彭文娟，劉京濤，李曉琳

（三門峽市中心醫(yī)院兒科，河南 三門峽 472000）

兒童原發(fā)性腎病綜合征（Idiopaticnephrotic syndrome，INS）是兒科最常見的腎小球疾病，占小兒腎病綜合征總數(shù)的90%以上，典型表現(xiàn)為大量持久的蛋白尿、高度水腫、低蛋白血癥及高脂血癥等癥狀[1]。INS 的常見病因為感染、遺傳、免疫等因素，患者腎臟一般不能完全恢復(fù)為正常功能且復(fù)發(fā)率也比較高。病程延長，是患病兒童腎臟發(fā)生衰竭的較為重要的原因之一[2]。多數(shù)腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制是免疫炎癥功能紊亂[3]。Toll 樣受體2（Tolllike receptor 2，TLR2）為Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族成員，結(jié)構(gòu)上屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，其通過識別與病原有關(guān)的分子模式和某些內(nèi)源性配體，從而導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，炎癥介質(zhì)被釋放[4]。既往研究顯示，Toll 樣受體可能通過炎性反應(yīng)這一途徑介導(dǎo)腎組織的損傷過程，且與INS 病情活動具有相關(guān)性[5-6]。白細(xì)胞介素-7（Interleukin-7，IL-7）主要通過IL-7 受體α 鏈發(fā)揮作用，可以調(diào)控并維持免疫細(xì)胞分化、發(fā)育和增殖，在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中扮演著關(guān)鍵的角色[7]。既往研究顯示，IL-7 可以強(qiáng)化CD14 單核細(xì)胞的功能，在INS 中發(fā)揮促進(jìn)炎癥的效果、誘導(dǎo)疾病進(jìn)展的作用[8]?；诖耍覀兺茰yINS 外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 與IL-7 等炎癥因子可能通過某種機(jī)制相互調(diào)節(jié)，共同參與了INS 發(fā)生、發(fā)展。本研究探討INS外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 的表達(dá)及其與IL-7表達(dá)水平，分析二者相關(guān)性，以期為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年1 月到2021 年1 月在本院收治的112 例被確診的INS 患兒作為觀察組，其中男53 例，女59 例，年齡2～16 歲，平均（8.22±2.78）歲。病理學(xué)分類：微小病變（Minimal changing disease，MCD）49 例，系膜增生性腎小球腎炎（Mesangial prolif-erative glomerulonephritis，MsPGN）27 例，膜性腎病（Membranous nephropathy，MN）19 例，局灶節(jié)段性腎小球硬化（Focal segmental glomerulus sclerosis，F(xiàn)SGS）17 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《兒童常見腎臟疾病診治循證指南》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）血清白蛋白含量低于25 g/L，24 h 尿蛋白定量超過50 mg/(kg·d)，尿蛋白大于3+，伴有水腫等臨床癥狀；（3）腎臟生物檢查組織學(xué)切片腎小球總數(shù)超過20 個；（4）不伴其他自身免疫性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）先天性或遺傳性腎病綜合征患兒；（2）繼發(fā)于糖尿病、乙肝丙肝、多發(fā)性骨髓瘤等繼發(fā)性腎病綜合征患兒；（3）合并嚴(yán)重疾病，如自身免疫、肝臟和造血系統(tǒng)等疾??；（4）對本研究所用藥物過敏的患兒；（5）臨床資料不完整患兒。對照組另選同期體檢的健康兒童112 例，其中男54 例，女58例，年齡3～15 歲，平均（8.84±2.51）歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會，患者及家屬了解并同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 FACS Calibur 流式細(xì)胞分析儀購自美國Becton-Dickinson 公司；流式專用試管購自上海百賽生物有限公司；羅氏cobas6000 C501 全自動生化儀購自德國羅氏公司；醫(yī)用低速離心機(jī)購自德國Heraeus 公司；小鼠抗人CD14 單抗（熒光素PC-5 標(biāo)記）、IgG2a 同型對照、FITC 標(biāo)記小鼠抗人TLR2 單抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；所用ELISA 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；所用免疫比濁法試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 檢測方法 采集所有患兒清晨空腹靜脈血3 mL，置于EDTA 管中，具體檢測步驟：首先，取三支樣品測定管并標(biāo)記為A、B、C，加入抗凝血劑100 μL，再加入受體封閉劑5 μL。渦旋器振蕩，混勻并在暗室中孵育10 min；然后，在A、B 管中均加入PE-IgG2a 5 μL，在B、C 管中均加入FITC-CD14 20 μL，最后在A、C 管中分別加入FITC-IgG1 20 μL、PE-TLR2 5 μL，振蕩混勻，室溫暗室培養(yǎng)20 min；A、B、C 管中均加入500 μL 紅細(xì)胞裂解液后，振蕩混勻并在室溫下避光10 min；最后，進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min，棄上清液，加入PBS 液2 mL，振蕩混勻，再1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入PBS 液500 μL，振蕩混勻，應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，同時建立無標(biāo)記抗體的陰性對照。在運(yùn)行機(jī)器之前，使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀調(diào)節(jié)對應(yīng)的變異系數(shù)。測試后，使用Cell quest 軟件進(jìn)行檢測。TLR2 的表達(dá)率計算方式為：CD14 和TLR2 抗體染色的雙陽性細(xì)胞百分比。

1.4 INS 患兒血清學(xué)指標(biāo)檢測方法 采集所有患兒清晨空腹靜脈血5 mL，使用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速2500 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min，吸取其上清液，然后將其放于-80 ℃冰箱中保存待測。

應(yīng)用羅氏cobas6000 C501 全自動生化儀，采用免疫比濁法測定血漿高敏C-反應(yīng)蛋白（High sensitive c-reactive protein，hs-CRP）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）水平；采用ELISA 檢測法測定血清白介素-7（Interleukin-7，IL-7）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（Tumer necrosis factor-alpha，TNF-α）水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布的計量資料均以（）表示，采用t 檢驗分析比較兩組間差異性；計數(shù)資料均以率(%)表示，分類資料之間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 相關(guān)性分析INS 患兒外周血CD14 單核細(xì) 胞TLR2 的表達(dá)及其與IL-7、hs-CRP、IgG、IgM 表達(dá)水平的相關(guān)性；繪制受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC），計算ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC），評估TLR2、IL-7 對INS 患兒發(fā)病的預(yù)測價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較 兩組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較

2.2 兩組TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)水平比較 觀察組外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)水平均顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)水平比較

2.3 INS 患兒TLR2 與IL-7 表達(dá)水平的相關(guān)性分析 INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 與IL-7表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.479，P＜0.001），見圖1。

圖1 INS 患兒TLR2 與IL-7 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.4 INS 患兒TLR2、IL-7 與hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相關(guān)性分析 INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNFα 呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清IL-7 與IgG 呈負(fù)相關(guān)，與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)（P＜0.05）；而TLR2、IL-7 與IgM 均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表3 INS 患兒TLR2、IL-7 與hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相關(guān)性分析

2.5 ROC 曲線分析TLR2、IL-7 對INS 患兒發(fā)病的預(yù)測價值 TLR2、IL-7 及聯(lián)合檢測預(yù)測INS 患兒發(fā)病的AUC 分別為0.714、0.674、0.908。見圖2、表4。

圖2 TLR2、IL-7 對INS 患兒發(fā)病的預(yù)測價值ROC 曲線圖

表4 TLR2、IL-7 及聯(lián)合指標(biāo)的ROC 曲線分析

3 討論

INS 是兒童常見的腎小球疾病，其主要原因是腎小球毛細(xì)血管及基底膜的通透性增加，大量血漿蛋白經(jīng)尿流失，肝臟合成脂蛋白增加，這些因素綜合導(dǎo)致了兒童腎衰竭的發(fā)生[10]。目前，INS 的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。已有研究顯示，機(jī)體細(xì)胞和體液免疫功能異?？赡苁菍?dǎo)致發(fā)病主要原因，且TLRs 對INS 的發(fā)生、發(fā)展起重要作用[11]。本研究分析了INS 患兒的一般資料，發(fā)現(xiàn)血清hs-CRP、IgM 水平高于對照組，IgG 水平低于對照組。已有研究顯示，hs-CRP 是一種非常敏感的炎癥標(biāo)志物。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥感染，或者遭體液介導(dǎo)的免疫應(yīng)答導(dǎo)致的組織損傷時，血液中的CPR 在很長一段時間內(nèi)保持在高水平[12]。而IgM 是一種高分子蛋白，其不容易通過腎小球濾過膜，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時其濃度上調(diào)。所以IgM 的增加也可能與INS 患兒的繼發(fā)感染有關(guān)。IgG 降低可能與INS 患兒加速分解、尿中丟失增加、淋巴細(xì)胞合成的減少和免疫抑制劑的應(yīng)用相關(guān)[13-14]。結(jié)合本研究說明，hs-CRP、IgM 及IgG 可以分別以不同的方式參與兒童INS 的發(fā)病，并在發(fā)病中起到一定作用。

TLR2 是特異的I 型跨膜受體和病原模式識別受體，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞信號的傳達(dá)、衰亡中扮演著重要的角色[15]。IL-7 是趨化因子家族中的成員之一，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的糖蛋白細(xì)胞因子，分子量為25KD，能夠促進(jìn)趨化因子分泌、募集炎癥因子[16]。既往研究顯示，IL-7 可以加速INS 患兒CD14單核細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌。IL-7 刺激的CD14單核細(xì)胞均可通過直接或接觸的方式，誘導(dǎo)IL-6分泌從而使INS 患兒CD4+T 細(xì)胞活化[17]。本研究結(jié)果顯示，INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達(dá)水平均顯著高于對 照組，且TLR2 與IL-7 表達(dá)水平呈正相關(guān)性。分析原因，這可能是由于INS 患兒機(jī)體TLR2 識別了某些內(nèi)源性抗原，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人單核細(xì)胞激活NF-кβ，核內(nèi)的相關(guān)基因被啟動，傳導(dǎo)出相應(yīng)的mRNA，從而合成IL-7、IL-6、IL-8、TNFα 等細(xì)胞因子并釋放到胞外，引起炎癥反應(yīng)。既往研究顯示，TLR2 與其配體結(jié)合以后，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，引起炎性因子的釋放，使腎小球基底膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致大量蛋白尿的產(chǎn)生[18]。結(jié)合本研究說明，外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2、IL-7 與INS 的發(fā)生有密切關(guān)系，TLR2 可以通過炎性反應(yīng)這一途徑參與并調(diào)控腎組織的損傷過程。

本研究結(jié)果還顯示，INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2 與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)；血清IL-7 與IgG 呈負(fù)相關(guān)，與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關(guān)。既往研究顯示，TLRs 還可以刺激和調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和Ig 分泌功能[19]。結(jié)合本研究說明，T 淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞炎癥因子均可能參與INS 的發(fā)生和發(fā)展。T 淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在INS 患兒機(jī)體內(nèi)會出現(xiàn)異常表達(dá)，其表達(dá)結(jié)果與健康兒童不同，同時還會介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞的免疫應(yīng)答過程，在兒童體內(nèi)進(jìn)而引發(fā)超敏反應(yīng)。通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，TLR2、IL-7 聯(lián)合檢測INS 患兒發(fā)病的靈敏度、特異度最高，AUC 面積最大，且有較好的靈敏度和特異性，具有較大預(yù)測價值，提示外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2、IL-7 在INS 發(fā)病中均起到一定作用。

綜上所述，INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2、IL-7 表達(dá)水平均明顯上調(diào)，且兩者具有正相關(guān)性，TLR2、IL-7 聯(lián)合檢測對判定INS 發(fā)病具有較高的預(yù)測價值。但本文還存在一定的不足之處，可進(jìn)一步探討INS 患兒外周血CD14 單核細(xì)胞TLR2調(diào)控的信號通路，以期為臨床診斷和治療INS 患兒提供可靠依據(jù)。