荀冉,盧艷波,楊小雁,馬忠瑪,李國(guó)輝,趙運(yùn)英*,鄧禹*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)3(山東省油脂油料精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東渤海實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,山東 濱州,256500)

隨著畜牧業(yè)的飛速發(fā)展,飼用大豆需求量不斷攀升。但豆粕中存在致敏蛋白和多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,在一定程度上限制了其在飼料加工生產(chǎn)中的應(yīng)用[1]。在已知的38種大豆過敏原蛋白中,由α(58～77 kDa)、α′(58～83 kDa)和β(42～53 kDa)3個(gè)亞基組成的β-伴大豆球蛋白是免疫原性最強(qiáng)的大豆蛋白[2],約占大豆種子全蛋白含量的30%,會(huì)引起幼齡動(dòng)物(如豬和牛等)產(chǎn)生過敏反應(yīng)[3]。

在豆粕飼料加工生產(chǎn)中,通過有效的加工來降低或消除大豆蛋白的抗原性至關(guān)重要。在這其中,β-伴大豆球蛋白中β亞基熱穩(wěn)定性和酶耐受性最強(qiáng),不易在加工過程中完全去除[4]。研究表明,現(xiàn)如今已開發(fā)了多種加工方法和技術(shù),例如熱處理、酶水解、發(fā)酵和糖化等,但熱處理時(shí)過度加熱會(huì)降低賴氨酸和其他必需氨基酸的消化性,其他常規(guī)處理也難以有效除去抗原蛋白。微生物發(fā)酵可以去除抗?fàn)I養(yǎng)因子和致敏蛋白,而不破壞豆粕的營(yíng)養(yǎng)成分[5]。同時(shí),酶水解也是改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象,降低其致敏性,改善其生化功能的有效方法。酶水解可以破壞蛋白質(zhì)肽鏈,產(chǎn)生分子質(zhì)量較低的肽或氨基酸,改變過敏原的線性和空間表位,從而降低蛋白質(zhì)的抗原性[6]?？莶菅堪麠U菌是一種常見的重要發(fā)酵劑,可產(chǎn)生各類酶,如堿性蛋白酶、淀粉酶等,利用枯草芽胞桿菌制備發(fā)酵豆粕,可將豆粕中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸和肽類等物質(zhì),顯著降低致敏蛋白和抗?fàn)I養(yǎng)因子[7-8]。

如何準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)豆粕中抗原蛋白的含量目前仍然是個(gè)難題。這對(duì)于評(píng)價(jià)豆粕產(chǎn)品的功效和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要的意義,也是確定最佳豆粕發(fā)酵工藝的重要基礎(chǔ)。目前常見的蛋白檢測(cè)方法包括SDS-PAGE、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、HPLC法等。現(xiàn)有的β-伴大豆球蛋白的檢測(cè)技術(shù)的主要開發(fā)思路以抗原免疫反應(yīng)為主,朱婷偉等[9]采用自制的兔抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,YOU等[10]基于單克隆抗體6G4建立了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法,檢出限為2.0 ng/mL。這些方法雖然在特異性、靈敏性方面各有優(yōu)勢(shì),但均對(duì)分析條件有比較高的要求,抗體血清的制備比較復(fù)雜,且實(shí)驗(yàn)室差異無法保證重復(fù)性,很難實(shí)際應(yīng)用于豆粕樣品的快速檢測(cè)[11]。近年來,靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)使適配體傳感器在分析方法中得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用[12]。因此,本實(shí)驗(yàn)室篩選能夠與β-伴大豆球蛋白β亞基特異性結(jié)合的核酸適配體,選用納米金作為比色探針,構(gòu)建了納米金適配體比色傳感器,實(shí)現(xiàn)了β亞基的快速檢測(cè),為發(fā)酵豆粕過程評(píng)價(jià)抗原蛋白含量奠定基礎(chǔ)[13-15]。該傳感器在靈敏度和檢測(cè)效率方面具有優(yōu)異的性能,β亞基的檢測(cè)范圍為7～58 nmol/L,檢測(cè)限為2.58 nmol/L。其與ELISA檢測(cè)β-伴大豆球蛋白的回收率相似,并且省去制備血清的繁瑣步驟。

本研究旨在使用納米金適配體生物傳感器評(píng)估豆粕發(fā)酵過程中的抗原蛋白含量,以β-伴大豆球蛋白的降解率為指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化枯草芽胞桿菌等多種菌株、發(fā)酵方式、發(fā)酵酶等關(guān)鍵發(fā)酵條件,最終獲得豆粕發(fā)酵的最佳工藝參數(shù),并結(jié)合SDS-PAGE方法對(duì)比驗(yàn)證傳感器檢測(cè)結(jié)果的正確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽胞桿菌CCTCC10071、枯草芽胞桿菌CCTCC20522、副干酪乳桿菌DY2(CCTCC2017303)、植物乳桿菌DY6(CCTCC2017138),中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;釀酒酵母BY4741、植物乳桿菌DY1、干酪乳桿菌DY13,實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 材料和設(shè)備

乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏、吐溫-80、檸檬酸三銨、葡萄糖、氯金酸、檸檬酸鈉、NaCl、HCl、冰醋酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Na2SO3、堿性蛋白酶,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;豆粕,益海嘉里投資有限公司;適配體的序列為AACACGACCACGCTGTGACGGACACAGGTTGGCAG-CGTCGTG(5′-3′),安升達(dá)生物技術(shù)有限公司。

SynergyH1多功能檢測(cè)儀,美國(guó)BioTek有限公司;ST 16R高速冷凍離心機(jī),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;LF-Min-i4小型垂直電泳槽,美國(guó)Bio-Rad公司;1260氨基酸專用HPLC儀,美國(guó)Agilent公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

枯草芽胞桿菌培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨10.0,葡萄糖10.0,NaCl 5.0,pH 7.0,1×105Pa 滅菌30 min。

YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母浸出粉10.0,蛋白胨20.0,葡萄糖20.0,1×105Pa滅菌30 min。

MRS培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏8.0,酵母浸出粉4.0,葡萄糖20.0,K2HPO42.0,檸檬酸三銨2.0,乙酸鈉5.0,MgSO4·7H2O 0.58,MnSO4·4H2O 0.25,吐溫-80 1 mL,pH 6.3～6.5,1×105Pa滅菌30 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵菌株的選擇

將實(shí)驗(yàn)室保藏菌種按照體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到合適的培養(yǎng)基,在適宜培養(yǎng)溫度下活化24 h,按照同樣的方式活化2～3代,繼續(xù)于培養(yǎng)基中培養(yǎng),得到發(fā)酵菌的菌液。

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的所列發(fā)酵菌株對(duì)數(shù)期的菌液混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,同時(shí)以不添加菌液組為空白對(duì)照,30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h。70 ℃烘干、粉碎,測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.2 發(fā)酵方式的優(yōu)化

選取優(yōu)化獲得最佳菌株,將其按照體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種到培養(yǎng)基中,30 ℃活化24 h,按照同樣的方式活化2～3代,繼續(xù)培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液。

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及5%的菌液以及堿性蛋白酶(200 U/g)混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,分別做不添加菌液或蛋白酶的發(fā)酵組,30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵60 h。70 ℃烘干、粉碎,測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.3 蛋白酶添加量的優(yōu)化

控制水、糖蜜及菌液的添加量不變,分別添加25、50、100、200、400 U/g的蛋白酶37 ℃發(fā)酵60 h,70 ℃下烘干、粉碎,測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.4 菌液接種量的優(yōu)化

控制豆粕中的水、糖蜜及堿性蛋白酶的添加量不變,分別接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、5%、7%、10%、20%、30%的菌液,30 ℃發(fā)酵60 h,70 ℃烘干、粉碎,測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.5 固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

將豆粕與質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50%的水、3%的糖及7%的菌液以及堿性蛋白酶(200 U/g)混合均勻后置于無菌處理的自封袋中,30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵12、24、36、48、60、72、84 h。70 ℃烘干、粉碎,測(cè)定樣品中β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.6 納米金適配體傳感器檢測(cè)β-伴大豆球蛋白降解率

納米金膠體溶液是根據(jù)經(jīng)典的檸檬酸還原法合成的[12]。需先將氯金酸(100 mL,0.1 g/L)的水溶液加熱沸騰2 min,攪拌速度為250 r/min,再快速加入檸檬酸鈉溶液(3.5 mL,10 g/L),沸水浴15 min,最后使反應(yīng)液冷卻至室溫即可,于4 ℃下避光保存。

將100 μL納米金溶液與20 μL 0.5 μmol/L適配體混合后孵育20 min,隨后加入20 μL 0.3 mol/L NaCl反應(yīng)5 min,再加入20 μL合適的稀釋倍數(shù)的豆粕樣品上清液并反應(yīng)25 min,使用SynergyH1多功能檢測(cè)儀在600和520 nm處測(cè)量吸光度,以已完全發(fā)酵降解蛋白的豆粕測(cè)定值為分母,根據(jù)吸光值A(chǔ)600/A520變化程度計(jì)算得到β-伴大豆球蛋白降解率。

1.2.7 SDS-PAGE驗(yàn)證

將1.0 g豆粕樣品溶于15 mL裂解蛋白溶液(0.03 mol/L Tris-HCl,15 g/L SDS,0.1 mol/L Na2SO3),反應(yīng)2 h,12 000 r/min離心7 min后取上清液。采用10%聚丙烯酰胺分離凝膠進(jìn)行電泳。在電泳前,將上清液與樣品加載緩沖液(5×)在水浴下加熱10 min。轉(zhuǎn)移到每個(gè)孔中的蛋白質(zhì)分散體的量約為10 μL,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白條帶。

1.2.8 氨基酸含量檢測(cè)

稱取1.0 g豆粕于具塞試管中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸定容至25 mL,常溫超聲波處理20 min后靜置2 h,用雙層濾紙過濾。取1 mL澄清濾液,15 000 r/min離心30 min,上清液用0.22 μm水膜再次過濾,使用HPLC儀檢測(cè)。

1.2.9 有機(jī)酸含量檢測(cè)

取1.0 g豆粕于50 mL離心管中,加入10 mL去離子水,漩渦振蕩15 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,進(jìn)行液相檢測(cè)。分析柱用有機(jī)酸柱(Aninex Hpx-87H ion exchange column)柱溫50 ℃,流動(dòng)相5 mmol/L H2SO4溶液,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,標(biāo)樣及樣品每個(gè)跑27 min。根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積計(jì)算樣品中各種有機(jī)酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的選擇

微生物發(fā)酵能有效消除豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子,并通過產(chǎn)生蛋白水解酶將豆粕中的大分子蛋白降解為易吸收的小分子蛋白,提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[16]。常見的豆粕發(fā)酵所用菌種包括枯草芽胞桿菌[7]、植物乳桿菌[17]、釀酒酵母[5]等。比較不同菌株固態(tài)發(fā)酵降解豆粕β-伴大豆球蛋白β亞基的效果,如圖1-a所示,固態(tài)發(fā)酵豆粕120 h后,枯草芽胞桿菌20522發(fā)酵豆粕的蛋白降解率可達(dá)41.08%,其次是枯草芽胞桿菌10071,為34.86%。整體來看枯草芽胞桿菌在降解致敏蛋白方面的效果優(yōu)于釀酒酵母、植物乳桿菌等。圖1-b的SDS-PAGE結(jié)果顯示,2組枯草芽胞桿菌發(fā)酵豆粕的β亞基條帶相對(duì)更淺,降解程度更高,而α亞基也部分降解。通過圖1-c目的蛋白條帶灰度的歸一化分析來看,枯草芽胞桿菌,尤其是20522菌株,目的蛋白占比最低,說明其含量低、降解度更高,這與傳感器的檢測(cè)結(jié)果相似。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)于不同菌種發(fā)酵豆粕的研究顯示,不同菌種降解抗原蛋白的效果與其最適生長(zhǎng)環(huán)境和分泌的蛋白酶有關(guān),枯草芽胞桿菌往往在固態(tài)發(fā)酵條件下占據(jù)優(yōu)勢(shì)[16]。YIN等[8]研究發(fā)現(xiàn)從枯草芽胞桿菌中分離的堿性蛋白酶可使β-伴大豆球蛋白抗原性有效降低?？莶菅堪麠U菌的堿性蛋白酶被歸類為絲氨酸肽酶,其水解位點(diǎn)是疏水氨基酸的碳末端,可通過破壞抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)和表位構(gòu)象,使其降低或失去與特異性抗體結(jié)合的能力[18]。因此,選擇枯草芽胞桿菌20522作為最佳發(fā)酵菌。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE譜圖;c-SDS-PAGE蛋白條帶灰度分析

2.2 發(fā)酵方式優(yōu)化

菌發(fā)酵、酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵是常見的豆粕固態(tài)發(fā)酵方法。除了微生物發(fā)酵,添加外源酶也可以促進(jìn)大豆蛋白活性等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解。眾所周知,酶解不僅破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),而且對(duì)破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著作用。根據(jù)COSCUETA等[19]的報(bào)道,酶水解脫脂大豆粉蛋白會(huì)降低其致敏性,最適合用于此的酶是堿性蛋白酶。但單純通過酶水解生產(chǎn)的小肽具有明顯苦味,生產(chǎn)成本高,限制了其開發(fā)利用[20]。

如圖2-a所示,菌酶協(xié)同組發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白β亞基的降解程度最高,可達(dá)51.35%,其次是酶發(fā)酵,降解率為45.61%。而菌降解蛋白在固態(tài)發(fā)酵過程中效果一般,表明蛋白酶是影響發(fā)酵過程中蛋白降解的主要因素。從圖2-b的SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果可以看出,菌發(fā)酵的豆粕蛋白條帶比較完整,酶發(fā)酵和菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的蛋白條帶大部分已經(jīng)降解。圖2-c灰度分析結(jié)果顯示,蛋白含量從小到大依次是菌酶協(xié)同發(fā)酵(0.38)<酶發(fā)酵(0.43)<菌發(fā)酵(0.86),這與納米金適配體傳感器檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)基本吻合。據(jù)研究報(bào)道,菌酶協(xié)同發(fā)酵可以利用微生物分泌的酶系與外加酶共同作用處理豆粕,同時(shí)添加的蛋白酶大大提高了發(fā)酵培養(yǎng)基的整體蛋白酶活性,促進(jìn)了發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)、酶的分泌和糖的代謝,提高了發(fā)酵效率和質(zhì)量[21-22],這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE譜圖;c-SDS-PAGE蛋白條帶灰度分析

2.3 酶添加量?jī)?yōu)化

HENG等[21]發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中蛋白酶的活性主要受微生物分泌蛋白酶的量、pH值、微生物分泌的酶對(duì)蛋白酶的降解以及某些酶抑制成分等因素的影響。在菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝條件下,圖3-a中隨著堿性蛋白酶酶量的增加,β-伴大豆球蛋白β亞基的降解率呈上升趨勢(shì)。其中,50～200 U/g添加量間的降解效率提升最為明顯,在此區(qū)間內(nèi)酶解底物是過量的,加酶量越多,酶解反應(yīng)產(chǎn)物就越多。此后隨著酶添加量增加,降解程度變化較小,說明酶解底物反應(yīng)趨于飽和,添加過多蛋白酶并沒有較好的降解效果,還會(huì)造成蛋白酶的浪費(fèi)[21]。經(jīng)過60 h發(fā)酵,200 U/g酶添加量組豆粕β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)61.94%。SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖3-b),隨著酶量的增加,β-伴大豆球蛋白β亞基條帶逐漸變淺,當(dāng)酶量≥100 U/g時(shí)效果更為明顯。因此,選擇200 U/g作為堿性蛋白酶的最佳添加量。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE圖譜

2.4 菌液接種量?jī)?yōu)化

由圖4-a可知,隨著枯草芽胞桿菌20522接種量的增加,發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)枯草芽胞桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí),降解率最高達(dá)到62.78%;當(dāng)枯草芽胞桿菌接種的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時(shí),發(fā)酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在類似的枯草芽胞桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的研究中,也存在隨著菌液接種量的增加,發(fā)酵豆粕肽含量先增加隨后下降的現(xiàn)象,這可能是因?yàn)樾‰暮肯入S發(fā)酵降解蛋白而增加,隨后又被分解成更小的片段而導(dǎo)致出現(xiàn)下降[23]。常見的豆粕發(fā)酵工藝中添加枯草芽胞桿菌菌液接種量大多在5%～15%[24-25]。因此,選擇7%作為枯草芽胞桿菌20522最佳接種量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。此外,在β-伴大豆球蛋白降解程度較高時(shí),SDS-PAGE圖譜難以觀察出組間差異,而納米金適配體傳感器的檢測(cè)結(jié)果則能夠清晰、靈敏的反映出各實(shí)驗(yàn)組豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率。

a-β-伴大豆球蛋白降解率;b-SDS-PAGE圖譜

2.5 固態(tài)發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

發(fā)酵過程包括微生物的生長(zhǎng)、代謝和物質(zhì)的降解。這一過程需要一定的時(shí)間,但過度延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致有害細(xì)菌污染和發(fā)酵成本增加等問題[21]。如圖5所示,在堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽胞桿菌20522菌液接種量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))7%、料水比2∶1(g∶mL)、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下,發(fā)酵48 ～60 h,蛋白降解率有明顯提升。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加降解率趨于平穩(wěn),在最佳發(fā)酵時(shí)間72 h時(shí)達(dá)到最高值75.27%。根據(jù)菌酶協(xié)同發(fā)酵的相關(guān)研究,在發(fā)酵開始時(shí),添加的蛋白酶和發(fā)酵菌株分泌的蛋白酶協(xié)同降解蛋白質(zhì)。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH逐漸降低,發(fā)酵微生物生長(zhǎng)緩慢,蛋白酶活性逐漸喪失,因此蛋白降解效率減慢[21, 26]。另一方面,抗原性下降的程度取決于抗原位點(diǎn)的破壞程度。YIN等[8]發(fā)現(xiàn)β-伴大豆球蛋白的抗原性在酶解后期略有增加而不是降低,是由于蛋白酶進(jìn)一步水解肽暴露了一些線性或隱性表位,或者抗原活性低的肽繼續(xù)水解成高活性的小片段。因此,菌酶協(xié)同發(fā)酵是降低致敏性的有效方法。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆粕β-伴大豆球蛋白降解率的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on degradation of β-conglycinin in soybean meal

2.6 豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)分析

2.6.1 游離氨基酸含量

如圖6所示,經(jīng)過200 U/g堿性蛋白酶和7%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的枯草芽胞桿菌協(xié)同發(fā)酵72 h,豆粕總游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.50%,提高了3.96倍。其中必需氨基酸關(guān)乎飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)劣,其含量為原來的9.25倍,整體增長(zhǎng)幅度較非必需氨基酸更為明顯,能有效地提高飼料蛋白質(zhì)的利用率。在發(fā)酵豆粕的必需氨基酸中,賴氨酸(Lys)含量最高(0.37%),其次是亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)等,色氨酸(Trp)和半胱氨酸(Cys)含量最低。大部分氨基酸含量經(jīng)過發(fā)酵后均升高,尤其是Lys和蛋氨酸(Met)的含量分別為原來的17.27倍和7.73倍。Lys和Met是豬、雞飼料中最重要的2個(gè)限制性氨基酸,對(duì)家禽等的生長(zhǎng)發(fā)育及其他所有氨基酸的消化吸收均有關(guān)鍵影響[27-28]。同時(shí),據(jù)NISHIWAKI等[29]報(bào)道,當(dāng)肽段中疏水性氨基酸含量高時(shí),肽的苦味相當(dāng)強(qiáng)烈,而本研究中蛋白所含的疏水性氨基酸,如Val、Leu、Phe、異亮氨酸(Ile)等,在蛋白降解時(shí)從肽段中被釋放,從而消除了豆粕的苦味。另一方面,β-伴大豆球蛋白含有大量的谷氨酸(Glu),豆粕發(fā)酵后游離Glu的含量顯著提高2.55倍。這也證實(shí)了β-伴大豆球蛋白在菌酶協(xié)同發(fā)酵中確實(shí)發(fā)生了明顯的降解。YANG等[30]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌對(duì)氨基酸含量的提升相較于其他微生物中具有優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果表明,本研究的最優(yōu)發(fā)酵工藝對(duì)蛋白質(zhì)的降解效果顯著,氨基酸含量趨于營(yíng)養(yǎng)均衡,顯著提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

a-必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸含量;b-18種常見氨基酸含量

2.6.2 有機(jī)酸含量

有機(jī)酸作為畜禽的飼料添加劑,可直接參與機(jī)體代謝并提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率,如檸檬酸、蘋果酸、乳酸等部分有機(jī)酸可直接參與機(jī)體能量、結(jié)構(gòu)和酶促反應(yīng)。另一方面,有機(jī)酸還可以調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng),延長(zhǎng)發(fā)酵后豆粕的保質(zhì)期。微生物發(fā)酵是產(chǎn)生有機(jī)酸的有效途徑,HENG等[21]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中添加的蛋白酶能有效地促進(jìn)糖代謝,分泌更多的有機(jī)酸,引起的pH值下降并防止腐敗和病原微生物增殖。如圖7所示,經(jīng)過菌酶協(xié)同發(fā)酵處理后的發(fā)酵豆粕中各有機(jī)酸含量均有所提高。根據(jù)毛銀等[31]的研究,不同發(fā)酵工藝的豆粕有機(jī)酸含量有較大的差別,以乳酸、乙酸和檸檬酸這3種有機(jī)酸為主?？莶菅堪麠U菌和堿性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕中含量最高的是檸檬酸,由原來的2.68%提高到5.54%。乳酸也是衡量豆粕質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,其具有維持動(dòng)物腸道菌群平衡,減少腹瀉,促進(jìn)鈣質(zhì)的吸收等功能,豆粕經(jīng)過發(fā)酵后乳酸含量達(dá)到1.62%,提高了17.72倍。乙酸含量達(dá)到1.01%,其作為抗微生物劑、酸度調(diào)節(jié)劑和酸味劑,提高了飼料的適口性。除此之外,發(fā)酵還產(chǎn)生了丙酸和蘋果酸,含有多種有機(jī)酸的豆粕可以有效的抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng),提高機(jī)體的免疫力。

圖7 豆粕發(fā)酵對(duì)有機(jī)酸含量的影響Fig.7 Effect of fermentation on organic acid content in soybean meal

3 結(jié)論

本研究利用新型納米金適配體傳感器從抗原蛋白降解的角度評(píng)價(jià)豆粕發(fā)酵過程。通過測(cè)定β-伴大豆球蛋白降解率,指導(dǎo)優(yōu)化枯草芽胞桿菌20522/堿性蛋白酶菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝,最終確定了最適發(fā)酵條件為:堿性蛋白酶加酶量200 U/g、枯草芽胞桿菌20522菌液接種量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))7%、料水比2∶1(g∶mL)、糖蜜質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間72 h。該菌酶協(xié)同工藝在發(fā)酵豆粕降解致敏蛋白方面效果良好,β-伴大豆球蛋白降解率可達(dá)75.27%,此外氨基酸含量提高3.96倍,乳酸、檸檬酸、乙酸等有機(jī)酸的含量也有所上升,發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性得以顯著改善。同時(shí),本研究驗(yàn)證了納米金適配體傳感器在評(píng)價(jià)豆粕抗原蛋白降解方面具有良好的特異性、穩(wěn)定性和適用性,為其在飼料行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考及實(shí)踐指導(dǎo)。