胡琪苓，魏艷霞，賈東佩，汪寧，張輝

（1.南陽市中心醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河南 南陽 473000；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

腦梗死主要由動(dòng)脈粥樣硬化及高血壓小動(dòng)脈硬化導(dǎo)致，引發(fā)血管病變，血液成分改變，病死率約10%～15%，致殘率極高且易復(fù)發(fā)[1]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是人腦中與空間學(xué)習(xí)相關(guān)的重要物質(zhì)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的一種，存在于人的神經(jīng)系統(tǒng)中，由BDNF 基因合成[2]。突觸素（SYN）是一種完整的膜糖蛋白，主要分布于大腦、脊髓、視網(wǎng)膜的突觸前小泡，也出現(xiàn)在腎上腺髓質(zhì)小泡及神經(jīng)肌肉連接點(diǎn)，參與突觸囊泡的形成和胞吐[3]。BDNF-SYN 軸在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化及突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[4]。腦梗死目前主要依靠藥物進(jìn)行降壓、溶栓治療，但預(yù)后較差，患者常有中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常引起的后遺癥[5-6]。功能性電刺激通過低頻脈沖電流刺激神經(jīng)肌肉，同時(shí)刺激傳入神經(jīng)，將重復(fù)的運(yùn)動(dòng)信息傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦皮層形成興奮痕跡，逐漸恢復(fù)原有的運(yùn)動(dòng)功能，進(jìn)行功能重建[7-8]，但在體內(nèi)作用機(jī)制尚不明確。本研究通過閉塞大腦中動(dòng)脈構(gòu)建大鼠腦梗死模型，觀察功能性電刺激對(duì)腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力的影響，并初步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，60 只，5 周齡，體質(zhì)量250～350 g，購(gòu)自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）2016-0001。

1.1.2 藥物、試劑 10%水合氯醛（西安眾森醫(yī)藥有限公司）、HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）、SYBR Green 預(yù)混染料，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher 公司），兔抗鼠BDNF、SYN 抗體（美國(guó)Abcam 公司），ECL 發(fā)光試劑盒（美國(guó)Biorad 公司），蛋白定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.1.3 儀器 LC480 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Roche公司），電泳系統(tǒng)（上海天能生命科技有限公司），Nano drop 2000 紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher 公司），化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-rad 公司），腦立體定位儀（美國(guó)stoelting 公司），CM1850切片機(jī)（日本Lecia 公司），E600 顯微鏡（日本尼康公司），Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 60 只大鼠隨機(jī)分為3 組，每組20只：假手術(shù)組（假手術(shù)+安慰刺激）[9]、對(duì)照組（腦梗死模型+安慰刺激）、電刺激組（腦梗死模型+功能性電刺激）。安慰刺激及功能性電刺激均通過治療儀將電極置于前肢肌群，但安慰刺激組不連接電流，功能性電刺激組通過一定頻率及強(qiáng)度電流刺激肌肉群。

1.2.2 模型制備 各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，通過大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞法構(gòu)建大鼠腦梗死模型。對(duì)照組、電刺激組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛4 mL/Kg，麻醉后頸部備皮消毒，于頸部正中切開，切口長(zhǎng)度約3 cm，分離頸部腺體組織后，沿肌肉紋理肌肉及筋膜，分離左頸總動(dòng)脈（CCA）表面血管組織，暴露CCA，沿CCA 向上分離，于甲狀腺水平處找到頸外動(dòng)脈（ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎CCA近端及ECA，微動(dòng)脈夾短暫夾閉ICA 遠(yuǎn)端，離CCA分叉5 mm 處剪出切口，線栓插入后于切口處稍微結(jié)扎，松開動(dòng)脈夾，線栓緩慢插入ICA，于切口處稍微打結(jié)防止滑脫，至有阻力停止，深度約20 mm，線栓至大腦中動(dòng)脈起始部位，固定線栓后，縫合手術(shù)切口，90 min 后拔出線栓。術(shù)后大鼠注意保暖，肛溫保持37 ℃，連續(xù)一周腹腔注射青霉素3 萬單位/d。假手術(shù)組大鼠麻醉后僅分離血管，不插入線栓，其他操作相同。

手術(shù)清醒后，參照Longa 法[10]進(jìn)行模型制備評(píng)分，1～3 分為造模成功，具體評(píng)分如下：0 分,無神經(jīng)損傷癥狀;1 分,輕微神經(jīng)損傷,左側(cè)前爪伸展困難;2 分,中度神經(jīng)功能損傷,中度局灶性病變，向左轉(zhuǎn)圈;3 分,重度局灶性病變，神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重,向左傾倒;4 分,不能自主行走,精神意識(shí)嚴(yán)重缺失。

1.2.3 功能性電刺激干預(yù) 術(shù)后7 d，電刺激組采用治療儀（Neuro Continence，英國(guó)Verity Medical 公司）對(duì)大鼠雙側(cè)前肢進(jìn)行電刺激，每日兩次，每次10 min，治療周期21 d。大鼠俯臥固定后，電極分別置于前肢肌群近遠(yuǎn)端，刺激雙側(cè)前肢肌肉收縮，以產(chǎn)生伸腕伸指動(dòng)作為準(zhǔn)。頻率100 Hz，脈寬250 μs，強(qiáng)度3～6 mA，電流通斷比4 s∶6 s。假手術(shù)組、對(duì)照組接通相應(yīng)的電極，不給電流刺激。

1.2.4 改良神經(jīng)功能缺陷程度評(píng)分(mNSS)[11]分別于術(shù)后1、7、14、21、28 d 通過各組大鼠mNSS 評(píng)分，評(píng)估大鼠神經(jīng)功能損傷情況。mNSS 評(píng)分主要包括運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、感覺實(shí)驗(yàn)、反射喪失和不正常運(yùn)動(dòng)、癲病及肌陣攣、肌張力障礙幾項(xiàng)內(nèi)容，總分18分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，具體分級(jí)如下：13～18 分為嚴(yán)重?fù)p傷；7～12 分為中度損傷；1～6分為輕度損傷。

1.2.5 大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn) 術(shù)后第28 d 開始水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估，前五天（D1、D2、D3、D4、D5）進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，第6 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：每日固定時(shí)間點(diǎn)將大鼠分別從4 個(gè)象限放入水池，面部面向池體，記錄大鼠爬上平臺(tái)時(shí)間即為逃避潛伏期。若120 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記為120 s。每日4 次，記平均值為當(dāng)天測(cè)量結(jié)果?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6 天撤去平臺(tái)，于平臺(tái)所在象限的對(duì)角象限面向池壁放入大鼠，記錄2 min 內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)，并分析大鼠在原平臺(tái)象限所占時(shí)間及路程。

1.2.6 腦皮層梗死區(qū)病理學(xué)改變 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠取腦組織，部分液氮凍存用于基因及蛋白含量檢測(cè)，部分用于HE 染色。4%多聚甲醛固定72 h 后，PBS 沖洗干凈，梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續(xù)5 μm 切片。常規(guī)蘇木精-伊紅染色，蒸餾水沖洗，梯度酒精水化，二甲苯脫蠟，中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察腦皮質(zhì)梗死區(qū)的病理變化。

1.2.7 腦皮層中BDNF、SYN mRNA 表達(dá)量檢測(cè)取大鼠腦組織，勻漿儀研磨后，加入Trizol 提取組織總RNA，電泳鑒定結(jié)構(gòu)后，測(cè)量RNA 含量，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成穩(wěn)定cDNA 結(jié)構(gòu)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 13 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min；94℃變性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，重復(fù)45 個(gè)循環(huán)。GAPDH 為管家基因，通過2-△△CT法計(jì)算BDNF、SYN mRNA 相對(duì)表達(dá)量，上下游引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.2.8 腦皮層中BDNF、SYN 蛋白表達(dá)量 取約100 mg 腦組織，加入RIPA 裂解液，液氮研磨后，10 000 r/min 4℃離心15 min，棄去沉淀，取上清。用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測(cè)定蛋白含量。配制分離膠與濃縮膠后，取50 μL 蛋白樣品等量加入上樣緩沖液，98℃水浴3 min，用于蛋白電泳實(shí)驗(yàn)。電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)90 min，取PVDF 膜脫脂奶粉封閉2.5 h，加入稀釋一抗（1∶8 000）4℃搖床孵育過夜，加入酶標(biāo)二抗（1∶1 000 稀釋），常溫?fù)u床孵育2 h，沖洗后加入根據(jù)ECL 顯色試劑盒加入工作液，放入成像儀中曝光，將BDNF、SYN 與GAPDH 灰度值相比后計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（）描述，重復(fù)計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)；多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組mNSS 評(píng)分比較 與假手術(shù)組相比，對(duì)照組及電刺激組術(shù)后1、7、14、21、28 d mNSS 評(píng)分均升高（P＜0.05），其中電刺激組術(shù)后14、21、28 d mNSS評(píng)分低于對(duì)照組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠mNSS 評(píng)分比較

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估學(xué)習(xí)記憶能力 與假手術(shù)組相比，對(duì)照組、電刺激組逃避潛伏期增加（P＜0.05），其中電刺激組逃避潛伏期均低于對(duì)照組（P＜0.05）。與假手術(shù)組相比，對(duì)照組、電刺激組原平臺(tái)象限所占時(shí)間及路程降低，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中電刺激組原平臺(tái)象限所占時(shí)間及路程、穿越平臺(tái)次數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3-4。

表3 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（s，n=20）

表4 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=20）

2.3 腦皮層梗死區(qū)病理學(xué)改變（HE）假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞排列疏松紊亂，胞核皺縮溶解，形成深藍(lán)密質(zhì)塊，細(xì)胞數(shù)量大面積減少，梗死區(qū)腦組織著色較淺，色差明顯，電刺激組神經(jīng)細(xì)胞部分排列紊亂，梗死面積縮小，部分胞核縮小，相比對(duì)照組腦皮質(zhì)層損傷明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)層病理學(xué)改變（HE×400）

2.4 各組大鼠腦皮層中BDNF、SYN mRNA 相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比，對(duì)照組、電刺激組BDNF、SYN mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），其中電刺激組BDNF、SYN mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠BDNF、SYN mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠腦皮層中BDNF、SYN 蛋白相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比，對(duì)照組、電刺激組BDNF、SYN 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），其中電刺激組BDNF、SYN 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05），見表6、圖2。

圖2 各組Western blot 蛋白條帶圖

表6 各組大鼠BDNF、SYN 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

腦梗死臨床主要表現(xiàn)為偏身感覺障礙、共濟(jì)失調(diào)、感覺異常等腦功能缺損綜合征，研究表明腦梗死大鼠空間辨別能力下降，記憶能力減退并且學(xué)習(xí)能力退化[12]。BDNF-SYN 軸通過調(diào)控軸突及樹突的生長(zhǎng)及結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性及生長(zhǎng)發(fā)育，從而對(duì)大腦的空間認(rèn)知及學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生重要影響[13]。功能性電刺激常用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元癱瘓、呼吸功能障礙等疾病，可以誘導(dǎo)肌肉非自主運(yùn)動(dòng)，從而恢復(fù)肌群運(yùn)動(dòng)能力[14]。研究表明[15-16]功能性電刺激可以增強(qiáng)腦卒中神經(jīng)干細(xì)胞分化增殖，提高成纖維生長(zhǎng)因子表達(dá)，改善大腦損傷，恢復(fù)肌肉群運(yùn)動(dòng)及平衡能力。目前功能性電刺激在腦梗死大鼠中的作用機(jī)制仍不明確，本研究通過探討B(tài)DNF-SYN 軸闡述功能性電刺激修復(fù)腦梗死損傷的機(jī)制，為進(jìn)一步闡明功能性電刺激在腦梗死大鼠中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組及電刺激組術(shù)后1、7、14、21、28 d mNSS 評(píng)分均比假手術(shù)組升高，其中電刺激組14、21、28 d mNSS 評(píng)價(jià)均低于對(duì)照組。這提示造模后大鼠神經(jīng)功能缺損，感覺遲緩，運(yùn)動(dòng)功能失常，功能性電刺激可以緩解神經(jīng)損傷，改善腦梗死大鼠運(yùn)動(dòng)及反射功能。研究表明[17]功能性電刺激可以通過低頻電刺激實(shí)現(xiàn)肌肉非自主運(yùn)動(dòng)，改善卒中后上肢肢運(yùn)動(dòng)功能。水迷宮結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，對(duì)照組及電刺激組逃避潛伏期延長(zhǎng)、原平臺(tái)所占時(shí)間及路程縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)減少，其中電刺激組原平臺(tái)象限所占時(shí)間及路程、穿越平臺(tái)次數(shù)均高于對(duì)照組，逃避潛伏期短于對(duì)照組，提示大鼠造模后空間認(rèn)知能力、學(xué)習(xí)記憶能力均下降，功能性電刺激可能通過增加BDNF、SYN 的表達(dá)，在一定程度上恢復(fù)腦部損傷，改善腦梗死大鼠行為能力。有報(bào)道[18]顯示功能性電刺激可以通過調(diào)控BDNF-SYN 軸激活鈣信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)突起分化，增強(qiáng)神經(jīng)元連接及突觸傳遞，從而提高腦部海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶能力。病理結(jié)果顯示對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，排列雜亂，提示中動(dòng)脈閉塞引起腦部梗死。電刺激組梗死面積明顯減少，損傷明顯改善。功能性電刺激可以修復(fù)梗死區(qū)域，改善細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減輕病理損傷。有報(bào)道[19]顯示功能性電刺激可以增加細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)，提高神經(jīng)元細(xì)胞修復(fù)功能，促進(jìn)病理損傷恢復(fù)。

本研究中，對(duì)照組、電刺激組BDNF、SYN mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均比假手術(shù)組低，其中電刺激組高于對(duì)照組，提示功能性電刺激可以上調(diào)BDNF 及SYN 表達(dá)，增加神經(jīng)元突觸連接，修復(fù)梗死損傷。研究表明[20-21]，BDNF 可以防止神經(jīng)元受損，改善神經(jīng)元病理損傷，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、存活、分化中起重要作用，SYN 參與突觸囊泡的形成與胞吐，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中廣泛表達(dá)。在血管性癡呆大鼠模型中，功能性電刺激可以通過調(diào)節(jié)大鼠BDNF 及SYN 表達(dá)，誘發(fā)快速興奮性電位，提高神經(jīng)元重塑功能，促進(jìn)大腦結(jié)構(gòu)恢復(fù)[22]。

綜上所述，功能性電刺激可能通過調(diào)控BDNF-SYN 軸，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷，改善受損腦部組織，為腦梗死的治療提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。