曾華英,謝有發(fā),成策,高洪霞,鄒立強*,劉偉

1(南昌大學 食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌,330047)2(江中藥業(yè)股份有限公司,江西 南昌,330041)

姜黃素(curcumin)是一種含多個雙鍵、酚羥基等活性基團的天然物質,具有抗氧化、抗癌和降血脂等生理活性功能[1]。然而,由于姜黃素的載藥量低、水溶性低及新陳代謝快,使其生物利用度很低[2],阻礙其在食品領域中的應用。目前,已開發(fā)出多種用于姜黃素包封和遞送的體系,其中,基于脂質的遞送體系具有更高的姜黃素生物可及性。姜黃素負載于脂質中,脂質可在消化道內被脂肪酶水解為有助于形成膽汁鹽和內源性磷脂混合膠束的2-單甘油酯和脂肪酸,同時,原本負載于脂質的姜黃素溶解于混合膠束中,成為生物可及性的(溶解的),被胃腸道吸收[3]。MIAO等[4]通過構建由多糖穩(wěn)定的水包油高內相乳液使姜黃素的生物可及性提高至46.3%。LI等[5]將姜黃素置于硅涂層脂質體中,其生物可及性是姜黃素懸浮液的7.76倍。盡管上述遞送體系在一定程度上改善了姜黃素的生物可及性,但是它們的制備工藝相對復雜,載藥量偏低,易受外界環(huán)境影響。

目前,油凝膠是一類在食品領域研究較為廣泛的有機凝膠,因其不含反式和飽和脂肪酸,不對人體健康造成危害,備受消費者的青睞,其制備工藝也相對簡便,即通過凝膠劑自組裝形成三維網(wǎng)絡結構,將基料油固定在其中[6]。此外,由于其具有增溶和穩(wěn)定脂溶性活性成分的作用,是負載脂溶性活性成分的理想遞送體系之一,因此近年來受到食品領域研究人員的廣泛關注。LI等[7]利用卵磷脂和β-谷甾醇制備的油凝膠增強了進食狀態(tài)下姜黃素的生物可及性(67.66%)。有研究表明油凝膠能夠通過凝膠劑形成的三維網(wǎng)絡來減緩脂解和活性成分的釋放[8]。然而,目前還沒有關于通過調控油凝膠網(wǎng)絡結構來提高負載姜黃素油凝膠的脂解程度和生物可及性方面的研究。故本研究擬采用已被美國食品與藥品管理局 (Food and Drug Administration, FDA)確認為公共安全,成本低及凝膠效率高的小燭樹蠟(candelilla wax,CLW)作為凝膠劑來制備負載姜黃素的油凝膠[9-10]。有研究將β-胡蘿卜素負載于小燭樹蠟基油凝膠中,但其負載量僅有1 mg/g,且在消化過程中其在混合膠束層的濃度僅有30 μg/g[11]。這項研究表明若僅靠CLW基油凝膠負載姜黃素,較難實現(xiàn)姜黃素的高負載及高生物可及性。姜黃素也因熔點高,以晶體形式存在,其物理性質與β-胡蘿卜素類似,有研究者發(fā)現(xiàn)溶解狀態(tài)的β-胡蘿卜素的生物可及性遠高于晶體狀態(tài)的[12]。因此若將姜黃素由晶體狀態(tài)轉變?yōu)槿芙鉅顟B(tài),能較大程度地提高其生物可及性,此外,由于其在油中的溶解度偏低(玉米油0.08 mg/mL)[13],目前絕大多數(shù)油凝膠所負載的姜黃素含量也偏低(0.4%～1%),若鑒于其高熔點,通過高溫加熱使高含量的姜黃素(>1%)完全溶解在玉米油中,有望實現(xiàn)姜黃素的去晶體化、高負載量及較高生物可及性。此外,有研究表明單硬脂酸甘油酯油凝膠中加入司盤20可提高姜黃素的亞穩(wěn)態(tài)溶解度及生物可及性[14],但上述表面活性劑是化學合成的,故本研究擬采用具有良好乳化、分散和滲透性能的天然表面活性劑葵花卵磷脂(sunflower lecithin,SFL)來協(xié)同提高姜黃素的生物可及性。有研究表明SFL的兩親特性可使其在油相或水相中均可對客體分子起到增溶作用,已被作為眾多生物活性成分的載體,如維生素E和姜黃素[15-16]。

本研究以含高溫加熱溶解的姜黃素的玉米油為基料油,小燭樹蠟為凝膠劑,同時加入不同質量分數(shù)SFL(0%、1%、3%、5%、10%)制備負載姜黃素的油凝膠,研究高溫加熱對姜黃素晶體、溶解度及其生物可及性的影響,并探究姜黃素的加入及不同SFL的添加量對小燭樹蠟基油凝膠三維網(wǎng)絡結構、脂解程度和姜黃素生物可及性的改善作用,以期為開發(fā)姜黃素高負載及高生物可及性的功能性食品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

姜黃素,河南中大恒源生物科技有限公司;小燭樹蠟,上海阿拉丁生化科技有限公司;葵花卵磷脂,上海安康精細化工有限公司;玉米油,益海嘉里(南昌)糧油食品有限公司;其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光分度計,北京普析通用儀器有限責任公司;D8 Advance X-射線衍射儀,德國布魯克有限公司;MCR302旋轉流變儀,美國安東帕有限公司;TA型物性測試儀,英國Stable Micro System公司;DM2700P偏振光顯微鏡,德國Leica公司;Pyris Diamond示差掃描量熱儀,美國PE公司;Metrohm 907自動電位滴定儀,瑞士萬通公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 負載姜黃素油凝膠樣品制備

稱取150 g的玉米油,將其置于恒溫磁力攪拌器上加熱至150 ℃后,加入9 g的姜黃素,繼續(xù)加熱攪拌至姜黃素完全溶解(Cur-Oil),之后冷卻至室溫,6 000 r/min離心10 min,取上清液;隨后向上述上清液中加入質量分數(shù)為12%的CLW和不同質量分數(shù)的SFL(0%、1%、3%、5%、10%),90 ℃加熱攪拌30 min后,樣品轉移到4 ℃冰箱中過夜冷卻,獲得不同的油凝膠樣品(0%SFL,1%SFL,3%SFL,5%SFL和10%SFL)。為探究姜黃素對油凝膠特性的影響,參照上述方法制備未添加姜黃素的空白油凝膠(OGCtrl);為探究高溫加熱對姜黃素晶體及消化特性的影響,以未經(jīng)加熱的姜黃素玉米油懸浮液為對照組(oil dispersion)。

1.3.2 微觀結構分析

在室溫下,取適量樣品置于載玻片上,用鑷子將蓋玻片小心地蓋在樣品上,使用連接Canon數(shù)碼相機的偏光顯微鏡觀察油凝膠及姜黃素晶體的微觀形態(tài),并拍照記錄。

1.3.3 差示掃描量熱法分析

稱取5.0～10.0 mg樣品置于坩堝中并密封,以空坩堝為空白對照。將樣品從25 ℃加熱至200 ℃,加熱速率為10 ℃/min,N2流速為40 mL/min[17]。

1.3.4 晶體結構分析

采用X-射線衍射法(X-ray diffraction,XRD)分析樣品晶體結構,將適量的樣品均勻平鋪在檢測片圓孔中,測量過程中使用的儀器參數(shù):Cu-Kα放射源,工作電壓為40 kV,工作電流為30 mA,反發(fā)射狹縫為1.0 mm,接收狹縫為0.1 mm,2θ角的掃描范圍為5°～90°,掃描速度為5°/min,使用軟件Jade 6.0對所得圖譜進行分析。

1.3.5 流變特性的測定

采用配備有PP-50平板夾具的旋轉流變儀對油凝膠的流變特性進行表征[17]。取適量油凝膠于測試臺上,測量時上下板之間的間隙固定為500 μm。首先,進行動態(tài)應變掃描以獲得線性黏彈性區(qū)域,之后在0.01～100 s-1測定凝膠的表觀剪切黏度,隨后對凝膠進行0.1至100 rad/s的頻率掃描以獲得其儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.3.6 硬度測定

取適量油凝膠于10 mL螺口玻璃瓶中,并確保凝膠表面光潔平整,使用質構儀對凝膠進行硬度測定。采用P 0.5R探頭,測前速率為5 mm/s,測中速率為1 mm/s,測后速率1 mm/s,觸發(fā)力為5.0 g,下壓距離為10.0 mm。每個樣品重復測量3次后取平均值。

1.3.7 姜黃素含量的測定

稱取0.1 g的含姜黃素的樣品于2 mL離心管中,隨后加入0.9 mL無水乙醇,8 000 r/min離心5 min后,收集上清液,重復此步驟6次[18]。將收集的上清液用無水乙醇稀釋一定的倍數(shù),在420 nm處測定樣品的吸光度,根據(jù)標準曲線計算得出樣品中姜黃素的濃度。

1.3.8 模擬體外消化

參考CHEN等[19]的方法采用三步模擬消化模型(口腔、胃和腸道)進行體外胃腸道消化實驗。試驗之前,將適量樣品與蒸餾水混合,將最終油脂質量分數(shù)調整至2.7%,隨后加入消化液,在37 ℃以100 r/min振蕩孵育。模擬消化結束后,收集消化液并將其立即放入冰水浴中,冷卻10 min后,將所收集的消化液在4 ℃下以10 000 r/min離心30 min,收集中間膠束層,以三氯甲烷為萃取劑,萃取膠束層中的姜黃素,在420 nm處測定所收集萃取液吸光度,根據(jù)標準曲線計算出姜黃素的濃度。姜黃素的生物可及性可通過先前研究中描述的公式(1)進行計算[19]。

(1)

式中:CInitial,模擬消化系統(tǒng)中姜黃素的初始濃度,mol/L;CMicelle,膠束層中姜黃素的濃度,mol/L。

通過自動電位滴定儀測定小腸消化階段游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的釋放,即自動電位滴定儀在37 ℃下連續(xù)向消化液中添加0.1 mol/L NaOH 以使消化液pH恒定在7.0,從樣品中釋放的FFA的量由消耗的NaOH的體積計算,假設1分子甘油三酯被脂肪酶水解成1個單?；视秃?個FFA。FFA的釋放量根據(jù)公式(2)確定:

(2)

式中:CNaOH,NaOH的摩爾濃度,mol/L;VNaOH,中和游離脂肪酸消耗NaOH的總體積,L;MLipid,脂質的摩爾質量,g/mol;WLipid,樣品中脂質的總質量,g。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗重復3次,數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析,通過單因素方差分析獲得總體顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 微觀結構分析

使用偏正光顯微鏡對姜黃素的溶解狀態(tài),以及油凝膠的晶體形態(tài)及晶體網(wǎng)絡結構進行觀察(圖1)。在Oil dispersion中觀察到明亮的黃色斑點(圖1-a),表明存在姜黃素晶體。但姜黃素經(jīng)150 ℃加熱處理后,負載姜黃素的玉米油及油凝膠均未觀察到姜黃素晶體(圖1-b, 圖1-d～圖1-h),說明高溫加熱可實現(xiàn)姜黃素的去晶體化,此外,經(jīng)測定,這些樣品中姜黃素的含量約為2.7%。另外,觀察到CLW以簇狀晶體的形態(tài)存在,并形成眾多聚集體,這些聚集體相互間作用形成三維凝膠網(wǎng)絡。姜黃素的加入并不會影響凝膠結構(圖1-c, 圖1-d),但加入SFL后,凝膠晶體網(wǎng)絡結構的致密度隨著SFL添加量的增加而降低(圖1-d～圖1-h),這可能是因為磷脂吸附在了CLW晶體的生長點上,從而改變了CLW晶體的形態(tài)和排列方式[20]。

a-Oil dispersion;b-Cur-Oil;c-OGCtrl;d-0%SFL;e-1%SFL;f-3%SFL;g-5%SFL;h-10%SFL

2.2 熱力學特性及晶型分析

為了再次驗證高溫加熱可實現(xiàn)姜黃素的去晶體化及了解SFL對油凝膠樣品晶體結構的影響,對所有樣品進行熱力學和晶型結構分析(圖2)。由圖2-a可見,只有Oil dispersion在176.42 ℃處出現(xiàn)尖銳的峰,即姜黃素晶體熔化[21],這與前面偏振光分析結果一致。圖2-b顯示了Cur-Oil、OGCtrl、0%SFL、1%SFL、3%SFL、5%SFL、10%SFL的XRD圖譜,在這些圖譜中均未出現(xiàn)姜黃素晶體的衍射峰,這一結果再次驗證了姜黃素的去晶體化。此外,在油凝膠的XRD圖譜中,均在0.414和0.373 nm附近出現(xiàn)2個尖銳的衍射峰,表明油凝膠的凝膠晶型為β′型[22],這一結果說明不同濃度的SFL和姜黃素的加入并不會影響油凝膠的晶型。根據(jù)經(jīng)典油脂化學的理論,β′晶型更易形成能夠束縛住大量液體油的三維網(wǎng)絡結構以及構成口感最佳的固體脂肪。

a-熔化曲線;b-XRD圖譜

2.3 流變特性分析

圖3分別為不同油凝膠樣品的剪切掃描和頻率掃描,用于分析不同SFL含量對油凝膠樣品的宏觀結構特性。如圖3-a所示,所有油凝膠的表觀黏度均隨著剪切速率的增加而降低,這一結果可能是因為施加到油凝膠上的剪切力使凝膠結構逐漸分解,并對結構造成不可逆的破壞所導致的[17]。此外,僅僅加入姜黃素并沒有對油凝膠的初始表觀黏度造成顯著性影響,但加入SFL后,油凝膠的初始表觀黏度發(fā)生較大程度的下降,且隨著SFL含量增加而逐步降低,表明SFL的加入會對凝膠質地造成影響。

a-剪切掃描;b-頻率掃描

油凝膠的總G′值可用來反應凝膠強度,如圖3-b所示,OGCtrl的凝膠強度最強,其次是0%SFL,油凝膠的凝膠強度隨著SFL含量的增加而減弱。有研究表明油凝膠的凝膠強度主要與其所含結晶結構的數(shù)量及結晶結構間的交聯(lián)程度有關[23]。研究結果表明油凝膠中SFL含量越高,其所含結晶結構越少,結晶結構間的交聯(lián)程度越弱,凝膠結構越松散,與前面油凝膠微觀結構分析結果一致。此外,在整個頻率范圍內,OGCtrl的G′均小于G″,表現(xiàn)出黏性特征,但加入姜黃素和質量分數(shù)為1%的SFL后,油凝膠的G′大于G″,表現(xiàn)出彈性特征,當SFL的添加量高于3%后,隨著掃描頻率的增加,油凝膠的G′先大于G″,隨后與G″交叉,之后小于G″,表明油凝膠由彈性特征轉變?yōu)轲ば蕴卣鳌Ｒ虼擞湍z的流變學特性可通過SFL的含量來進行調控。

2.4 硬度分析

硬度是在設計遞送體系時需要考慮的一個重要參數(shù),因為它可能會影響油凝膠在消化過程中的分解程度,進而影響所負載的生物活性成分的生物可及性[24]。由圖4-a所示,所有油凝膠經(jīng)倒立放置后,均呈現(xiàn)出固體凝膠的狀態(tài),但它們的硬度存在一定的差異性(圖4-b)。0%SFL的硬度均顯著低于OGCtrl(P<0.05),這可能是因為OGCtrl的表面形成了堅硬的外殼,其在測量過程中觸發(fā)了相當高的阻力,但加入姜黃素后,這一影響在很大程度上被削弱[17]。此外,本研究所制備油凝膠樣品的硬度隨SFL含量的增加而降低,且當SFL的質量分數(shù)從5%增加到10%時,油凝膠的硬度變化差異不顯著(P>0.05),這一結果表明可通過調控SFL的含量對凝膠的機械強度進行調節(jié),進而調節(jié)凝膠的質地和口感,可廣泛應用于固體與半固體食品中。

a-外觀形態(tài);b-及硬度

2.5 體外消化特性分析

油凝膠作為一種負載姜黃素的遞送體系,在人體消化過程中需釋放姜黃素,并達到較高的姜黃素生物可及性,才能實現(xiàn)最終的遞送目的,而油凝膠的脂肪分解程度會直接影響姜黃素的釋放,進而影響姜黃素生物可及性。本研究采用模擬胃腸道模型評估姜黃素經(jīng)去晶體化后、油凝膠內三維凝膠網(wǎng)絡結構以及不同SFL含量對油凝膠的脂解程度和姜黃素生物可及性的影響(圖5)。

由圖5-a所示,在小腸消化階段的前5 min,所有樣品的FFAs釋放速率均急劇增加,可能是因為樣品中存在少量自由分散的小油滴,它們與脂肪酶接觸面積較大。之后,所有樣品的FFAs釋放速率均減慢,但存在一定的差異性。Oil dispersion、Cur-Oil和0%SFL的FFAs釋放速率最為緩慢,但前兩者的最終FFAs釋放量比0%SFL高,表明油凝膠內三維凝膠網(wǎng)絡結構會影響FFAs的釋放,這可能是因為凝膠結構會阻礙脂肪酶進入甘油三酯消化位點,進而影響FFAs的最終釋放量。隨著SFL的加入量增加,FFAs的釋放速率及釋放量在逐漸加快和增多,當SFL的加入量達到10%后,其釋放速率達到最快,釋放量最多,說明SFL的加入及其含量的增加可以加快油脂的脂解速率,這可能是因為在消化過程中,脂解產(chǎn)物聚集在油水界面上,阻礙脂肪酶與內部油脂接觸,但是樣品中所加入的SFL可與消化液中的豬膽鹽形成很多外源性卵磷脂-豬膽鹽混合膠束,其可促進脂解產(chǎn)物增溶于消化液中,達到移除脂解產(chǎn)物的目的,進而提高脂解速率[18]。

生物可及性是衡量生物活性分子從脂質相轉移至混合膠束的百分比,處于混合膠束中的生物活性成分被腸道上皮細胞所吸收利用以實現(xiàn)有效的生物轉化。如圖5-b所示,Cur-Oil的生物可及性是Oil dispersion的2.1倍左右,表明姜黃素經(jīng)去晶體化可顯著地提高其生物可及性。0%SFL的生物可及性比Cur-Oil低,姜黃素生物可及性隨著SFL含量的增加而顯著增加,當SFL含量達到10%時,其生物可及性顯著提高至(42.35±0.25)%(P< 0.05),此外,由圖5-c可知,不同油凝膠樣品的凝膠結構在長時間的機械振蕩和消化酶的作用下逐漸分解,小腸消化結束后,只有10%SFL被完全分解,而其他樣品則具有不同程度的保留,這一結果與前面凝膠硬度及脂解程度分析一致,另外,各樣品消化液的顏色也與其生物可及性對應,其中Oil dispersion消化液經(jīng)10 000 r/min離心30 min后,可以明顯觀察到離心管底部存在大量姜黃素粉末。綜上所述,添加SFL及增加其含量可提高姜黃素生物可及性的原因可能歸因于:(1)SFL含量增加,有利于形成更多溶解姜黃素的膽汁鹽-磷脂酰膽堿混合膠束;(2)凝膠網(wǎng)絡結構的松散程度和凝膠硬度對姜黃素生物可及性有一定影響,凝膠結構越松散,質地越柔軟,越易被脂肪酶分解,進而姜黃素釋放量更高,這與YANG等[25]的研究結果一致。

3 結論

本研究通過對姜黃素進行高溫加熱并添加小燭樹蠟和葵花卵磷脂協(xié)同制備負載姜黃素油凝膠,偏振光、熱力學及XRD分析結果表明姜黃素經(jīng)150 ℃加熱后,實現(xiàn)了姜黃素去晶體化及高負載(含量約2.7%)的目的。添加姜黃素及葵花卵磷脂并不會對凝膠晶型結構產(chǎn)生影響(β′型)。凝膠結構分析結果表明,與空白油凝膠相比,去晶體化姜黃素的加入對油凝膠的凝膠強度及網(wǎng)絡結構無顯著影響,通過調控葵花卵磷脂的添加量可實現(xiàn)對負載姜黃素油凝膠的凝膠結構調節(jié),進而調控其流變及質地特性。體外模擬消化研究結果表明經(jīng)加熱去結晶化姜黃素可顯著提高姜黃素的生物可及性。此外,隨葵花卵磷脂含量的提高,油凝膠的脂解程度及姜黃素生物可及性增加,其中凝膠脂解程度的提升與凝膠網(wǎng)絡結構減弱、硬度降低、便于消化酶的吸附有關,姜黃素生物可及性的增加可歸因于姜黃素的充分釋放及形成膽汁鹽-磷脂酰膽堿混合膠束增多。因此,本研究可為開發(fā)姜黃素高負載及高生物可及性的功能食品提供一些有效見解。