駱茂香,陳仁遠,徐興江,邱樹毅

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省酒類產品質量檢驗檢測院,貴州 仁懷,564500)

中國十二大香型白酒之一的醬香型白酒,具有釀造周期最長,工藝最復雜,參與微生物最多,風味物質最豐富等特點[1],其生產工藝為每年1個生產大周期,2次投糧,9次蒸餾,8次發(fā)酵,7次取酒,簡稱“12987”[2-4]。其中7次取酒依次為一至七輪次基酒,因生產風格不同,具有明顯不同的輪次風格特征,而綜合基酒由7個單輪次基酒以不同比例組合勾調而成,酒體更為豐富和獨特。查閱近十年文獻,關于白酒成品酒風味物質的研究很多,尤其是研究揮發(fā)性風味物質的文獻較多[5-11],先前關于醬香型白酒不同輪次基酒中揮發(fā)性風味物質的差異研究也有報道,而關于輪次基酒中非揮發(fā)性成分的系統(tǒng)研究卻鮮有報道。

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)[12-15]及UPLC-MS[16-18]已經被廣泛應用于分析白酒中的非揮發(fā)性風味物質,相較于GC及MS/MS需要衍生化處理,LC具有無需衍生化,且靈敏度高、分離度好等優(yōu)勢,而GC-MS甚至對低含量的化合物也具有很高的檢測靈敏度。近年來,色譜技術結合主成分分析(principal component analysis,PCA)[3,19-20]、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis, OPLS-DA)[21]、聚類分析、人工神經網(wǎng)絡分析等方法也逐漸被應用到了酒類風味物質的分析研究中[22]。PCA能夠將多個數(shù)據(jù)信息濃縮,并能夠保留大量數(shù)據(jù)信息[23],基于色譜分析的代謝組學在酒類分析研究中應用具有非常大的潛力。VACLAVIK等[24]采用高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜檢測了3種不同地理來源的葡萄酒品種,采用PCA和PLS-DA探索數(shù)據(jù)結構并構建分類模型,能對96%的樣本進行正確分類;唐維川等[3]通過GC分析醬香型白酒輪次基酒中的揮發(fā)性風味物質,利用PCA基本能夠實現(xiàn)不同輪次酒的特征香味物質的差異性評價。

課題組前期在白酒風味物質研究基礎上,采用UPLC及UPLC-MS/MS分析不同生產企業(yè)醬香型白酒一至七輪次及綜合基酒中的非揮發(fā)性有機酸及酚酸類物質,乳酸由于含量很高采用LC法單獨測定。非揮發(fā)性有機酸是醬香型白酒風味物質中非常重要的一類組分,主要承擔增強酒體濃厚感及呈味的作用[25];非揮發(fā)性酚類化合物是白酒中的滋味物質和健康成分,不僅影響白酒的風格和口感,增加白酒風味層次感,同時還具有抗氧化的作用[26-27]。本試驗利用化學計量學的方法對不同輪次及綜合基酒中非揮發(fā)性有機酸及酚酸類物質進行分析,旨在找出不同輪次基酒及綜合基酒中的共性與差異,為醬香型白酒酒體設計及生產工藝提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甲醇、乙腈,均為色譜純,默克公司;甲酸、磷酸,天津市科密歐化學試劑有限公司;標準物質:乳酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、阿魏酸、原兒茶酸、丁香酸、香草酸、咖啡酸、綠原酸、p-香豆酸、沒食子酸、苯甲酸,阿爾塔科技有限公司。

1.1.2 酒樣

依據(jù)《仁懷產區(qū)大曲醬香酒技術標準體系》中感官品評標準術語,經專業(yè)感官品評后篩選出符合大曲醬香一至七輪次基酒風格酒樣共3組共21個,來自貴州仁懷產區(qū)3個醬香型白酒生產企業(yè)(A、B、C),同一組樣品為同一廠家、同一年份一至七輪次基酒,綜合基酒以同一組一至七輪次基酒以不同比例組合勾調而成,具體組合見表1,共計24個酒樣,均常溫下密封避光貯存。

表1 不同輪次基酒酒精度及其在綜合基酒中的含量Table 1 Alcohol content of different round base liquor and percentage of each base liquor in comprehensive base liquor

1.2 儀器與設備

1200系列液相色譜儀,安捷倫科技;Ultimate 3000-TSQ QUANTUM ULTRA三重四極桿液質聯(lián)用儀,賽默飛科技;PHS-3C型pH計,上海儀電科學儀器;Milli-QAA10超純水系統(tǒng),倍捷科技。

1.3 方法

1.3.1 UPLC測定乳酸

樣品的制備:準確吸取酒樣2 mL于10 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,搖勻。過0.22 μm水相濾膜,待UPLC測定乳酸含量。

儀器條件:色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流動相A相為0.1%磷酸溶液,B相為甲醇,0～10 min:5%B,10.50～15.00 min:100%B,15.10～20.00 min:5%B;流速1.00 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量20 μL;檢測器DAD;檢測波長210 nm。乳酸出峰時間為4.241 min。

1.3.2 UPLC-MS/MS測定酒樣中7種高級脂肪酸

樣品的制備:準確吸取酒樣2 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻。過0.22 μm有機相微孔濾膜,待UPLC-MS/MS測定高級脂肪酸類物質。

UPLC儀器條件:色譜柱XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm,1.8 μm);流動相A相為0.1%甲酸溶液,B相為甲醇,0～4 min:70%～100%B,4.01～7.50 min:100%B,7.51～13.00 min:70%B;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;流速0.20 mL/min。

MS儀器條件:電噴霧離子源(ESI),負離子模式;一級MS掃描;毛細管溫度:350 ℃;霧化氣溫度:300 ℃;鞘氣壓力:25 Arb;噴霧電壓:4 000 V。

7種高級脂肪酸質譜參數(shù)及保留時間見表2。

表2 7種高級脂肪酸的質譜分析參數(shù)Table 2 MS parameters of 7 higher fatty acids

1.3.3 LC-MS/MS測定酒樣中8種酚酸及6種其他非揮發(fā)性有機酸

樣品的制備:準確吸取酒樣10 mL于蒸發(fā)皿中,60 ℃水浴1 h, 過經甲醇活化后的HLB小柱后,用甲醇洗脫,甲醇定容至5 mL比色管中。過0.22 μm有機相微孔濾膜,待LC-MS/MS測定酚酸類物質。

LC儀器條件:色譜柱為XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm,1.8 μm);流動相A相為0.1%甲酸溶液,B相為甲醇,0～15.00 min:5%～100%B,15.10～17.00 min:100%B,17.10～20.00 min:5%B;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;流速0.25 mL/min。

MS儀器條件:電噴霧離子源(ESI),負離子模式;選擇反應監(jiān)測(SRM);毛細管溫度:300 ℃;霧化氣溫度:320 ℃;鞘氣壓力:25 Arb;噴霧電壓:3 500 V。

8種酚酸及6種其他非揮發(fā)性有機酸質譜參數(shù)及保留時間見表3。

表3 酚酸及其他非揮發(fā)性有機酸的質譜分析參數(shù)Table 3 The MS analysis parameters of phenolic acids and other non-volatile organic acids

1.3.4 定性定量方法

定性條件:在相同試驗條件下,樣品檢出的色譜峰保留時間和離子豐度比與標準樣品相一致,則可判定為該成分。

定量條件:采用外標-標準曲線法定量測定。所有酒樣均平行測定3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SIMCA 13.0 軟件進行PCA、OPLS-DA鑒別模型構建及變量權重重要性排序分析,根據(jù)變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值的發(fā)現(xiàn)判斷各非揮發(fā)性化合物對大曲醬香一至七輪次及綜合基酒差異的貢獻,篩選出關鍵差異化合物。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,Origin軟件繪制潛在差異化合物在不同酒樣中的變化趨勢。

2 結果與討論

2.1 22種非揮發(fā)性化合物的定性定量分析

通過外標法建立繪制5～6點標準曲線,準確構建了22種非揮發(fā)性化合物標準樣品的檢測方法。22種化合物包括乳酸、7種高級脂肪酸、8種酚酸以及6種其他有機酸(22種非揮發(fā)性化合物的定性定量詳見增強出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035939)。標準曲線R2>0.99,線性關系良好;RSD<6,精密度良好。

在酒樣中共檢出18種化合物,其中包括乳酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、苯甲酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸、油酸及亞油酸共14種非揮發(fā)性有機酸,以及阿魏酸、原兒茶酸、丁香酸、香草酸共4種酚酸,另外4種酚酸(咖啡酸、綠原酸、p-香豆酸、沒食子酸)在酒樣中均未檢出。

2.2 不同的醬香型白酒樣品中非揮發(fā)性物質分析

2.2.1 不同輪次醬香型基酒非揮發(fā)性物質分析

由表4可以看出,同一個酒樣中乳酸含量最高(529.940～2 731.865 mg/L),遠高于其他17種非揮發(fā)性風味物質,不同的化合物在一至七輪次及綜合基酒中的含量變化有所不同。乳酸含量先增后降,在第二輪次基酒中最高,第七輪次基酒中最低,這是因為不同輪次酒醅中的乳酸具有不易揮發(fā)、多輪次積累的特點,因此前期輪次增高,而伴隨釀造原料中淀粉含量的降低,乳酸菌合成乳酸的速度又會減緩,因此在后幾個輪次會有降低趨勢[28]。高級脂肪酸類物質含量在第一輪次最高,在第二、三、四輪次無明顯差異,第五、六、七輪次緩慢下降,在第七輪次中最低,這是因為酒體中的高級脂肪酸可由芽胞桿菌屬代謝產生,脂肪酸的β氧化可以生成酮類化合物,是乙偶姻這一風味物質的重要來源,同時,脂肪酸可以在發(fā)酵過程中和乙酸反應轉化為脂肪酸酯,棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯作為為白酒中的三大高級脂肪酸酯,其含量對酒體透明度和質量有重要影響。阿魏酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸含量隨輪次先增后降,在五輪次中含量最高,在一輪次中含量最低。乳酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸在酒樣中檢出濃度較高,初步猜測這幾種含量較高的物質對區(qū)分不同輪次醬香型白酒有較大的貢獻,且乳酸的貢獻明顯大于其他物質,這一結論是否合理需結合化學計量學進一步驗證。

表4 酒樣中18種目標化合物的質量濃度 單位:mg/L

2.2.2 不同輪次及綜合基酒 OPLS-DA模型建立及模型預測與驗證

儀器分析3組不同廠家一至七輪次基酒及綜合基酒共24個樣,獲得72個樣本值。對所有樣本值進行PCA,通過排查異常值,采用 Hotelling’s T2法和 DModX 法未發(fā)現(xiàn)有可疑和異常數(shù)據(jù),72個值均用于建立辨識模型訓練和預測并查找差異化合物。從OPLS-DA散點得分圖可以看出不同輪次基酒及綜合基酒分布情況(圖1),五、六、七輪次完全分布在t1軸左側,二、四輪次及綜合基酒完全分布在t1軸右側,一、二、七輪次基酒可分別與其他輪次基酒完全分開,且組內差異較小;三、四輪次及綜合基酒樣本值無法完全分開,這是因為綜合基酒中三、四輪次用酒比例比較大,各占約25%,化合物含量及種類比較接近。表明風味特征相似的酒體散點相對聚合(如三、

四、五輪次及綜合基酒),不同風味的酒體散點分布離散(如一、二、七輪次),這一結論與唐維川等[3]報道的不同輪次醬香型白酒中揮發(fā)性風味物質的評價結論相一致,是在揮發(fā)性風味研究基礎上的數(shù)據(jù)補充,對醬香型白酒不同輪次基酒的精準識別更為科學有益。

通過置換檢驗(n=200),結果如圖2所示,圖中左側點均低于右側的點,Q2截距為-0.147(<-0.05),驗證模型有效[29]。

圖2 不同輪次基酒置換檢驗結果Fig.2 Results of different rounds of base wine replacement tests

2.2.3 潛在差異性物質的確認

通過查看該模型VIP值排序(圖3)可知,VIP>1的化合物包括:乳酸、亞油酸、油酸、馬來酸及阿魏酸,確認上述5種化合物為區(qū)分不同輪次基酒的潛在差異性化合物,其中乳酸的VIP值最高(2.628 6)。進一步驗證了2.2.1節(jié)的猜測中乳酸、油酸、亞油酸這幾種含量較高的化合物對區(qū)分不同輪次酒樣有重要貢獻,但不能僅以含量較高作為區(qū)分不同輪次基酒貢獻的唯一評價標準,如棕櫚酸較高,但其VIP<1。

圖3 不同輪次基酒中18種非揮發(fā)性化合物的VIP值Fig.3 VIP values of 18 target compounds in different rounds of base liquor

如圖4所示,5種潛在差異化合物平均值含量有不同的變化趨勢:乳酸含量呈先上升后下降,在第二輪次基酒中最高,這與蒙德俊等[1]報道的利用離子色譜檢測醬香型不同輪次基酒中乳酸變化趨勢的結論相一致,在第七輪次基酒中最低的趨勢,二輪次中與其他輪次存在顯著差異(P<0.05),在第一、三、四輪次及綜合基酒中比較接近,無顯著差異(P>0.05)。亞油酸含量在一輪次基酒中最高,七輪次基酒中最低,且第一輪次和第七輪次基酒分別與其他輪次及綜合基酒存在顯著差異(P<0.05),在第二、三、四、五、六輪次及綜合基酒中相鄰輪次間存在差異,但不顯著(P>0.05),在第二、三、四輪次基酒中與第六輪次基酒中差異顯著(P<0.05)。油酸含量總體變化趨勢與亞油酸類似,在第一輪次基酒中最高,第七輪次基酒中最低,在第一、七輪次基酒存在顯著性差異(P<0.05),相鄰輪次及綜合基酒中存在差異但不顯著(P>0.05),在綜合基酒中與第二、五輪次基酒中的含量接近,三、四輪次中含量很接近。阿魏酸含量總體呈先上升后下降,在第五輪次基酒中最高,在第一輪次基酒中最低的趨勢,在第五輪次基酒中與第一、二、三、四、七輪次及綜合基酒存在顯著差異(P<0.05),第一、二、三輪次基酒差異不顯著(P>0.05),但與第五、六輪次酒存在顯著差異(P<0.05),在綜合基酒中與其他(除第五輪次外)輪次存在差異但均不顯著(P>0.05)。馬來酸含量總體呈先上升后下降,在第五輪次基酒中最高,在第一輪次基酒中最低的趨勢,其在第一、二輪次基酒中差異較小,但在這2個輪次基酒中與在其他輪次及綜合基酒中的含量有顯著差異(P<0.05),其在第五、六輪次基酒中差異較小,但在這2個輪次基酒中與第一、二、三、七輪次及綜合基酒中含量存在顯著差異(P<0.05),在綜合基酒中含量與第三、七輪次基酒接近,與其他輪次基酒存在顯著差異(P<0.05)。進一步驗證了構建模型篩選出的差異化合物基本在大曲醬香一至七輪次及綜合基酒中存在不同的差異變化。

a-乳酸;b-亞油酸;c-油酸;d-阿魏酸;e-馬來酸

3 結論

本研究建立了一種基于UPLC及UPLC-MS/MS法測定22種非揮發(fā)性風味物質的檢測方法,具有簡單、可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性較好等特點,可用于批量樣品的檢測與分析。通過運用該方法在醬香型白酒輪次基酒及綜合基酒中檢出18種非揮發(fā)性風味物質(包括14種非揮發(fā)性有機酸和4種酚酸),并總結了其在不同輪次的變化規(guī)律。還通過PCA及OPLS-DA法構建了醬香型白酒一至七輪次基酒及綜合基酒的鑒別模型,VIP分析表明乳酸、油酸、亞油酸、馬來酸及阿魏酸共5種潛在差異物質具有區(qū)分不同輪次及綜合基酒的潛力,對區(qū)分不同輪次醬香型白酒貢獻較大的差異化合物可以為醬香型白酒分型定級工作提供參考依據(jù),且它們的含量變化趨勢也可作為生產過程中輪次風格是否存在偏離的監(jiān)控和指導依據(jù)。這為進一步全面解析醬香型白酒中的風味物質,更加科學精準地評價醬香型白酒輪次基酒質量做出重要貢獻。后續(xù)的研究中將在此基礎上結合揮發(fā)性風味物質對醬香型白酒輪次基酒中不同香型及不同等級的差異分析進行深入探索。