趙可欣,耿自豪,伊進行,卓明洋,張春月,孫文超,馬倩

(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

氨基葡萄糖(glucosamine, 2-amino-2-deoxy-D-glucose, GlcN),又稱氨基葡糖、葡萄糖胺或葡糖胺,是一種重要的功能單糖,也是第一個被確認結構的氨基單糖[1-4]。氨基葡萄糖的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法主要為蝦殼蟹殼酸水解提取,存在環(huán)境污染、易致敏等問題。近年來,隨著代謝工程的迅速發(fā)展,微生物發(fā)酵法進行氨基葡萄糖生產(chǎn)的報道不斷涌現(xiàn)[5],其中最主要的方法是對GlcN合成途徑關鍵酶進行強化并阻斷其分解利用的代謝途徑。DENG等[6]通過易錯PCR篩選出高效的氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因(glmS),并將改良酶過量表達獲得了氨基葡萄糖滴度17 g/L。董瑞真等[7-8]通過加強氨基葡萄糖合酶(fructose-6-phosphate transaminase,GlmS)和氨基葡萄糖乙?；?glucosamine-6-phosphateN-acetyltransferase,Gna1)2種酶的表達,再對大腸桿菌氨基葡萄糖代謝途徑進行改造,經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗證后GlcN的產(chǎn)量提高至1.049 g/L。陳欣等[9]在已過表達GlmS和Gna1的大腸桿菌的基礎上利用Red同源重組技術將乙酰氨基葡萄糖磷酸轉運子編碼基因nagE和甘露糖磷酸轉運子編碼基因manX敲除,在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵至10 h時GlcN產(chǎn)量達到最大值4.82 g/L。

目前利用微生物發(fā)酵直接合成GlcN的最終產(chǎn)量并不理想,主要是因為代謝過程中生成的氨基葡萄糖-6-磷酸對GlmS存在反饋抑制[10],且GlcN在發(fā)酵過程中不穩(wěn)定易降解[6],因而GlcN在正常的代謝合成中不能大量積累。針對這一問題,工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)對GlcN進一步發(fā)酵生成N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine,GlcNAc),之后再結合酸水解生成GlcN。但環(huán)境污染的問題仍未得到有效解決,同時增加了生產(chǎn)工藝復雜性,因此,需要創(chuàng)建一種直接高效生產(chǎn)GlcN的微生物發(fā)酵方法。

在長期的實驗和生產(chǎn)實踐中,人們不斷地發(fā)現(xiàn)很多重要的生化過程必須依靠2種或多種微生物共同培養(yǎng)來完成[11]。如已廣泛應用于生產(chǎn)的維生素C二步發(fā)酵法中的第二步發(fā)酵L-山梨糖轉化形成2-酮基-L-古龍酸(維生素C前體物)是兩菌混合發(fā)酵的過程[12]。混菌體系最大的特點是不同來源、不同功能的元件和模塊可以在不同菌株中構建,既減輕對單菌底盤的代謝負荷,又便于將功能分區(qū)、避免功能間的交叉影響[13]。有研究在4株酵母菌中分別表達3種不同降解酶和一種蛋白支架,構成的混菌體系利用纖維素產(chǎn)乙醇的收率達到理論值的93%,解決了全部在單菌中構建導致代謝負擔過重而無法工作的問題[14-15]。

本研究通過構建混菌發(fā)酵體系的方式直接生產(chǎn)GlcN,通過將GlcN的合成分為GlcNAc的高效合成與脫乙?；?個步驟,并分別在2株大腸桿菌中進行代謝分工。將前期研究中構建的GlcNAc高效合成菌與本研究中構建的GlcNAc脫乙?；M合進行混菌發(fā)酵,實現(xiàn)兩菌勞動分工合成GlcN。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

本研究所用的菌株與質(zhì)粒信息詳見表1。基因克隆與基因組編輯所用的引物信息見表2。所有的限制性內(nèi)切酶、STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶,TaKaRa公司;引物,蘇州金唯智科技有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖,Sigma-Aldrich。

表1 本研究所用菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯

1.2.1 重組DNA片段構建

根據(jù)目的基因的序列,利用軟件Primer Premier 5進行引物設計,通過PCR獲得目的基因片段。以待整合或待敲除位點上下游序列為模板,設計合適的PCR引物,擴增500 bp左右的上、下游同源臂片段。對目的基因片段、上下游同源臂片段進行重疊PCR,以獲得基因整合用的重組DNA片段。進行基因敲除時,則只對上下游同源臂片段進行重疊PCR構建。

1.2.2 pGRB質(zhì)粒的構建

利用CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)選擇待整合/敲除位點附近的PAM序列(5′-NGG-3′),并通過合成線性化引物將相應的20 bp的gRNA序列引入單鏈DNA中,之后通過PCR退火形成雙鏈片段。將雙鏈片段與線性化pGRB載體進行同源重組后轉化至E.coliDH5α感受態(tài)中,篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒。

1.2.3 基因整合與敲除過程

參考LI等[16]報道的CRISPR/Cas9基因編輯技術進行E.coli基因組DNA的整合和敲除。

1.3 搖瓶發(fā)酵

培養(yǎng)基制備:

固體斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,牛肉膏10,瓊脂粉20,pH 7.0～7.5。

種子培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖20,酵母粉3,KH2PO42,檸檬酸2,MgSO4·7H2O 1,(NH4)2SO42,FeSO42.8 mg/L,MnSO41.2 mg/L,維生素B1 0.5 mg/L,維生素H 0.1 mg/L,微量元素混合液1 mL/L,消泡劑1滴,pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L):葡萄糖20,酵母粉3,K2HPO46.67,(NH4)2SO44,檸檬酸3.55,谷氨酸2,MgSO4·7H2O 2.5,FeSO410mg/L,CaCl2·2H2O 25 mg/L,MnSO41.2 mg/L,NaCl 1,微量元素混合液1 mL/L,維生素B1 0.5 mg/L,維生素H 0.1 mg/L,消泡劑1滴。

首先在固體斜面培養(yǎng)基中進行菌種活化,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后轉移至新的固體斜面,進一步培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)刮取一環(huán)菌體,接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底三角瓶中,用九層紗布封口,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h。

將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按接種后一定的OD600值比例,調(diào)整兩菌接種體積,保持總接種量為10%(體積分數(shù)),接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至發(fā)酵結束。在發(fā)酵過程中,根據(jù)培養(yǎng)基中苯酚紅的顏色指示,通過補加氨水使發(fā)酵液pH始終維持在一定的范圍。同時,根據(jù)耗糖情況,及時補加碳源。

1.4 發(fā)酵液中各成分的測定方法

本研究利用島津液相色譜儀(SHIMADZU LC-20AT)采用HPLC對發(fā)酵液中GlcNAc、GlcN進行測定分析。GlcNAc的檢測方法為色譜柱Aminex?HPX-87H色譜柱(7.8 mm×300 mm),檢測器為RID-20A折光率檢測器,流動相為5 mmol/L H2SO4溶液,柱溫設定30 ℃,流速設定0.5 mL/min。GlcN的檢測方法為參照DENG等[6]的檢測方法。

樣品檢測:將待測樣品13 000 r/min離心3 min,取上清液,稀釋至合適濃度后用0.22 μm濾膜過濾,最后進行檢測。

2 結果與分析

2.1 強化內(nèi)源脫乙酰酶基因nagA對GlcN產(chǎn)量的影響

在前期的研究中構建了GlcNAc的高效合成菌GLA,該菌通過在E.coliW3110中引入酵母來源的gna1基因,過表達E.coli自身的glmS基因,同時敲除6-磷酸N-乙酰甘露糖胺差向異構酶編碼基因nanE、乙酰氨基葡萄糖磷酸轉運子編碼基因nagE和甘露糖磷酸轉運子編碼基因簇manXYZ,阻斷了GlcNAc的分解利用途徑,實現(xiàn)了E.coli中GlcNAc的發(fā)酵生產(chǎn)[17]。如圖1所示,GlcNAc的脫乙?；梢酝ㄟ^2種方式實現(xiàn):方案1,通過強化大腸桿菌內(nèi)源性的脫乙酰酶基因nagA,同時敲除nanE、manXYZ和6-磷酸葡糖胺脫氨酶編碼基因nagB,阻斷了GlcNAc和GlcN的分解途徑;方案2,通過引入不同來源的脫乙酰酶基因,擇優(yōu)選取后進一步強化,并對GlcNAc進入細胞的磷酸化途徑進行阻斷,同時強化胞內(nèi)去磷酸化和阻斷GlcNAc的分解途徑。

為了驗證混菌發(fā)酵直接生產(chǎn)GlcN的可行性,在出發(fā)菌E.coliDA中,敲除了nanE和nagB,得到了DAN菌株,再在DAN菌株的基礎上對內(nèi)源性的脫乙酰酶基因nagA進行不同拷貝數(shù)的強化,DAN-1、

DAN-2、DAN-3分別為nagA基因的單、雙、三拷貝強化的菌株,并將上述菌株分別與GlcNAc合成菌株GLA進行搖瓶混菌發(fā)酵(菌種比例初步按體積比1∶1接種)。當菌株GLA、DAN、DAN-1進行單菌發(fā)酵時,發(fā)酵液中并無GlcN的產(chǎn)生,但當進行混菌發(fā)酵時,DAN+GLA的GlcN產(chǎn)量為3.6 g/L(圖2-a),證明了混菌體系可以直接發(fā)酵生產(chǎn)GlcN。從圖2-b中可看出,DAN-2+GLA的GlcN的產(chǎn)量最高為7.69 g/L,但當nagA基因拷貝數(shù)為3時,GlcN的產(chǎn)量開始下降,可能是因為由T7啟動子控制的基因數(shù)量過多導致細胞負擔加重,對GlcNAc的轉化能力降低。

a-單、混菌發(fā)酵對GlcN產(chǎn)量的影響;b-nagA拷貝數(shù)對GlcN產(chǎn)量的影響;c-菌種比例對GlcN產(chǎn)量的影響

由于發(fā)酵液中不同的菌種比例會對產(chǎn)物合成產(chǎn)生較大影響,所以進一步對兩菌接種比例進行了優(yōu)化。從圖2-c中可以看出,在OD600比例GLA∶DAN-3=1∶2時GlcN產(chǎn)量達到同批最高為6.03 g/L。

2.2 強化外源性脫乙酰酶基因?qū)lcN產(chǎn)量的影響

為了能獲得更高的GlcN產(chǎn)量,本研究引入了來源于火球菌(Pyrococcushorikoshii)的二乙酰殼二糖脫乙酰酶基因phD[18]和來源于海洋環(huán)桿菌(Cyclobacteriummarinum)的脫乙酰酶基因cyD[19]。由于這2種外源酶催化底物為不帶磷酸基團的GlcNAc,所以首先將DA菌株對GlcNAc進入細胞的磷酸化途徑進行阻斷得到了DAD菌株,再在DAD菌株的基礎上分別整合phD和cyD基因,得到DAD-1和DAD-2菌株。為檢驗并對比上述2種脫乙酰酶的活性,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加GlcNAc使其濃度達到50 g/L,并對DAD、DAD-1、DAD-2進行單菌發(fā)酵,得到DAD-1產(chǎn)量最高為5.24 g/L(圖3-a)。再將這3株菌分別與GLA進行混菌發(fā)酵,36 h后測得GLA+DAD-1中GlcN的產(chǎn)量最高為2.04 g/L(圖3-a),故選擇來源于火球菌的phD基因進行后續(xù)實驗。

在DAD-1的基礎上進行phD基因的強化,DAD-3、DAD-4分別為phD基因的雙拷貝和三拷貝,將DAD、DAD-1、DAD-3、DAD-4分別與GLA進行接種比例為1∶1的混菌發(fā)酵,得到的產(chǎn)量分別為2.19、4.37、5.43 g/L(圖3-b)。鑒于圖2-c中接種比例為1∶4時GlcNAc和GlcN的產(chǎn)量均較低,所以此次比例優(yōu)化調(diào)整為1∶1、1∶2、1∶3,且縮短發(fā)酵時間至24 h,以免長時間的發(fā)酵導致GlcN的持續(xù)降解。當GLA∶DAD-3=1∶1,發(fā)酵24 h時產(chǎn)量達到最高為7.83 g/L(圖3-c),GlcN產(chǎn)量有了明顯提高。為了防止拷貝數(shù)過多導致菌體生長和代謝受阻,選擇在DAD-3的基礎上做后續(xù)優(yōu)化。

2.3 進一步優(yōu)化組合對GlcN產(chǎn)量的影響

中性pH條件下,含有自由氨基的GlcN是不穩(wěn)定的,而在酸性條件下較為穩(wěn)定[20],所以在新的發(fā)酵條件,即菌種比例1∶1、低pH值(pH≤6.7)下發(fā)酵24 h后測定氨糖產(chǎn)量。GLA+DAD-3的GlcN產(chǎn)量達到9.69 g/L,相較圖3-c時的最高產(chǎn)量提高了約1.23倍。研究表明大腸桿菌周質(zhì)空間中含有幾種磷酸酶[21],可能會使一小部分GlcNAc磷酸化進入細胞,從而降低轉化率。為了進一步優(yōu)化菌種,采用了2種方式菌種進行優(yōu)化:強化胞內(nèi)磷酸化基因yqaB(鹵酸脫鹵酶樣磷酸酶)[22-23],使GlcNAc-6P去磷酸化生成GlcNAc,進而脫乙?；蒅lcN;強化內(nèi)源性脫乙酰酶基因nagA,分2種脫乙酰化途徑合成GlcN。對DAD-5(Trc-nagA)和DAD-6(Trc-yqaB)進行搖瓶發(fā)酵得到GlcN的產(chǎn)量為9.02和11.21 g/L。GLA+DAD-6比同批發(fā)酵的GLA+DAD-3提高了1.15倍,較初始對照體系GLA+DAN提高了約3.1倍(圖4)。

圖4 強化胞內(nèi)磷酸化基因yqaB和內(nèi)源脫乙酰酶基因nagA對GlcN產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of the enhancement of intracellular phosphorylation gene yqaB and the endogenous deacetylase encoding gene nagA on GlcN titer

3 討論

本研究采用混菌發(fā)酵的方法,成功地將GlcN的合成分為GlcNAc的高效合成與脫乙?；?個步驟,并分別在2種大腸桿菌中進行代謝分工。在構建GlcNAc脫乙?；倪^程中,通過強化大腸桿菌內(nèi)源性的脫乙酰酶基因nagA來增強菌株對GlcNAc的脫乙酰化能力,得到最高GlcN產(chǎn)量為7.69 g/L;為了進一步提高GlcN的產(chǎn)量,引入不同來源的脫乙酰酶基因并進行比較,優(yōu)化基因拷貝數(shù)和菌種比例,并改變發(fā)酵條件防止產(chǎn)物降解嚴重,最終確定最優(yōu)菌株和發(fā)酵條件,得到GlcN產(chǎn)量為7.83 g/L;為了提高GlcNAc的轉化率,在最優(yōu)條件的基礎上強化胞內(nèi)去磷酸化得到GlcN 11.21 g/L,較初始對照體系(GLA+DAN)提高了約3.1倍,此時的GlcN的轉化率為0.09 g/g葡萄糖,GlcNAc脫乙?；男蔬_到了70.46%,較低于文獻中所報道的轉化率86.8%[18]?？赡苁且驗榛炀w系中代謝途徑較為復雜,引入的脫乙酰酶的最適反應條件與發(fā)酵條件可能存在一定的差異。由此可見,在本研究構建的混菌體系中,對碳源的利用率還有待提高,且進一步提高細胞內(nèi)的脫乙?；室灿欣贕lcN產(chǎn)量的提升。