朱國(guó)良，張曉嵐，崔戈

腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量改進(jìn)方法研究

朱國(guó)良，張曉嵐，崔戈

湖州市第一人民醫(yī)院病理科，浙江湖州 313000

提高腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率。選取2021年9月至12月湖州市第一人民醫(yī)院28例臨床患者腎穿刺組織，通過改進(jìn)腎穿刺樣本冷凍取材、包埋及切片等系列方法，提高腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率。改進(jìn)法腎小球切出率（100%）顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（82.14%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=5.490，=0.026）；改進(jìn)法冷凍切片優(yōu)良率（96.43%）顯著高于傳統(tǒng)法冷凍切片優(yōu)良率（71.43%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=8.347，=0.004）。通過改進(jìn)方法，提高了腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率，有臨床推廣的應(yīng)用價(jià)值。

腎穿刺樣本；冷凍切片；改進(jìn)方法

腎穿刺樣本獲取困難、彌足珍貴，其結(jié)構(gòu)的完整性直接影響其病理診斷。傳統(tǒng)腎穿刺冷凍切片技術(shù)難以保證每次截取的組織能夠切出腎小球，有時(shí)需要多次重取組織。此外，包埋方式、溫度和時(shí)間的控制對(duì)于保證切片質(zhì)量非常關(guān)鍵[1-5]。本研究通過對(duì)組織預(yù)處理及對(duì)樣本頭預(yù)準(zhǔn)備等一系列工作環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，較大程度地保證了腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取湖州市第一人民醫(yī)院2021年9月至12月的28例臨床患者腎穿刺組織，穿刺空心針型號(hào)為16G，外徑3mm，每例患者包含2～3條長(zhǎng)度為1.0～2.0cm的穿刺組織，選兩條組織，各取長(zhǎng)約0.5cm用于免疫熒光檢查的冷凍制片，分為改進(jìn)組和傳統(tǒng)組，兩組樣本分別應(yīng)用改進(jìn)方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行冷凍制片。本研究通過湖州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研與臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審查（倫理審批號(hào)：2022121401）。

1.2 方法

1.2.1 組織截取 傳統(tǒng)組：選擇其中的一條腎穿刺組織，用切片刀由組織的一端切取0.2cm做電鏡，再切取0.5cm左右做冷凍切片，其余組織做常規(guī)病理。改進(jìn)組：腎組織皮質(zhì)端顏色稍蒼白，髓質(zhì)端顏色稍紅。分割組織時(shí)先借助手機(jī)攝像頭的放大功能區(qū)分皮質(zhì)端和髓質(zhì)端，再用切片刀將組織由皮質(zhì)端切取0.2cm做電鏡，然后切取0.5cm左右做冷凍制片，其余組織做常規(guī)病理[6]。

1.2.2 樣本頭準(zhǔn)備 傳統(tǒng)組：冷凍切片機(jī)箱體溫度設(shè)定為–21℃，將膠水滴加于樣本托上，待膠水半凝固后放樣本。改進(jìn)組：冷凍切片機(jī)（徠卡1950）箱體溫度設(shè)定為–17℃。在樣本托上滴加適量膠水，使其成橢圓形后置于冷凍切片機(jī)速凍臺(tái)上，待其冷卻凝固，將樣本頭移至切片機(jī)機(jī)頭上，使膠水的長(zhǎng)軸與刀口垂直，然后對(duì)膠水進(jìn)行第1次粗修，使膠水成為平整的平臺(tái)。

1.2.3 腎穿刺組織包埋 傳統(tǒng)組：將1段長(zhǎng)0.5cm的腎穿刺組織包埋于半凝固狀態(tài)的膠水中，盡量平放，隨即迅速轉(zhuǎn)移至速凍臺(tái)使其凝固（圖1A）。改進(jìn)組：取下樣本托迅速將0.5cm的組織平放在已粗修平整的膠水平臺(tái)表面，使組織的長(zhǎng)軸與膠水平臺(tái)的長(zhǎng)軸垂直，再用膠水完整覆蓋組織，并沿膠水平臺(tái)的長(zhǎng)軸方向在組織上下兩邊適當(dāng)添加膠水，隨即迅速轉(zhuǎn)移至速凍臺(tái)使其凝固（圖1B）。

1.2.4 冷凍切片操作 傳統(tǒng)組：膠水凝固后將樣本托固定于機(jī)頭上，調(diào)節(jié)刀片與樣本托的距離，緩慢粗修，觀察穿刺組織的暴露情況。細(xì)修出組織后試染1張，顯微鏡下觀察腎小球的情況。按本研究要求完成所需切片數(shù)，最后1張進(jìn)行冷凍HE染色，對(duì)比起始切片中腎小球的數(shù)量及分布情況，確定熒光染色片的選擇順序。改進(jìn)組：將樣本托移至機(jī)頭，保持與粗修時(shí)角度一致，鎖緊并調(diào)節(jié)刀片與樣本托的前后距離，到位后二次粗修。觀察兩次膠水間的落差控制粗修進(jìn)度，修出組織完整切面后試染一張于顯微鏡下觀察腎小球。按照本科室免疫熒光檢測(cè)要求，連續(xù)切片，最后1張進(jìn)行冷凍HE染色以對(duì)比切片質(zhì)量，分析起始切片中腎小球數(shù)量及分布情況，確定熒光染色片的選擇順序。

1.2.5 顯微鏡下觀察切片質(zhì)量 兩組切片同時(shí)進(jìn)行HE染色后顯微鏡下觀察，并記錄切片質(zhì)量。評(píng)價(jià)方法參照《簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)》[7]：切片完整、薄、厚薄均勻；細(xì)胞無收縮退變；組織無卷曲、折疊；組織有無碎裂、褶皺。以截取一次組織能成功切出腎小球的例數(shù)占總例數(shù)的比率作為腎小球切出率。以細(xì)胞無收縮，組織無卷曲、折疊、碎裂的切片數(shù)占總片數(shù)的比率作為切片優(yōu)良率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[（%）]表示，組間比較采用2檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

切片質(zhì)量：傳統(tǒng)法組織碎裂、卷曲、與包埋劑分離，有膠水空洞；改進(jìn)法組織平整、與包埋劑完全融合，無膠水空洞，見圖2。

染色后鏡下觀察：傳統(tǒng)法組織碎裂、結(jié)構(gòu)不完整、折疊，染色尚清晰；改進(jìn)法組織結(jié)構(gòu)完整、無折疊，染色清晰，見圖3。

改進(jìn)法腎小球切出率為100%，傳統(tǒng)法腎小球切出率為82.14%；改進(jìn)法切片優(yōu)良率為96.43%，傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率為71.43%。改進(jìn)法的腎小球切出率顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（2=5.490，=0.026）；改進(jìn)法的切片優(yōu)良率顯著高于傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率（2=8.347，=0.004）。

3 討論

腎穿刺樣本冷凍切片的質(zhì)量直接關(guān)系到免疫熒光染色結(jié)果的優(yōu)劣。腎穿刺樣本一般直徑較小，條數(shù)較少，但需要的冷凍切片數(shù)量卻很多（15～18片），制作出高質(zhì)量的冷凍切片具有較大難度。穿刺樣本冷凍制片過程中經(jīng)常出現(xiàn)以下問題：切片上腎小球不足或無腎小球；切片上組織斷續(xù)不成條、不完整；切片上組織出現(xiàn)空洞；切片上組織卷曲、折疊；組織發(fā)脆，切片呈碎裂狀及無法完整制片等。產(chǎn)生上述問題的原因與穿刺樣本運(yùn)送流程、組織冷凍溫度、冷凍持續(xù)時(shí)間及制片技巧等有關(guān)[8-14]。

圖1 傳統(tǒng)法與改進(jìn)法腎穿刺組織的包埋方式

A.傳統(tǒng)組；B.改進(jìn)組

圖2 傳統(tǒng)法與改進(jìn)法腎穿刺組織的切片質(zhì)量

A.傳統(tǒng)組；B.改進(jìn)組

圖3 傳統(tǒng)法與改進(jìn)法腎穿刺組織的染色質(zhì)量（HE染色，×20）

A.傳統(tǒng)組；B.改進(jìn)組

湖州市第一人民醫(yī)院采用獲取樣本后立即用生理鹽水濕潤(rùn)的紗布包裹，并放入保溫冷藏箱中半小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至病理科，技術(shù)員接收樣本后，采用改進(jìn)法分三步制片，有效保障切片上有腎小球及切片質(zhì)量。

傳統(tǒng)法未有效區(qū)分腎組織皮質(zhì)和髓質(zhì)，經(jīng)常需要二次取組織再切片，不僅造成組織浪費(fèi)，也增加了制片成本。本研究改進(jìn)了組織截取方法，先借助手機(jī)攝像頭的放大功能區(qū)分皮質(zhì)和髓質(zhì)，再用切片刀從皮質(zhì)端截取組織做冷凍切片，提高了腎小球切出率。

由于腎穿刺樣本送檢時(shí)需用含生理鹽水的紗布包裹，組織表面會(huì)吸附較多水分，傳統(tǒng)法沒有將組織表面吸附的多余水分清除，冷凍后導(dǎo)致組織變硬、變脆，組織容易與包埋劑分離，切片碎裂。此外，還需預(yù)切15～18 張冷凍切片備用，切片過程耗時(shí)長(zhǎng)，且冷凍溫度過低（–22～–20℃），長(zhǎng)時(shí)間冷凍組織易變硬、變脆，也會(huì)造成切片出現(xiàn)碎裂狀的現(xiàn)象[15]。本研究改進(jìn)了腎穿刺樣本的前處理過程，通過冷凍前采用吸水棉紙吸取腎組織表面多余水分，使包埋劑與組織充分結(jié)合，可簡(jiǎn)便有效地解決組織與包埋劑分離的現(xiàn)象。此外，根據(jù)腎組織的特點(diǎn)將箱體及樣本夾溫度控制在–17℃[16]，能夠改善長(zhǎng)時(shí)間冷凍后切片易碎裂的現(xiàn)象，較順利的完成連續(xù)多張高質(zhì)量的切片。

冷凍穿刺組織的傳統(tǒng)法包埋沒有平整的支撐平臺(tái)，組織很難包在同一水平面，造成切片不完整及修切時(shí)組織損失過多[16-20]。本研究改進(jìn)了腎穿刺樣本的包埋方式，預(yù)先準(zhǔn)備包埋平臺(tái)，再將組織平放在已修平的包埋劑平臺(tái)上，并按組織長(zhǎng)軸與刀口平行的方向擺放，再加包埋劑包裹組織，從而能同時(shí)、完整的切到整條組織。

綜上所述，對(duì)比兩種腎穿刺樣本冰凍制片方法，改進(jìn)法的腎小球切出率為100%，顯著高于傳統(tǒng)法腎小球切出率（82.14%）；改進(jìn)法切片優(yōu)良率為96.43%，顯著高于傳統(tǒng)法切片優(yōu)良率（71.43%）。通過改進(jìn)方法，提高了腎穿刺樣本冷凍切片腎小球切出率及切片優(yōu)良率，對(duì)臨床應(yīng)用有較大的指導(dǎo)意義，具有一定的推廣價(jià)值。

[1] 林潔, 周國(guó)永, 巫雁丹, 等. 超聲經(jīng)皮腎穿刺活檢診斷腎臟疾病的臨床研究[J]. 深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2021, 31(14): 2.

[2] 范偉博. 超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮腎穿刺活檢的腎病診斷價(jià)值和安全性[J]. 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療, 2019, 25(2): 4.

[3] 劉樹軍, 苗里寧, 羅萍. 6170例腎穿刺活檢病理分析[C]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腎臟疾病專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì), 2018.

[4] 梁春紅. 538例腫瘤冰凍切片的臨床診斷分析[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué), 2011, 17(2): 38.

[5] 鄒萬忠. 腎活檢病理診斷標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意見[J]. 中華腎臟病雜志, 2001, 17(4): 270–275.

[6] 朱小蘭, 張威, 駱新蘭, 等. 不同固定劑對(duì)腎穿刺冷凍切片免疫熒光染色的影響[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2013, 20(7): 441–443.

[7] 丁偉, 王德田. 簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)[M]. 杭州: 浙江科學(xué)技術(shù)出版社, 2014: 2.

[8] 吳杉杉, 徐偉銘. 冷凍切片與“冷對(duì)”石蠟切片技術(shù)常見問題與對(duì)策[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2021, 4: 489–490.

[9] 丁海. 術(shù)中病理冰凍切片特殊組織的制片技巧及應(yīng)用[J].中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 3: 371–372.

[10] 張芬芬, 何香紅, 梁英杰, 等. 利用品管圈的PDCA管理模式提高術(shù)中冷凍制片質(zhì)量[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2022, 3: 373–374.

[11] 王麗, 董巖, 陳蕓. 冷凍切片流程中的常見問題及優(yōu)化措施[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2022, 4: 490–491.

[12] 范玲麗. 制作術(shù)中優(yōu)質(zhì)冰凍切片的方法及技巧[J]. 診斷病理學(xué)雜志, 2022, 4: 370–371.

[13] 吳賽青, 程平, 等. 腎穿刺組織冷凍切片常見問題及對(duì)策[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2018, 34(5): 576–577.

[14] 趙穎萍. 冰凍切片質(zhì)量控制對(duì)病理診斷準(zhǔn)確性的作用[J].健康大視野 2020, 10: 263–265.

[15] 郭巖, 孔佑華, 王鳳琴. 用于免疫熒光染色的大鼠視網(wǎng)膜冰凍切片的制作體會(huì)[J]. 沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 16(3): 162–163.

[16] 朱長(zhǎng)樂, 高麗麗, 司海鵬, 等. 腎穿刺活檢組織切片制備技術(shù)的改進(jìn)[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014, 30(11): 1302–1304.

[17] 王大鵬. 快速免疫組化技術(shù)檢測(cè)在前列腺穿刺組織冰凍切片診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 首都食品與醫(yī)藥, 2019, 18: 27.

[18] 樸虎雄, 葛哲虎, 李京旭, 等. 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)及冰凍活組織檢查在腮腺腫瘤診斷中的意義[J]. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 1: 53–55.

[19] 中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì). 中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第一屆全國(guó)介入超聲及腫瘤消融學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C]. 中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì), 2011: 1.

[20] 羅燦嶠, 莫木瓊, 聶釗銘, 等. 穿刺活檢組織常規(guī)石蠟和常規(guī)冰凍HE制片的比較[J]. 山東醫(yī)藥, 2014, 41: 22–24.

Study of quality improvement of frozen sections of renal puncture samples

Department of Pathology, the First People’s Hospital of Huzhou, Huzhou 313000, Zhejiang, China

To improve the glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples.Kidney puncture tissues of 28 clinical patients in the First People’s Hospital of Huzhou from September to December 2021 were selected.By improving the methods of freezing, embedding and sectioning of renal puncture samples, the glomerular detection rate and the excellent rate of sectioning were improved.The glomerular detection rate of the improved method (100%) was significantly higher than that of the traditional method (82.14%) (2=5.490,=0.026); The excellent rate of the improved method (96.43%) was significantly higher than that of the traditional method (71.43%) (2=8.347,=0.004).By improving the method, glomerular detection rate and the excellent rate of frozen sections of renal puncture samples were increased, and has the value of clinical application.

Renal puncture samples; Frozen section; Improvement method

R365

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.002

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y202043861）；湖州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020GYB13）

崔戈，電子信箱：witcui@qq.com

（2022–08–08）

（2022–12–28）