宋偉艷,佟毅,李義,陶進*,梁穎超,劉松*,李江華

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(吉林中糧生化有限公司 玉米深加工國家工程研究中心,吉林 長春,130033)

生淀粉酶是一類可以在低于淀粉糊化溫度下,直接作用于淀粉顆粒的水解酶類[1],包括α-淀粉酶、生淀粉糖化酶[2]、生淀粉普魯蘭酶等。其中生淀粉糖化酶(raw starch glucoamylase,RSGA)作為降解淀粉過程中最重要的淀粉酶之一,可以從淀粉分子非還原端依次水解α-1,4糖苷鍵,產(chǎn)物僅為葡萄糖。在低溫條件下直接降解淀粉不僅能簡化生產(chǎn)工藝,提高生產(chǎn)效率,而且降低了能源消耗,具有廣闊的應用前景。已報道的生淀粉糖化酶主要來源于黑曲酶[1]、米曲霉[3]、青霉菌[4]等,可以降解不同種類的生淀粉顆粒。然而,目前RSGA對生淀粉降解催化效率低,酶的最適反應溫度較高,大都處于65～75 ℃[2, 5],難以實現(xiàn)大規(guī)模應用。

N-糖基化修飾是蛋白質(zhì)生物合成中常見的翻譯后修飾之一[6]。通常氨基酸序列具有Asn-Xaa-Ser/Thr的排列特征,其中Xaa為除Pro以外的任意氨基酸[7]。蛋白糖基化途徑關鍵酶為寡糖轉移酶,它對Asn-Xaa-Thr的偏好高于Asn-Xaa-Ser。據(jù)文獻報道,前者的糖基化頻率是后者的2～3倍[8]。一系列的研究強調(diào)了Asn-Xaa-Thr對蛋白質(zhì)催化效率的關鍵作用。例如,在56位點引入Asn-Xaa-Thr基序后,內(nèi)切葡聚糖酶對CMC-Na和β-D-葡聚糖的催化效率(kcat/Km)分別提高到原來的1.20和1.28倍[9]。另外,前期對Aspergillusfumigatus來源的RSGA糖基化研究中,在113位點引入Asn-Xaa-Thr糖基化基序,突變體Q113T生玉米淀粉的降解效率提高21%[10]。因此,通過將糖基化基序中Ser突變?yōu)門hr,可能是一種提高RSGA催化效率有效的方法。

在以前研究中,我們成功在KomagataellaphaffiiGS115中表達A.fumigatus來源的RSGA,并發(fā)現(xiàn)糖基化對RSGA降解生淀粉的效率具有重要作用[5]。為提高RSGA對生玉米淀粉的催化效率,本研究基于NetNGlyc 1.0分析,將3個具有Asn-Xaa-Ser糖基化基序特征的位點替換為Asn-Xaa-Thr形式,通過對突變體酶學性質(zhì)進行分析,獲得催化效率提高的突變體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109 (Invitrogen, Carlsbad, USA) 用于基因克隆,E.coliBL21(DE3) 為大腸桿菌表達宿主,K.phaffiiGS115 (His-) (Invitrogen, Carlsbad, USA) 為酵母表達宿主。pPIC9K/α-RSGA和質(zhì)粒pET20b(+)/S-RSGA 質(zhì)粒為前期研究所構建并保存[5]。

1.1.2 引物

該研究中使用的引物如表1所示。

1.1.3 試劑

Primer STAR DNA聚合酶、Primer STARMAX DNA聚合酶、SalI快切酶、DpnI消化酶,TaKaRa公司(大連);柱回收試劑盒、膠回收試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白電泳試劑盒、標準蛋白,Invitrogen;質(zhì)粒提取試劑盒、無氨基酵母氮源(不含氨基酸)、氨芐青霉素、卡納霉素、G418及瓊脂糖,生工生物工程(上海)股份有限公司;玉米淀粉,吉林中糧生化有限公司;蛋白胨和酵母粉,OXIOD公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 10,pH 7.0。固體培養(yǎng)基在此基礎上添加2%瓊脂粉。

TB(Terrific-Broth)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油5,蛋白胨12,酵母粉24,KH2PO42.31,K2HPO416.37。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB)(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖 20。

甘油緩沖復合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,甘油10,無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB) 13.4,生物素 4×10-4,pH 6.0的磷酸鉀緩沖液 0.1 mol/L,其中YNB、生物素采用膜過濾除菌。

誘導表達培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY) (g/L):酵母提取物 10,蛋白胨 20,甲醇 10,YNB 13.4,生物素 4×10-4,甲醇 10,pH 6.0的磷酸鉀緩沖液 0.1 mol/L。

最小糊精酶固體培養(yǎng)基(minimal extrase medium, MD) (g/L):葡萄糖 20,YNB 13.4,生物素 4×10-4,瓊脂 20。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變體質(zhì)粒的構建

基于PCR原理進行重組質(zhì)粒的構建。以質(zhì)粒pPIC9K/α-RSGA和pET20b(+)/S-RSGA為模板,分別使用引物對S123T-F/R、S424T-F/R和S612T-F/R進行質(zhì)粒擴增,將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化模板后回收并轉化至JM109,涂布于含100 μg/mL氨芐抗生素的LB固體平板。經(jīng)菌落PCR驗證后將正確的菌落進行質(zhì)粒提取和序列鑒定,獲得重組質(zhì)粒20b-S123T、20b-S424T、20b-S612T、9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T。質(zhì)粒提取參考試劑盒說明書,測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本研究使用的引物見表1。

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉化與培養(yǎng)

將重組質(zhì)粒20b-S123T、20b-S424T和20b-S612T轉化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài),涂布在氨芐抗性的LB固體平板并置于37 ℃培養(yǎng)箱9～12 h。將平板上出的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基并在37 ℃培養(yǎng)8～9 h,接下來以4%接種量轉接到TB發(fā)酵培養(yǎng)基,待OD600值達到1時添加0.1 mmol/L IPTG進行誘導,并在20 ℃培養(yǎng)48 h,于不同時間取樣并測定酶活性。

將重組質(zhì)粒9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T經(jīng)SalI線性化并回收酶切產(chǎn)物。在電壓1 500 V、電容25 μF及電阻200 Ω條件下電擊轉化K.phaffiiGS115,涂布于MD平板并放置于30 ℃培養(yǎng)箱待轉化子生長。長出單菌落轉接到含有4 mg/mL G418的YPD平板,最終獲得3個突變體S123T、S424T和S612T。將以上突變體接種在裝有40 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃培養(yǎng)24 h。收集發(fā)酵液并離心,用無菌生理鹽水將菌體洗滌2～3次后重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基當中,30 ℃甲醇誘導蛋白表達,發(fā)酵120 h,不同時間取樣測定酶活力。

1.2.3 重組蛋白的純化

將發(fā)酵結束的樣品經(jīng)4 000×g離心10 min并收集上清液。使用鎳親和層析純化柱(GE Healthcare)進行蛋白及突變體的分離純化。目標蛋白在75 mmol/L咪唑條件下洗脫下來。樣品經(jīng)脫鹽柱(GE Healthcare)脫鹽,獲得最終的純酶。

1.2.4 最適反應溫度及穩(wěn)定性測定

將純化后的純酶分別在40、50、60、70、80 ℃條件下反應10 min,以可溶性淀粉為底物,pH 4.6的醋酸鈉緩沖液中測定糖化酶活性,以最高酶活力為100%計算其他溫度下的相對值[11]。將同樣濃度的純酶在60 ℃條件下保溫120 min,每間隔30 min取樣并測定殘余酶活力,以未處理前的酶活力為100%。

1.2.5 動力學參數(shù)的測定

動力學參數(shù)的測定在含有0～2%生玉米淀粉的醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH 4.6)中進行[12]。使用OriginPro 2021b進行非線性回歸曲線的擬合。

1.2.6 酶活力的測定

糖化酶活力測定:底物為2%可溶性淀粉溶液,反應體系為400 μL底物,400 μL pH 4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液,200 μL酶液,于40 ℃反應10 min后,立即加入1 mL二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)終止反應,用DNS法測定體系中產(chǎn)生的還原糖(以葡萄糖計),對照為滅活后酶液,依據(jù)葡萄糖標準曲線,計算酶活反應體系中產(chǎn)生還原糖[13]。

糖化酶酶活力定義:在pH 4.6,40 ℃反應條件下,1 min水解2%可溶性淀粉溶液產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

生淀粉糖化酶酶活力測定:以2%的生玉米淀粉懸浮液作為底物(用pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖液配制),反應體系為20 mL底物,0.5 mL酶液,于40 ℃反應60 min,立即加入0.5 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應,對照為滅活后酶液,反應結束后反應液于8 000 r/min離心5 min,上清液用DNS法測定還原糖濃度(以葡萄糖計)。

生淀粉糖化酶酶活力定義:在pH 4.6,40 ℃反應條件下,1 h水解2%生玉米淀粉懸浮液產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)[13]。

1.2.7 蛋白分析

使用BCA試劑盒(天根生物,北京)測定純化蛋白濃度。采用120 g/L聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE分析,并使用考馬斯藍R-250染色,分子凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶。蛋白去糖基化反應體系為混合7 μL純酶(2～10 μg蛋白)、1 μL 10×糖苷緩沖液3和2 μL endo-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H(Endo H, New England Biolabs, USA),將該體系放置在37 ℃金屬浴處理12 h,樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.8 生物信息分析

N-糖基化位點預測通過在線網(wǎng)站NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)進行分析?；赥richodermareesei葡萄糖淀粉酶(PDB ID:2vn4)的晶體結構,通過I-TASSER (https://zhanggroup.org/ITASSER/)生成RSGA的模型結構。

2 結果與分析

2.1 糖基化位點預測及分析

N-糖基化是畢赤酵母中常見的翻譯后修飾,且不同糖基化基序產(chǎn)生的糖基化效果具有一定差異[8]。通過RSGA氨基酸序列分析及糖基化位點預測發(fā)現(xiàn)自身存在有2個糖基化位點N422(Asn422-Gly423-Ser424)和N610 (Asn610-Arg611-Ser612),均為Asn-Xaa-Ser形式的糖基化基序。為優(yōu)化糖基化位點,將Ser424和Ser612分別替換為Thr,獲得突變體S424T和S612T。通過NetNGlyc 1.0 Server對突變后序列進行糖基化位點預測,結果顯示突變體S424T糖基化預測閾值由0.541 1提高到0.610 2;突變體S612T預測閾值由0.515 0提高到0.581 4,表明氨基酸替換為Thr后被糖基化的效率更高(表2)。另外RSGA還存在一個特殊的糖基化位點N121(Asn121-Pro122-Ser123),將其糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr形式,N-糖基化評估結果顯示,該位點由原先的非糖基化位點轉變?yōu)樘腔稽c(表2)。RSGA模擬結構顯示糖基化位點處于不同結構域,N121位于不規(guī)則loop區(qū),N422位于催化結構域的α-螺旋,N610則處于淀粉結合域(圖1)。

圖1 RSGA潛在糖基化位點Fig.1 The potential N-glycosylation sites presented in the modeled structure of RSGA注:實線框為催化結構域;虛線框為淀粉結合域。

表2 RSGA糖基化位點的預測Table 2 Prediction of N-glycosylation sites in RSGA

2.2 突變體表達純化與糖基化分析

K.phaffii表達系統(tǒng)具有天然的蛋白翻譯后修飾系統(tǒng)[6],是蛋白異源表達的優(yōu)勢宿主之一[14]。通過定點誘變方式構建獲得重組質(zhì)粒9K-S123T、9K-S424T和9K-S612T,經(jīng)SalI線性化轉化至K.phaffii進行糖基化修飾,獲得突變體S123T、S424T和S612T。由于K.phaffii表達的重組蛋白C端均融合有6×His標簽,因此通過鎳親和層析完成重組蛋白的純化。N-糖基化在不同酶之間存在顯著差異可導致酶在SDS-PAGE上的蛋白條帶變化。使用去糖基化酶EndoH對純酶進行處理,如SDS-PAGE分析所示,RSGA以及突變體條帶上方均出現(xiàn)不同程度的彌散現(xiàn)象,分為主條帶和彌散條帶(圖2)。通常情況下在主條帶上面存在彌散條帶意味著發(fā)生不均一的糖基化[15]。對于RSGA,EndoH去糖基化僅去除彌散條帶,不影響其主條帶的位置,主要發(fā)生異質(zhì)糖基化。EndoH處理前后,S424T和S612T顯示出與RSGA相同的蛋白帶模式。而突變體S123T糖基化效果顯著,經(jīng)Endo H處理后,很明顯由原先的兩條帶變成一條帶,且條帶大小與主條帶相近,表明該突變體發(fā)生異質(zhì)糖基化[16]。

圖2 糖基化突變體SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of RSGA and mutants

2.3 糖基化對酶的比酶活力的影響

前期研究中,通過組合突變?nèi)コ齊SGA存在的糖基化修飾,結果引起比酶活力的急劇下降[5],表明糖基化修飾對RSGA催化活性的重要性。將RSGA氨基酸序列中存在的Asn-Xaa-Ser糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr,能有效促進其比酶活力的提高。以生玉米淀粉為底物,在40 ℃,pH 4.6條件下測定的突變體活性以及蛋白濃度結果如圖3-a所示。突變體S123T和S424T生淀粉酶活力分別是RSGA酶活力的1.25倍和1.02倍。此外,相同處理條件下,突變體S123T的蛋白表達量提高了9.3%。進一步對突變體的比酶活力分析發(fā)現(xiàn),它們都有不同幅度的提高(圖3-b)。突變體S424T和S612T比酶活力較RSGA分別提高10%和5%。另外,引入的糖基化突變體S123T對生玉米淀粉的催化活性提高17%,這可能是由于淀粉鏈和附著在Asn121上的額外聚糖鏈之間的動態(tài)相互作用,促進了酶與底物之間的降解反應。此外,將突變體在E.coliBL21(DE3)中表達,排除殘基突變帶來的影響。對重組突變體酶的比酶活力進行表征發(fā)現(xiàn),突變體比酶活力呈現(xiàn)下降趨勢,表明在S123T、S424T和S612T的催化反應中糖基化起積極作用,而不是殘基突變(圖3-b)。

a-RSGA及突變體酶活力和蛋白質(zhì)量濃度分析;b-RSGA及突變體在K.phaffii和E.coli表達后的比酶活力

2.4 糖基化對酶熱穩(wěn)定性的影響

已有研究表明,糖基化會影響酶的穩(wěn)定性。將纖維二糖水解酶中的糖基化位點Asn384突變后,該酶在62 ℃條件下失活速度加快[17],表明糖基化修飾對穩(wěn)定性具有促進作用。然而,在內(nèi)切葡聚糖酶的63位點引入Asn-Xaa-Thr糖基化基序后,酶的熱穩(wěn)定性降低[9]。因此,為進一步明確優(yōu)化后糖基化位點對RSGA酶學性質(zhì)的影響,以可溶性淀粉為底物,測定RSGA和糖基化突變體的最適反應溫度和在60 ℃下酶的穩(wěn)定性。首先分析突變體的最適反應溫度,在不同反應溫度下孵育10 min后測定酶活力(40～80 ℃)。結果如圖4-a所示,突變體S123T最適反應溫度下降到60 ℃,低于Penicilliumoxalicum來源的生淀粉糖化酶的最適反應溫度65 ℃[2]。最適反應溫度的降低更加有利于RSGA在低于淀粉糊化溫度下降解生淀粉的應用,一定程度上降低能源消耗。進一步將RSGA與突變體純酶在60 ℃條件下處理2 h,每間隔30 min取樣并測定樣品的殘余酶活力。結果如圖4-b所示,突變體S612T在孵育60 min后仍保留64%的殘余酶活力,較RSGA的殘余酶活力提高14%,酶的穩(wěn)定性有所提高,這可能與糖基化的位點有關。突變體S612T是在Asn610位點處附著聚糖鏈,該位點處于淀粉結構域柔性區(qū)域部分[5]。通常情況下,柔性區(qū)域內(nèi)的聚糖鏈可能會限制構象空間,從而提高其穩(wěn)定性[18]。突變體S123T和S424T在孵育30 min后,酶的活性急劇下降,僅保留了35%,酶的熱穩(wěn)定性降低。不同位點糖基化修飾對酶產(chǎn)生的穩(wěn)定效果具有差異,以上結果與前期引入不同位點的糖基化修飾結果是一致的[10]。

a-RSGA及突變體最適反應溫度;b-RSGA及突變體溫度穩(wěn)定性分析

2.5 糖基化對酶促動力學參數(shù)的影響

酶促動力學參數(shù)是酶的基本特征常數(shù)之一,反應酶與底物之間的催化效果。糖基化使蛋白特定氨基酸上增加了多糖鏈,兩者之間共價調(diào)節(jié)糖蛋白從而影響動力學性質(zhì)[19],從而一定程度上增加了底物和蛋白之間的親和力,促進酶與底物結合[20]。以生玉米淀粉為底物,在40 ℃,pH 4.6條件下考察了RSGA以及糖基化突變體在催化反應效率方面的變化及差異。結果表明,S123T、S424T和S612T的kcat/Km值分別是RSGA值的1.31、1.29和1.15倍(表3)。雖然突變體S123T和S424T的kcat值有所降低,但從降低的Km值可以看出,3個突變體均顯著提高了對生玉米淀粉的親和力,與催化效率提升的趨勢是一致的,表明親和力是突變體催化效率提高的主要原因(表3)。殘基Asn121處于相對靈活的loop區(qū)域,這可能促進活性位點上氨基酸的功能,其附著的聚糖鏈不可避免與淀粉鏈發(fā)生相互作用,從而促進對生玉米淀粉的降解效率[10]。另外,RSGA結構模型顯示,Asn422和Asn610分別位于酶的催化域和淀粉結合域(圖1)。Asn422位點的糖基化可能引入了與殘基的相互作用,有利于增強酶與底物之間的親和力[5]。淀粉結合域包含2組淀粉結合位點S1和S2,對生淀粉的結合具有重要作用,而糖基化位點Asn610更加靠近淀粉結合位點,這可能使連接在Asn610上的聚糖鏈通過氫鍵相互作用促進淀粉結合位點與生玉米淀粉的結合,從而提高酶與底物之間的催化效率[5]。

表3 RSGA及突變體動力學分析Table 3 Kinetic parameters of RSGA and its mutants against raw corn starch

3 結論

生淀粉糖化酶作為可以在淀粉糊化溫度下降解生淀粉的水解酶,簡化了淀粉糖生產(chǎn)工藝并降低能源消耗。本研究為提高A.fumigatus來源的RSGA對生玉米淀粉的催化效率,將RSGA氨基酸序列中3個含有Asn-Xaa-Ser糖基化基序替換為Asn-Xaa-Thr并利用NetNGlyc 1.0進行糖基化評估。突變體在K.phaffii中完成糖基化并獲得突變體S123T、S424T和S612T。經(jīng)去糖基化酶EndoH處理及SDS-PAGE分析確定突變體均成功糖基化。在此基礎上研究了突變體S123T、S424T和S612T糖基化對催化活性、熱穩(wěn)定性以及酶促動力學參數(shù)的影響。通過將糖基化基序中的Ser突變?yōu)門hr,突變體S123T、S424T和S612T對生玉米淀粉催化效率分別提高到RSGA的1.31、1.29和1.15倍。此外,突變體S123T引入新的糖基化使其表達量提高了9.3%,且最適反應溫度從70 ℃降低到60 ℃。本研究通過RSGA的糖基化基序改造,有效提高了酶的催化效率,是一種改善酶催化效率的新策略。