朱華劍,董慶利,申佳琪,牛洪梅,胡敏敏,竇鑫,賈凱,李代禧,劉陽泰*

1(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)2(上海理工大學 光電信息與計算機工程學院,上海,200093)

食品生產(chǎn)加工、儲藏等過程中,部分食源性致病菌可在不銹鋼、塑料、玻璃等食品接觸表面生成胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS),形成呈三維膜狀結構特征的生物被膜[1-2]。在由多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子組成的EPS保護下,生物被膜狀態(tài)的菌群更難以被清除,且會通過釋放菌體,加劇食源性致病菌的傳播[3]。因此,生物被膜被認為是食品安全的重大威脅之一,需要在食品生產(chǎn)供應鏈中持續(xù)監(jiān)測[4]。

生物被膜的檢測具有挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)定性檢測主要采用結晶紫、剛果紅、銀染等染色方法,但樣品處理過程復雜,可重復性差,誤判率高[5-6];定量檢測則常用微生物培養(yǎng)計數(shù)法,但培養(yǎng)周期長,無法快速獲得檢測結果[7-9]。隨著光學技術、電化學傳感技術等發(fā)展迅速,其也被初步應用于生物被膜的快速可視化檢測。例如,光學、力學、電子顯微鏡技術可用于觀測生物被膜的三維結構和分布,但難以定量生物被膜及其組成[10];核磁共振方法可獲取生物被膜基質(zhì)中物質(zhì)結構信息,但對樣本制備和數(shù)據(jù)分析要求高[11];光譜方法理論上可實現(xiàn)對生物被膜的實時、無損、原位定量分析,但常見的紅外光譜方法會因—OH抑制生物被膜組分的特征帶,水信號過強,信噪比較低[12]。近年來,拉曼光譜技術逐漸被應用于生物被膜的檢測中,其通過光的非彈性散射,無探針原位分析識別化學特征,避免了上述技術的缺點。光譜中的每個拉曼峰都是特定分子鍵的特征,可作為每個生化成分特定的“指紋”,易于對包含各種分子和分子基團(如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)和核酸)的復雜結構進行詳細分析,且拉曼峰的偏移不受水的影響[13-14]。

基于此,本文從拉曼光譜的技術原理出發(fā),介紹了拉曼光譜采集生物被膜分子信息的技術和數(shù)據(jù)分析方法,歸納了拉曼光譜可識別的生物被膜特征物質(zhì)及對應關系,并總結了該技術在檢測細菌黏附、生物被膜形成、信號分子調(diào)控等過程中的應用研究進展,最后討論了通過結合其他技術,進一步提升拉曼光譜獲取生物被膜特征能力的可行性。

1 拉曼光譜原理與主要技術

1.1 拉曼光譜原理

拉曼光譜是一種基于拉曼散射效應的光譜分析技術[15]。當樣品暴露在可見單色光下時,樣品會吸收光線,大部分光會透過樣本,小部分光會被樣品散射到各個方向。當特定頻率的入射光與其散射光頻率一致時,則被稱為瑞利散射。由于該過程沒有發(fā)生能量交換,也被稱為彈射散射?？偵⑸涔庵写蠹s有1%,其頻率和入射光不同,這部分稱為拉曼散射或非彈性散射。拉曼散射又分為斯托克斯散射和反斯托克斯散射,二者均勻的分布于瑞利散射的兩側。當分子跳回到電子振動基態(tài)的較高能級時,入射光的頻率大于散射光,光子發(fā)生紅移,稱為斯托克斯散射;當分子跳回到基態(tài)能級時,入射光頻率小于散射光頻率,激光光子發(fā)生藍移,則稱為反斯托克斯散射。瑞利散射和拉曼散射的能級圖如圖1所示。由于散射光子的頻率取決于分子鍵的類型,因此,每個分子的拉曼光譜是唯一的,可以作為該分子的指紋譜。

圖1 瑞利散射與拉曼散射的能級圖Fig.1 Energy level diagram of Rayleigh scattering and Raman scattering

1.2 獲取生物被膜拉曼光譜的主要技術

1.2.1 顯微共聚焦拉曼光譜

由于生物被膜的尺度在微米至納米水平,因此傳統(tǒng)拉曼光譜的檢測分辨率無法滿足相關檢測的要求。如圖2所示,顯微共聚焦拉曼光譜(confocal Raman microscopy,CRM)將拉曼光譜與激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)集成,可為微生物研究提供納米級的空間分辨力[16]。拉曼顯微光譜最初常用于微生物培養(yǎng)物的單細胞分析[17],VIRDIS等[18]則首次實驗證明CRM可以用于監(jiān)測生物被膜的形成過程,且不會影響其結構或代謝活動。對不同種類生物被膜的研究表明,CRM可以將生物被膜內(nèi)的各種結構外觀與其化學成分的變化相關聯(lián),并推斷生物被膜基質(zhì)中復雜組成物質(zhì)的化學信息。

圖2 顯微共聚焦拉曼光譜結構圖Fig.2 Structure diagram of confocal Raman microscopy

1.2.2 表面增強拉曼散射

在利用拉曼光譜技術開展生物被膜檢測過程中,常發(fā)生信號強度過低導致檢測失敗的情況,表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)技術的開發(fā)則很好地解決了這一問題。SERS是一種依靠納米結構金屬在光激發(fā)下產(chǎn)生的大電場來增強金屬附近分子對光子的非彈性散射的技術。研究發(fā)現(xiàn),使用貴金屬納米結構可以大大增強微弱的拉曼散射信號,并可通過電磁增強和化學增強機制進行解釋[19]。IVLEVA等[20]率先研發(fā)了應用SERS檢測生物被膜的方法,其使用鹽酸羥胺還原銀納米顆粒(nano particles,NPs)作為SERS基底,將生物被膜包裹的載玻片浸入銀膠體懸浮液后,進行SERS測量。隨著技術優(yōu)化,目前主要有2種方法制備SERS實驗用生物被膜樣品[21-22]:一是將生物被膜與金、銀為主的金屬膠體或離子溶液簡單混合,然后將溶液滴注到固體基底上待測,但該方法的局限性在于拉曼信號增強僅限于膠體附近的生物被膜表面,結果的可重復性和穩(wěn)定性均較差;二是將浮游菌體附著于NPs修飾過的表面形成生物被膜,該方法得到的光譜圖重復性更高,數(shù)據(jù)結果更穩(wěn)定,因此也是目前的主流方法[13]。

SERS為檢測生物分子信號開辟了新的可能性,但目前SERS基底制備缺少標準化操作,SERS基底的化學性差異直接影響不同物質(zhì)的準確鑒定。同時,SERS光譜采集中,一些金屬(尤其是銀)對微生物具有一定抑制作用,長時間的實驗和高濃度的NPs,可能導致活菌數(shù)量顯著減少,影響檢測結果[23]。因此,應根據(jù)細菌種類和環(huán)境條件,進一步優(yōu)化設置基底制備步驟和細菌-NPs濃度比,降低檢測誤差,提高SERS檢測生物被膜的魯棒性。

1.3 分析生物被膜拉曼光譜數(shù)據(jù)的方法

由于微生物樣品中蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)等化學鍵的分子振動所獲得的光譜通常非常相似,這使得拉曼光譜數(shù)據(jù)分析成了一個難點。為了降低冗余數(shù)據(jù)的影響,一般先對光譜圖進行基線扣除、平滑降噪、消除宇宙射線、歸一化等預處理[24]。預處理后的數(shù)據(jù),進一步采用化學計量學方法實現(xiàn)生物被膜化學組成的分析。

在微生物化學計量分析中,通常分為有監(jiān)督和無監(jiān)督2種基本方法。根據(jù)定性或定量的任務需求,監(jiān)督方法又分為分類和回歸兩類模型。監(jiān)督方法需要樣本的先驗知識,例如偏最小二乘回歸(partial least-squares regression, PLSR)、支持向量機(support vector machine, SVM)判別分析、線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)等。SHEN等[25]建立了一種基于纖維探針拉曼光譜的細菌生物被膜分類方法,利用大腸桿菌等5種細菌建立主成分分析(principal component analysis,PCA)-LDA模型,對未知細菌生物被膜的識別率最高可達97.5%。KUSI等[26]利用拉曼顯微光譜結合SVM,對自來水中作為浮游細胞和生物被膜生長的9種細菌(如銅綠假單胞菌等)進行鑒別測定。EBERT等[27]將47例不同疾病背景患者的臨床金黃色葡萄球菌的拉曼光譜圖與其生物被膜形成特征相關聯(lián)。對生物被膜形成的拉曼光譜進行PLSR分析,可以獲得拉曼光譜與生物被膜吸光度值的線性相關性。PLSR負載系數(shù)突出了高生物被膜量和低生物被膜量之間代表核酸、碳水化合物和蛋白質(zhì)的拉曼譜帶的光譜差異;無監(jiān)督分類方法不需要樣本的先驗知識,如PCA和層次聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)。由于PCA具有去除冗余重疊光譜信息的能力,因此是用于區(qū)分不同生物被膜EPS成分差異的最常用的有力工具。TAHIR等[14]用拉曼光譜結合PCA表征和比較9種細菌生物被膜分泌出的2種不同種類的胞外多糖:葡聚糖和果聚糖。DU等[28]采集了不同耐干燥水平的阪崎克羅諾桿菌菌株形成的生物被膜的拉曼光譜圖,PCA結果發(fā)現(xiàn)不同耐干燥水平的菌株主要成分存在差異,證明了多糖、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素的水平可能在菌體耐干燥環(huán)境中起重要作用。CHOO-SMITH等[29]對不同位置、深度的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生物被膜光譜進行HCA,發(fā)現(xiàn)菌落中存在不同的層,進一步的研究表明,從菌落表面獲得的光譜顯示出比菌落深層更高的糖原水平,來自較深層的光譜具有比表面層更高的RNA水平。

化學計量學模型建立后還需對模型的準確率進行驗證,驗證的主要方法可分為交叉驗證(又稱內(nèi)部驗證)和獨立驗證(又稱外部驗證)。交叉驗證使用建立模型的光譜數(shù)據(jù)測試模型預測能力,例如K-fold交叉驗證(K-fold Cross-validation)方法將數(shù)據(jù)集隨機劃分為K個子集,訓練模型時隨機選擇K-n份作為訓練集,剩下的n份作為測試集,是目前最常用的交叉驗證技術之一[30]。交叉驗證常用于檢驗模型的可重復性,可防止模型過擬合,還可用于插補數(shù)據(jù)缺失值;獨立驗證根據(jù)未用于構建模型的數(shù)據(jù)評估模型的性能,主要用于考察模型的可遷移性和泛化能力,其結果對于將該模型推向?qū)嶋H應用至關重要。

2 生物被膜研究中的拉曼光譜應用

在已實現(xiàn)的拉曼光譜生物被膜研究與應用中,主要涉及生物被膜基質(zhì)組成的快速、無損檢測,浮游菌體與生物被膜的差異比較,生物被膜形成和代謝過程的物質(zhì)變化監(jiān)測,以及生物被膜的抗逆機理探究等方面。

2.1 生物被膜基質(zhì)組成的檢測

食品中常見的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、阪崎克羅諾桿菌等食源性致病菌均能在一定環(huán)境條件下形成生物被膜。與浮游菌體相比,生物被膜的拉曼譜帶特征峰存在差異,通過關聯(lián)不同特征峰對應的官能團,如糖類、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等,即可用于識別細菌的生物被膜。表1概括了常見食源性致病菌生物被膜拉曼特征峰與其基質(zhì)內(nèi)主要生物大分子的對應關系。需要注意的是拉曼光譜和SERS光譜特征反映了相似的生化性質(zhì),但SERS的增強效應可能導致譜帶的偏移,兩者并非完全一致。

表1 食源性致病菌生物被膜基質(zhì)的代表性拉曼特征峰Table 1 Representative Raman characteristic peaks of biofilm substrates of foodborne pathogens

2.2 生物被膜形成過程的檢測

目前,一般認為細菌生物被膜的形成有5個階段的動態(tài)過程:菌體附著于介質(zhì)表面;細菌分泌EPS;微菌落形成;微菌落發(fā)展成成熟的生物被膜;生物被膜中浮游態(tài)細菌分散到周圍環(huán)境中[38-39]。由于拉曼光譜特征可用于識別某一時間點的生物被膜基質(zhì)中生物分子及含量,因此通過分析EPS拉曼特征的動態(tài)變化,理論上可以對應確認細菌生物被膜的代謝活動及其形成過程階段,表2總結了部分食源性致病菌生物被膜形成的各階段拉曼特征峰的變化。

TAN等[41]利用拉曼光譜監(jiān)測了副溶血性弧菌生物被膜的形成,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48 h后,生物被膜形成致密結構,拉曼譜圖對應EPS中的碳水化合物和核酸含量顯著上升,這一EPS拉曼譜圖特征的變化同樣被發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生物被膜的形成過程[26]。CHEN等[37]對食源性致病菌生物被膜中EPS利用超聲探針法進行提取,研究了副溶血性弧菌和單增李斯特菌形成的單一和混合物種生物被膜的特征的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)混合物種生物被膜中EPS的碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸所對應的拉曼峰均有所下降。再通過苯酚-硫酸法[42]和Lowry法[43]對碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量進行量化,證實混合物種生物被膜與表面的黏附會降低,胞外多糖和蛋白質(zhì)的濃度降低。通過微生物分析與拉曼光譜譜圖特征相結合,為拉曼光譜對EPS的定量分析提供了理論依據(jù)。該團隊還研究了副溶血性弧菌在玻璃材料表面形成的生物被膜EPS的化學成分,首次發(fā)現(xiàn)在副溶血性弧菌生物被膜的形成過程中類胡蘿卜素起協(xié)助作用[35]。

生物被膜形成過程中,包括碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等在內(nèi)的代謝產(chǎn)物和生物大分子含量通常是逐漸增加的。因此,在生物被膜初期,大多數(shù)細菌和EPS化合物的拉曼信號比較微弱,對方法的檢測限要求較高。LIU等[36]報道了一種快速且新穎的SERS檢測方法,用于研究金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。通過使用帶有金納米粒子的便攜式拉曼光譜儀收集結晶紫染色生物被膜的拉曼光譜,發(fā)現(xiàn)測量的拉曼峰強度與生物被膜的數(shù)量呈良好的線性關系。NGUYEN等[44]自制等離子體納米間隙增強了拉曼散射信號,綠膿素檢測限達到了10 ng/mL,能夠檢測銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成過程。

在對細胞間群體感應(quorum sensing,QS)過程的信號分子檢測方面,SERS由于具備識別金屬陽離子的高靈敏度特性,也體現(xiàn)出了良好的效率和性能[45-46]。QS是一種細胞間通信現(xiàn)象,細菌通過分泌和感應特定的信號分子來監(jiān)測和響應自身所處的環(huán)境和種群密度,從而在細菌種群范圍內(nèi)同步調(diào)節(jié)基因表達[47]。目前,傳統(tǒng)檢測生物被膜QS的手段主要是針對代謝物的同位素標記法和熒光法,但兩者都需繁瑣的預處理步驟。SERS由于具備識別金屬陽離子的高靈敏度特性,體現(xiàn)出了良好的效率和性能。GUO等[48]在2片六角形氮化硼層之間封裝金納米星,開發(fā)了一種具有三明治結構的柔性黏滯便箋,該黏滯便箋可以黏貼在細菌生物被膜上,通過高靈敏度的SERS成像可實時監(jiān)測分泌的信號分子。綠膿素是銅綠假單胞桿菌的一種QS信號分子,在生物被膜形成過程中起著重要作用。BODELN等[49]以聚N-異丙基丙烯酰胺修飾的金納米粒子(Au@pNIPAM)、二氧化鈦修飾的金納米粒子(Au@TiO2)、二氧化硅修飾的金納米粒子(Au@SiO2)作為基底,得到綠膿素在550～900 nm段有明顯特征的SERS譜圖,3種基底分別對應檢測限為10-10、10-9、10-14mol/L。酰化高絲氨酸內(nèi)酯類(acyl-homoserine lactones,AHLs)為革蘭氏陰性細菌QS的一類重要信號分子,研究發(fā)現(xiàn)AHLs的SERS譜圖主要由酰氨分子譜峰組成,其中酰胺I、酰胺II、酰胺III和酰胺IV的峰分別位于1 648、1 570、1 308、771 cm-1處[50]。

此外,也有研究表明SERS可以實現(xiàn)革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌EPS的定量檢測[51-52]。然而,生物被膜樣品的拉曼光譜易受到熒光強干擾的影響,所以需要對激發(fā)光波長、采集時間、物鏡放大倍數(shù)、聚焦模式等測量參數(shù)不斷優(yōu)化。未來可從拉曼峰強度與面積的角度,進一步完善基于拉曼光譜的生物被膜的定量分析。

2.3 生物被膜逆環(huán)境過程的檢測

生物被膜作為食品、醫(yī)療等領域的重大威脅之一,通常需要通過探究生物被膜的抗逆機理,針對性地開發(fā)有效抑制消殺措施。通常,抑制消殺措施會以降解DNA、蛋白質(zhì)或改變官能團構象等方式導致生物被膜EPS化學成分被破壞,進而徹底清除生物被膜。因此,可通過建立處理條件與生物被膜損傷引起的拉曼光譜變化間的函數(shù)關系,實現(xiàn)基于拉曼光譜方法的生物被膜抗逆過程與機理分析。

在評價抗菌劑有效性方面,拉曼光譜可通過檢測生物被膜中與DNA相對應的拉曼譜帶,追蹤抑菌與殺菌作用的機制[53-54]。HAN等[55]評估了酸性電解水去除食源性病原體單增李斯特菌和副溶血性弧菌生物被膜的能力,并通過拉曼光譜中碳水化合物C—O—C鍵以及酪氨酸和苯丙氨酸中芳香環(huán)的變形證明酸性電解水可以引發(fā)EPS被破壞。CHEN等[56]建立了一種高效的藍光LED光動力滅活技術(photodynamic inactivation,PDI),用光敏劑姜黃素介導PDI根除副溶血性弧菌及其生物被膜,并通過拉曼光譜觀測出PDI處理后顯著降低了生物被膜EPS中蛋白質(zhì)、總碳水化合物和eDNA的含量,該結果同PRABHAWATHI等[57]對功能化聚己內(nèi)酰胺作用大腸桿菌生物被膜的抗生物被膜活性和生物被膜形成的研究相符。

在評價抗生素有效性方面,傳統(tǒng)的細菌耐藥性檢測方法通常需要在與不同抗生素孵育期間監(jiān)測細菌的生長情況,待確定目標病原體后,還需要額外18～24 h來進行藥敏試驗(antimicrobial susceptibility testing,AST)[58]。LU等[59]利用拉曼光譜對比分析環(huán)丙沙星、紅霉素等抗生素抑制空腸彎曲菌生物被膜后波峰的變化,縮短了檢測時間,并通過交叉驗證評價建立了活細胞存活數(shù)的PLSR預測模型。JUNG等[60]應用拉曼光譜的基于判別模型的PCA和SVM能夠以100%的準確率特異性分離抗生素治療生物被膜后產(chǎn)生的光譜。對于敏感菌株,由于藥物作用,細菌代謝過程受到干擾,細菌停止生長;對于耐藥菌株,與未治療的對照組相比,添加藥物可能沒有效果,或者由于誘導的抗生素耐藥性,可能導致細菌生化特征變化。通過多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析,可以從拉曼光譜中識別藥物引起的生化變化,快速準確獲得AST結果,此過程進行2～3 h即可。此外,通過分類模型或計算光譜標記帶的比率對區(qū)可快速分敏感性菌株和耐藥性菌株。例如,NAKAR等[61]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌耐藥菌株具有較高的核酸與蛋白質(zhì)比率,結合機器學習模型準確區(qū)分耐藥菌株與敏感菌株。

3 拉曼光譜結合其他技術檢測生物被膜

為了更準確、穩(wěn)定地獲得生物被膜組成、結構和功能信息,還常采用拉曼光譜結合2種或多種不同的樣品制備、檢測、分析技術,對食源性致病菌生物被膜進行探究。

3.1 結合光譜技術

紅外光譜和拉曼光譜作為2種互補的分子振動技術,結合后可共同描述生物被膜的固有化學信息[10, 62]。紅外光譜可檢測到改變分子永久偶極矩的振動,拉曼光譜則可在光譜中看到改變極化率的振動,紅外光譜與拉曼光譜所涉及的分子振動分別通過光的吸收或非彈性散射激發(fā)。WANG等[31]通過將傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)和拉曼光譜結合對不銹鋼表面培養(yǎng)的沙門氏菌生物被膜進行分析,揭示了沙門氏菌生物被膜和相應的浮游細胞之間完全不同的化學成分,以及沙門氏菌在不同營養(yǎng)條件下生物被膜形成之間的一些重要差異。SHARMA等[33]從FTIR技術和拉曼光譜技術獲得了阪崎克羅諾桿菌全細胞成分光譜,比較了阪崎克羅諾桿菌的生物被膜細胞與浮游細胞的成分差異。

3.2 結合顯微鏡技術

原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)和拉曼光譜相結合,不獲得了超高分辨率,還避免了弱拉曼光譜信號所帶來的困擾。AFM配備導電金屬(如鍍金或鍍銀納米顆粒)的針尖,使其具有SERS活性。PRADHAN等[63]使用拉曼光譜揭示了微生物細胞和EPS的不同化學成分,而AFM圖像清晰顯示了EPS的分泌和包裹在EPS基質(zhì)內(nèi)的細胞,兩者相結合提供了生物被膜的較為完整的成分結構信息。NIELSEN等[64]研究精油異丁香酚涂層是否可避免細菌生物被膜通過表面轉移的問題,并通過拉曼光譜、AFM相結合,可視化了金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌在不銹鋼和聚乙烯表面的定殖。由于拉曼光譜檢測設備穩(wěn)定可靠,標準和模塊化部件數(shù)量有限,因此拉曼光譜和AFM的結合相對較易。

同時,CLSM可通過熒光染色、圖像分析等研究手段量化細菌生物被膜的結構特征,如:生物被膜厚度、粗糙度、孔隙度、體積覆蓋率、分形維數(shù)等。但有研究表面EPS中某些分子的熒光染色特異性較低,未能被CLSM靈敏檢測[65-66]。結合拉曼光譜的分子信息后,可互補實現(xiàn)對生物被膜基質(zhì)的全面了解。例如,WAGNER等[67]將拉曼光譜技術與CLSM技術結合,同時獲得了生物被膜基質(zhì)內(nèi)不同物質(zhì)的化學信息、空間結構和深度分布信息。

3.3 結合篩選標記技術

SERS與顯微鏡、穩(wěn)定同位素標記、微流控分析等其他工具的靈活集成,也已取得了一定進展。利用由同位素標記樣品與未標記樣品的拉曼光譜的差譜分析研究標記位置的分子結構和相互作用的方法,它可以補充其他分子生物學技術,用于在單細胞水平上原位研究細菌在生物被膜中的代謝過程[68]。例如,SERS與15N穩(wěn)定同位素探針相結合,可以在單細胞水平上區(qū)分微生物聚集體中的氮轉化,這為探索生物脫氮過程中的硝化、反硝化和厭氧氨氧化提供了一種方法[69]。MUHAMADALI等[70]首次將拉曼光譜和FTIR作為代謝指紋分析方法與穩(wěn)定同位素相結合,對大腸桿菌細胞進行定量和區(qū)分,不同同位素摻入后的特定光譜位移產(chǎn)生了獨特的聚類模式,這與介質(zhì)中同位素標記含量的比率直接相關。

此外,在傳統(tǒng)生物被膜形成過程研究中,通常局限于低剪切力和靜態(tài)培養(yǎng)的環(huán)境條件,無法滿足模擬真實動態(tài)環(huán)境的需要。對此,研究者還可結合高可重復性和高通量的微流控技術,精確控制營養(yǎng)和流動條件,實現(xiàn)研究生物被膜在不同剪切力與動態(tài)營養(yǎng)作用下的結構和細胞信號變化,且具有的特點。FENG等[71]通過在微流控平臺上培養(yǎng)銅綠假單胞菌生物被膜,并使用CRM以無損和連續(xù)的方式對不同發(fā)育階段的銅綠假單胞菌生物被膜原位表征。同時,微流控平臺產(chǎn)生離散或連續(xù)的藥物梯度,再與拉曼光譜技術相結合,也可大大縮短藥敏檢測時間。HUANG等[72]結合微流控技術、SERS構建了AST模型,分別對敏感、耐藥的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行測試,得到的AST結果與用肉湯稀釋法培養(yǎng)的實驗一致,整個實驗過程僅需2 h。

4 總結與展望

拉曼光譜是一種快速、高效的檢測技術,其應用于食源性致病菌生物被膜的研究表明:拉曼光譜的特征峰可用于表征生物被膜基質(zhì)中的代表性化學物質(zhì),其特征峰的變化可用于識別生物被膜的形成階段。同時,EPS、QS信號分子等拉曼譜帶的改變,還可反映生物被膜在嚴苛環(huán)境中的物質(zhì)變化與生存狀態(tài),并用于推斷生物被膜的抗逆機理。在拉曼光譜技術的基礎上,還可通過融入互補技術,獲得更準確、穩(wěn)定、全面的生物被膜信息。隨著拉曼儀器的小型化、自動化、高通量化,及機器學習分析技術的成熟,將進一步促進該技術在細菌生物被膜中的應用,但目前仍存在以下突出問題:

(1)現(xiàn)有研究多基于實驗室理想條件,尚缺少針對真實復雜食品場景的標準化樣品取樣與拉曼光譜預處理方法,以避免非目標待測物質(zhì)的干擾;

(2)在多種微生物共存的生物被膜中,其基質(zhì)的化學組成和結構也具有高度異質(zhì)性,可能造成拉曼光譜特征峰差異;

(3)部分拉曼特征峰與對應的物質(zhì)結構(官能團)關系尚不明確,且缺少可供參考的標準拉曼峰譜比對數(shù)據(jù)庫;

(4)盡管拉曼光譜方法已初步實現(xiàn)了生物被膜的快速檢測,但仍未有合適模型可用于定量預測評估其群體動態(tài)變化和可能造成的健康風險。

綜上,未來可從以下方面開展深入探究:

其一,優(yōu)化拉曼光譜待測樣品的獲取和預處理,通過結合微流控技術,實現(xiàn)待測生物被膜的高通量分選與收集,降低雜質(zhì)干擾;

其二,結合生物信息學和分類模型,對不同亞型的生物被膜基質(zhì)光譜差異進行比較探究,實現(xiàn)對高異質(zhì)生物被膜群體的識別與分析;

其三,通過大量積累拉曼光譜、SERS檢測未知物質(zhì)的特征譜圖,完善食源性致病菌的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫,構建標準峰譜比對庫;

其四,引入預測微生物學方法,建立基于拉曼光譜的生物被膜動力學預測模型,為進一步考慮生物被膜的微生物定量風險評估提供基礎。