王 瀟 嚴(yán)茂祥 何蓓暉 陳芝蕓

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江杭州 310006

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是代謝綜合征在肝臟的一種臨床表現(xiàn)，是單純性脂肪性肝炎發(fā)展至肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要階段[1-3]。NASH 的發(fā)病機(jī)制雖未完全明確，但“二次打擊”學(xué)說現(xiàn)階段仍處于主導(dǎo)地位。NASH 現(xiàn)有的防治手段除了嚴(yán)格強(qiáng)化生活方式外，尚無其他明確有效的治療方法。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能紊亂在NASH 的病理過程中起著重要作用，及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)損傷的線粒體對于保護(hù)肝細(xì)胞具有重要作用。健脾化痰方由二陳湯和四苓散組成，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾化痰方能夠糾正NASH 大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝組織炎癥損傷，防止NASH 的進(jìn)一步發(fā)展。本研究從調(diào)控自噬來探討健脾化痰方改善蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（MCD）誘導(dǎo)的NASH小鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠40 只，體質(zhì)量約20g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號：SYXK（浙）2018-0012；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 健脾化痰方組成：陳皮、半夏、澤瀉各15g，茯苓、白術(shù)、豬苓各9g，炙甘草5g，生姜3g，烏梅1.5g，均為顆粒劑。

1.3 主要試劑和儀器：BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（biosharp）、總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；沉默信息調(diào)節(jié)蛋白（SIRT1）、p62、Beclin-1抗體（Immunoway 公司）；LC3 抗體（proteintech 公司）；數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)（ZEISS 公司）；生物樣品勻質(zhì)器（precellys）；酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：40 只雄性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為5組，正常組，MCD-NASH 模型組，健脾化痰方低、中、高劑量組，每組8 只。正常組普通飼料喂養(yǎng)，其余4 組喂養(yǎng)MCD 飼料，連續(xù)4 周。造模同時(shí)藥物干預(yù)組每天分別以11.76g/kg·d、23.29g/kg·d、46.58g/kg·d 的健脾化痰方灌胃，正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12h小鼠禁食，稱重，摘眼球放血法采血，全自動(dòng)生物儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）含量；取肝臟組織，稱重后，部分肝組織冰凍切片油紅O 染色；部分甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)脫水透明，HE 和Masson 染色，數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)觀察肝組織病理變化并拍照。提取肝臟組織蛋白，免疫印跡法檢測肝組織中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白表達(dá)水平，ECL 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)；多個(gè)樣本間的比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的變化：MCD飲食喂養(yǎng)4周后小鼠較正常組小鼠體質(zhì)量明顯下降，肝指數(shù)與正常組相比明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001）。健脾化痰方各組與模型組比較，體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），肝指數(shù)呈下降趨勢。見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)情況

2.2 健脾化痰方對NASH 小鼠血清ALT 和AST 的影響：生物化學(xué)法檢測血清ALT和AST，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.0001）；健脾化痰方中和高劑量組ALT和AST含量與模型組比較明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 健脾化痰方對NASH小鼠血清ALT和AST水平的影響

2.3 NASH 小鼠血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 含量：MCD飲食喂養(yǎng)小鼠4 周后，檢測發(fā)現(xiàn)血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 的水平與正常對照組小鼠無明顯差異，健脾化痰方干預(yù)各組也均無變化。見圖3。

圖3 小鼠血清中CHOL 、TG、HDL-C和LDL-C水平

2.4 健脾化痰方對小鼠肝臟組織病理的影響：與對照組相比，肝組織油紅O染色觀察到模型組小鼠肝組織內(nèi)有大量的脂滴大泡，健脾化痰方能有效減少肝組織的脂肪沉積。HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化，而健脾化痰方能部分改善肝組織的病理改變。見圖4。

圖4 肝組織油紅O染色、HE染色和Masson染色（×200）

2.5 健脾化痰方對小鼠肝組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，模型組肝組織中自噬活性正相關(guān)蛋白SIRT1、Beclin-1和LC3水平降低，負(fù)調(diào)控蛋白p62表達(dá)增高；健脾化痰方干預(yù)后SIRT1、Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白水平下降（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。見圖5。

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）在我國已成為僅次于病毒學(xué)肝炎的第二大肝臟疾病，嚴(yán)重危害人類健康，在年輕人中的發(fā)病率也逐年升高[4]。NASH 是NAFLD 疾病發(fā)生的初期階段，如果沒有得到有效的控制，約有20%的患者會(huì)發(fā)展為肝硬化[5，6]。因此，在疾病早期延緩或阻止其進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要，能有效改善NAFLD患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。

MCD 誘導(dǎo)的NASH 動(dòng)物模型是目前研究NASH 的經(jīng)典模型之一[7]。本研究結(jié)果通過MCD 建立的NASH 模型小鼠與正常組小鼠相比體質(zhì)量明顯下降，肝指數(shù)顯著增高，而血清中TG、CHOL、LDL-C 和HDL-C 水平并沒有明顯差異，這與以往研究中NASH的造模結(jié)果一致。MCD誘導(dǎo)NASH 小鼠模型的原理與高脂飲食所致的NASH 不同，這是由于在MCD 誘導(dǎo)NASH 模型中膽堿的缺乏會(huì)造成肝內(nèi)極低密度脂蛋白合成抑制，促使肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯運(yùn)出受阻，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯大量累積引起脂肪變性，進(jìn)而激活脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激反應(yīng)。而蛋氨酸缺乏損害細(xì)胞的氧化屏障，進(jìn)一步加重肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)。因此，MCD 脂類代謝紊亂主要體現(xiàn)在肝臟，而不會(huì)出現(xiàn)NASH常見的全身性表現(xiàn)，如肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等。

ALT 和AST 是肝細(xì)胞內(nèi)非特異性的功能酶，在正常情況下人體血清中含量較低。當(dāng)肝細(xì)胞受到炎癥反應(yīng)素刺激時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，ALT和AST從細(xì)胞內(nèi)釋放到血液中。因此，血清中ALT 和AST 的水平在一定程度上能夠反映肝細(xì)胞功能及其炎性損傷程度，通過其濃度變化可判斷疾病的進(jìn)展、療效及預(yù)后等情況。本研究結(jié)果顯示，MCD 模型小鼠血清ALT 和AST 水平與正常組相比明顯升高，同時(shí)肝組織病理觀察到肝細(xì)胞中脂質(zhì)沉積明顯增多，有大量炎癥細(xì)胞浸潤和部分纖維化。這也表明我們建立的動(dòng)物模型能很好地模擬NASH在肝臟組織中的病理特征。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾虛失運(yùn)、濕化為痰、痰瘀郁熱，積損肝絡(luò)是NASH 發(fā)病的關(guān)鍵因素，脾虛痰濕是本病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的核心環(huán)節(jié)。通過健脾氣、化水濕、截痰濁、助消導(dǎo)、祛血瘀可以達(dá)到治療脂肪肝的目的[8-11]。健脾化痰方中的陳皮、半夏和茯苓可以健脾消痰；澤瀉、白術(shù)、豬苓具有健脾利濕、利水除濕之功效。諸藥配合，可健脾化痰而不傷正。本研究結(jié)果表明，健脾化痰方干預(yù)后NASH 小鼠肝指數(shù)下降，血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低，肝組織脂肪變性、炎癥反應(yīng)和纖維化均明顯減輕。

研究表明，NAFLD 患者肝細(xì)胞內(nèi)自噬活性下降，肝臟損傷程度與其自噬受損程度密切相關(guān)[12]。SIRT1 是Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶（HDACs），能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[13]。近來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中SIRT1 過表達(dá)后，細(xì)胞自噬水平會(huì)增高。而敲除SIRT1 后，自噬水平顯著下降。同時(shí)相關(guān)研究也相繼證實(shí)，SIRT1 可通過去乙?；饔脤ψ允上嚓P(guān)蛋白功能發(fā)揮調(diào)控作用，在自噬的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用[14]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，健脾化痰方能上調(diào)NASH 小鼠肝細(xì)胞中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白水平，同時(shí)下調(diào)p62蛋白表達(dá)。因此，本研究結(jié)果提示，健脾化痰方可能是通過激活SIRT1，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，保護(hù)肝細(xì)胞損傷，從而達(dá)到防治NASH的功效。