技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。

1.2.3 RPA 技術(shù)

RPA 技術(shù)也稱為重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)，是一種利用重組酶、DNA 聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)，原則上只需要一對引物，恒溫下30 分鐘內(nèi)即可提供擴(kuò)增結(jié)果。Li 等［20］在恒溫42℃下，25 分鐘內(nèi)對80 例SARSCoV-2 陽性樣本檢測，結(jié)果靶向性和特異性分別為98%和100%。雖然RPA 不需要復(fù)雜的引物，且有著快速、簡便的操作流程，但是RPA 的反應(yīng)體系需要多種酶的參與，與LAMP 技術(shù)相比體系更復(fù)雜，難以在實際工作中得到應(yīng)用。

2 基因測序技術(shù)

基因測序技術(shù)是檢測SARS-CoV-2 變異株的金標(biāo)準(zhǔn)［15］。測序技術(shù)根據(jù)發(fā)展歷程可分為一代測序、二代測序和三代測序，第一代測序技術(shù)以Sanger 法為基礎(chǔ)，第二代測序技術(shù)以高通量為特點，第三代測序技術(shù)以納米孔基因測序技術(shù)為主［21］，以上三種技術(shù)均可用于SARS-CoV-2 的變異株檢測。

2.1 Sanger 測序技術(shù)

Sanger 測序是針對含有突變位點的基因序列設(shè)計引物，隨即進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后測序。目前已知SARS-CoV-2 主要突變位點集中在S 蛋白的RBD區(qū)域，因此擴(kuò)增子中需確保含有RBD 的重要突變。Ko 等［22］對709 例樣本進(jìn)行了突變篩查，測序結(jié)果顯示有48 例樣本具有特異性突變，其中檢測出了單突變、雙突變以及三突變，表明Sanger測序適用于SARS-CoV-2 變異株的篩選。Bloemen 等［23］利用Sanger 測序快速檢測變異株S 蛋白的突變，結(jié)果顯示該技術(shù)可以區(qū)分現(xiàn)有的VOC。同時該研究將Sanger 測序同WGS 比較，Sanger 測序的檢測周期更短。Sanger 測序具有成本低、周期短的特點，可用于大規(guī)模篩查已出現(xiàn)的變異株。但是Sanger 技術(shù)在獲取新的變異株全基因組序列數(shù)據(jù)時，測序周期過長，操作流程繁瑣。

2.2 高通量測序技術(shù)

高通量測序又稱“下一代”測序（next-generation sequencing，NGS），能一次性對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，目前常用于SARSCoV-2 的全基因組測序，可以為病毒進(jìn)化和突變提供重要的依據(jù)。Coolen 等［24］利用反向補(bǔ)體聚合酶鏈反應(yīng)可以在單次PCR 中構(gòu)建一個Illumina 基因文庫，縮短了NGS 技術(shù)文庫構(gòu)建的流程，為SARSCoV-2 變異株檢測節(jié)省了時間和資源。Nasereddin等［25］從SARS-CoV-2 陽性樣本的RNA 中擴(kuò)增出長度為341 bp 的S 基因片段，用NGS 技術(shù)對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，與WGS 局部變異鑒定對比后其符合率為94.1%。高通量測序不僅能夠完成病毒的全基因組測序，還能夠通過擴(kuò)增子進(jìn)行高效率測序。但NGS 需要昂貴的設(shè)備和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，從而限制了其在臨床應(yīng)用中的推廣。

2.3 納米孔基因測序技術(shù)

納米孔基因測序（nanopore sequencing）技術(shù)也被稱為第三代基因測序，利用檢測DNA 堿基通過納米孔時所產(chǎn)生的特征阻塞電流從而得到核酸的序列信息。Yakovleva 等［26］對收集的103例SARS-CoV-2 基因組進(jìn)行了局部測序，鑒定出100 例Delta 和3 例Alpha，并分析確定了與這兩種VOC 相關(guān)的所有氨基酸突變。Wang 等［27］利用該測序技術(shù)在6～10 小時得到了SARS-CoV-2 準(zhǔn)確的核酸序列，為SARS-CoV-2 的相關(guān)毒力基因在病毒傳播過程中是否發(fā)生了突變提供了有力的證據(jù)。雖然第三代測序技術(shù)具有速度快、精度高的優(yōu)勢，但是由于技術(shù)門檻高，使其很難得到普遍應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

本文所述的分子診斷技術(shù)都能在一定程度上起到監(jiān)測SARS-CoV-2 變異株的作用，目前基因測序技術(shù)作為檢測SARS-CoV-2 變異株的金標(biāo)準(zhǔn)，但卻因儀器設(shè)備昂貴，操作專業(yè)難度較高，檢測周期長等缺點限制了其廣泛應(yīng)用。對于SARS-CoV-2變異株檢測新方法的探索旨在開發(fā)一種操作簡單，并且應(yīng)對單堿基突變有較高靈敏度的檢測技術(shù)，解決RNA 病毒變異頻率較高，變異株較多的問題，同時滿足臨床大規(guī)模的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，如何精準(zhǔn)、快速的將其與其他呼吸道病毒進(jìn)行區(qū)分檢測，也是現(xiàn)行檢測技術(shù)開發(fā)的方向。隨著新型分子診斷技術(shù)的發(fā)展，多技術(shù)聯(lián)合檢測的方法學(xué)創(chuàng)新以及多學(xué)科技術(shù)交叉應(yīng)用，必定能夠?qū)崿F(xiàn)冠狀病毒以及其他病原體更加快速、精準(zhǔn)、便捷的檢測。