楊 軍 隋承光 李 妍 孟凡東

【提 要】 目的 探討微小RNA(miRNA-629-3p)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其相關(guān)臨床意義。方法 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)方法分析,獲得在頭頸部腫瘤中表達(dá)的微小RNA,選取高表達(dá)的miR-629-3p;K-M plot觀察miR-629-3p對(duì)患者生存的影響;TIMER2.0分析與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性;Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)采用水平。結(jié)果 miRNA-629-3p在頭頸部腫瘤患者中高表達(dá); miR-629-3p作為預(yù)測(cè)生存預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)具有較高的敏感度和特異度;免疫浸潤(rùn)分析得出,T、B及NK細(xì)胞參與了頭頸部腫瘤的浸潤(rùn),且與miR-629-3p的表達(dá)具有明顯的相關(guān)性;沉默miRNA-629-3p后,Wnt、β-catenin和Survivin的表達(dá)水平明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論 頭頸部腫瘤患者的miRNA-629-3p表達(dá)水平上調(diào),可能在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到重要作用,有望成為評(píng)估頭頸部腫瘤患者病情的有效指標(biāo)。

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous-cell carcinoma,HNSC)是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康,主要累及頭頸部不同的組織和器官[1]。HNSC的臨床治療方案主要根據(jù)腫瘤的TNM分期制定。綜合治療以手術(shù)、放療、化療[2]及免疫治療為主[3]。HNSC的治療雖然取得了一定進(jìn)展,但5年生存率并沒(méi)有顯著提高[4]。因此,早期診斷、準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估和進(jìn)一步的有效治療是非常必要的。為改善疾病預(yù)后,全面了解腫瘤的發(fā)病機(jī)制,及時(shí)尋找可靠的腫瘤標(biāo)志物提高HNSC患者的治療效果,制定有效的治療方案具有重要的臨床意義。

微小RNA(microRNA,miR)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA,其數(shù)量?jī)H占整個(gè)基因組的l%,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miR-629-3p是一種促癌因子,已經(jīng)被報(bào)道參與乳腺癌、肺腺癌和喉癌等惡性發(fā)展過(guò)程[5-6]。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-629-3p能夠被環(huán)狀DNAcircNRIP1海綿吸附,通過(guò)PTP4A1/ERK1/2信號(hào)通路影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲[7]。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-629-3p在膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理的U251細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)。

隨著對(duì)microRNA研究的不斷深入,實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示其在細(xì)胞的發(fā)育、分化、遷移、凋亡等方面均發(fā)揮重要作用。目前尚無(wú)miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的相關(guān)研究,為此,本研究通過(guò)生信分析頭頸部腫瘤患者組織中miR-629-3p的表達(dá)情況及相關(guān)臨床意義,為進(jìn)一步研發(fā)臨床治療方案提供一定的參考依據(jù)。

資料與方法

1.資料獲取

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站The Cancer Genome Atlas(TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù),篩選頭頸部腫瘤中高表達(dá)的microRNA,獲取患者的相關(guān)臨床資料,通過(guò)K-M plot對(duì)頭頸部腫瘤患者進(jìn)行生存分析,GSEA(http://www.gsea-msigdb.org/)進(jìn)行聚類(lèi)分析,TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲得免疫浸潤(rùn)的相關(guān)信息,Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與microRNA表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。

2.材料

喉癌細(xì)胞株(TU212)購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。所用試劑:DMEM培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),PBS緩沖液(普諾賽)。Wnt抗體(abcam),Survivin抗體(abcam),E-cadherin抗體(abcam),β-catenin抗體(abcam),山羊抗兔二抗(abcam)等。

3.細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇的TU212細(xì)胞加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔3天更換一次新鮮的培養(yǎng)液。

4.miR-629-3p瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TU212細(xì)胞,PBS洗1次,胰酶消化,制成細(xì)胞懸液接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60%時(shí)更換為無(wú)雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),使用 miR-629-3p inhibitor干擾內(nèi)源性miR-629-3p的表達(dá),inhibitor NC作為陰性對(duì)照組,每孔的轉(zhuǎn)染量為50pmoi,48h后提取總蛋白,用于后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)。

5.Western blot法

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取TU212細(xì)胞的總蛋白,電泳(上膠85v,下膠125v),轉(zhuǎn)膜(90mA,90min),洗膜,5% BSA封閉1h,一抗4℃過(guò)夜孵育,洗膜,二抗室溫?fù)u床孵育1h,洗膜,發(fā)光。Image J軟件分析灰度值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0中的單因素方差分析,比較各組之間的差異。R包:主要采用ggplot2用于相關(guān)臨床數(shù)據(jù)分析,及可視化分析;survival包用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析;pROC包用于繪制ROC曲線。P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.microRNA的篩選

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選頭頸部腫瘤中高表達(dá)的microRNA,設(shè)定條件:P<0.01,∣lgFC∣≥2,獲得結(jié)果為:miR-629-3p在頭頸部腫瘤中高表達(dá)(圖1)。

圖1 差異表達(dá)的火山圖

2.miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的表達(dá)

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-629-3p在頭頸部腫瘤組織中高表達(dá),與正常組織相比(P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2,A:配對(duì)樣本的差異分析;B:非配對(duì)樣本的差異分析)。

圖2 miR-629-3p的表達(dá)水平

3.miR-629-3p對(duì)頭頸部腫瘤的生存影響

miR-629-3p對(duì)頭頸部腫瘤患者生存的影響通過(guò)K-M plot數(shù)據(jù)庫(kù)得出,Nomogram列線圖顯示,5年的生存概率明顯低于1年和3年的生存概率;ROC曲線圖結(jié)果提示miR-629-3p對(duì)于生存率的預(yù)測(cè)具有一定的準(zhǔn)確性(圖3,A:預(yù)后列線圖;B:ROC曲線)。

圖3 miR-629-3p對(duì)生存的影響

4.miR-629-3p的臨床意義及與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得頭頸部腫瘤患者的相關(guān)臨床資料,通過(guò)分析miR-629-3p與臨床患者TNM分期的相關(guān)性,得出miR-629-3p與頭頸部腫瘤患者的M期具有顯著的相關(guān)性(P=0.03),與N分期有一定的相關(guān)性(P=0.05),與T分期及年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)(圖4A)。

圖4 miR-629-3p的臨床意義

免疫細(xì)胞在很大程度上參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn),TIMER2.0得出如圖4B所示結(jié)果,頭頸部腫瘤中miR-629-3p的表達(dá)與T細(xì)胞、B細(xì)胞呈明顯的正相關(guān),與NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),得出T、B及NK細(xì)胞的表達(dá)會(huì)影響頭頸部腫瘤患者miR-629-3p的浸潤(rùn)水平。

利用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-629-3p可能參與的信號(hào)通路,分析預(yù)測(cè)結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn),確定miR-629-3p參與Wnt信號(hào)通路的作用,進(jìn)一步分析Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(圖4C)。

5. miR-629-3p參與信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,沉默TU212細(xì)胞中miR-629-3p的表達(dá),觀察Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的水平變化,結(jié)果顯示W(wǎng)nt、β-cantenin和Survivin的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組的水平(NC組),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而E-cadherin的表達(dá)水平與對(duì)照組相比,明顯升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 蛋白表達(dá)水平

討 論

成熟的microRNA通過(guò)與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體,發(fā)揮其調(diào)控作用。某一種microRNA可以靶向調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),某種基因的表達(dá)也可能受到多種microRNA的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),人類(lèi)大約60%的基因都受到microRNA表達(dá)的調(diào)控。microRNA主要通過(guò)對(duì)靶基因的降解或抑制其翻譯來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明,microRNA在調(diào)節(jié)生物體生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝及凋亡等各個(gè)方面均發(fā)揮重要作用[9-10]。microRNAs通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則,與特定mRNA的3′端非編碼區(qū)(3′UTR)的microRNA調(diào)控元件相結(jié)合,從而對(duì)靶基因進(jìn)行識(shí)別。

miR-629定位于15q23,研究表明,miR-629可與相應(yīng)靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合,從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程,各類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與它們的表達(dá)失調(diào)密切相關(guān)[11]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),miR-629-3p可促進(jìn)肺癌和乳腺癌的病程進(jìn)展[12-13]。miR-629-3p可以通過(guò)調(diào)節(jié)PTP4A1和ERK1/2信號(hào)通路中相關(guān)因子的表達(dá),抑制宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能[7]。miR-629-3p在人肺腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均上調(diào),miR-629-3p通過(guò)下調(diào)SFTPC的表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)肺腺癌的疾病進(jìn)展[12]。然而,關(guān)于miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用研究甚少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生信TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),得出miR-629-3p在頭頸部腫瘤組織中高表達(dá)。Nomogram列線圖顯示,5年的生存概率明顯低于1年和3年的生存概率,ROC曲線圖顯示,miR-629-3p對(duì)于生存率的預(yù)測(cè)具有一定的準(zhǔn)確性。推測(cè)miR-629-3p在頭頸部腫瘤有可能作為一種致癌因素起作用。通過(guò)分析miR-629-3p與臨床患者TNM分期的相關(guān)性,得出miR-629-3p與頭頸部腫瘤患者的N和M分期具有一定的相關(guān)性。

免疫細(xì)胞在很大程度上參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn),本實(shí)驗(yàn)頭頸部腫瘤中miR-629-3p的表達(dá)與T細(xì)胞、B細(xì)胞呈明顯正相關(guān),與NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),得出T、B及NK細(xì)胞的表達(dá)會(huì)影響頭頸部腫瘤患者miR-629-3p的浸潤(rùn)水平。利用生信Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析,確定miR-629-3p參與Wnt信號(hào)通路作用,從而進(jìn)一步檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。Wnt信號(hào)通路可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種干細(xì)胞的不同生物學(xué)功能。Wnt是一類(lèi)分泌型糖蛋白,Wnt信號(hào)途徑能引起胞內(nèi)β-catenin積累,對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和遷移起到一定的調(diào)節(jié)作用。β-catenin作為一種黏附分子在喉癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài),在基因的活化和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用,作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心元件,在胚胎發(fā)育階段通過(guò)介導(dǎo)Wnt信號(hào),促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,還可以作為細(xì)胞黏附蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)組分,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。E-cadherin蛋白主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附,其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)向相關(guān)。它的異常表達(dá)與腫瘤的形成、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Survivin在細(xì)胞中呈周期依賴(lài)性表達(dá),具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、參與細(xì)胞周期調(diào)控的雙重功能,可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性。

本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-629-3p在頭頸部腫瘤中的作用,通過(guò)Western blot法檢測(cè)沉默miR-629-3p后,Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示W(wǎng)nt、β-catenin和Survivin的表達(dá)水平明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高,進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-629-3p在喉癌細(xì)胞中作為一種致癌因子存在。miR-629-3p有可能作為評(píng)估頭頸部腫瘤患者病情及預(yù)后的指標(biāo),也為其靶向治療提供相關(guān)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。