程彥茗，范陽，毛勝勇，丁立人

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

隨著我國反芻動物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)對粗飼料資源的需求量不斷增大[1]。當(dāng)前，盡管我國一些現(xiàn)有的粗飼料資源如花生秸稈等已得到充分利用，但仍不能滿足產(chǎn)業(yè)需求，急需新開發(fā)有穩(wěn)定來源的粗飼料資源[2]。稻殼粉是水稻加工的主要副產(chǎn)物(占水稻重量的20%以上)，是一類常見的非常規(guī)飼料資源。據(jù)報(bào)道，我國每年約產(chǎn)4 000多萬噸稻殼粉[3]，可利用資源十分豐富。但在實(shí)際生產(chǎn)中，稻殼粉中纖維素類物質(zhì)約占63.67%，較高的木質(zhì)纖維素影響了機(jī)體對其他營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。有研究報(bào)道，如果將稻殼粉作為飼料來源直接飼喂家畜，其消化率僅為5%～8%[4]。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，使用微生物發(fā)酵技術(shù)有助于提高稻殼粉的利用率[5]。Aderolu等[6]研究表明，使用綠色木霉菌(Trichodermaviride)處理稻殼粉40 d后，與發(fā)酵前相比，稻殼粉的代謝能和粗蛋白的含量顯著上升，而粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量顯著降低。Beg等[7]研究表明，使用糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)處理稻殼，與發(fā)酵原料相比，發(fā)酵稻殼粉的粗蛋白含量從2.15%增加到了9.3%，且消化率也上升了14.76%，而粗纖維、纖維素和木質(zhì)素的含量分別減少了35.4%、19.7%和40.9%。然而，以前有關(guān)稻殼粉的研究多采用霉菌等真菌進(jìn)行發(fā)酵，由于這些霉菌未列入飼料添加劑目錄，因而以這些微生物發(fā)酵生產(chǎn)稻殼粉存在潛在的飼料安全問題。乳酸菌、酵母菌、芽胞桿菌是飼料微生物目錄中的常見菌株，是否可以采用這些菌聯(lián)合發(fā)酵稻殼粉，并提高其飼料營養(yǎng)價(jià)值，目前并不清楚。

本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室保存的3株菌，即植物乳桿菌L1(Lactobacillusplantarum)、枯草芽胞桿菌B6(Bacillussubtilis)和釀酒酵母菌S2(Saccharomycescerevisiae)混合發(fā)酵稻殼粉飼料，研究了稻殼粉發(fā)酵飼料在制作過程中的相關(guān)參數(shù)，最終篩選出發(fā)酵所需的最佳菌種比例和發(fā)酵條件，擬為發(fā)酵稻殼粉飼料的生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，為我國開發(fā)新型粗飼料資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

因稻殼粉營養(yǎng)成分含量較低，故添加玉米粉與豆粕粉作為發(fā)酵底物為菌種生長與動物飼喂提供營養(yǎng)，稻殼粉、玉米粉和豆粕粉三者重量比例為16∶3∶1，發(fā)酵底物由安徽大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司提供。為促進(jìn)微生物生長，將發(fā)酵底物的含水量調(diào)整至35%。發(fā)酵所用菌種為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌L1、枯草芽胞桿菌B6和釀酒酵母菌S2。試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基購自南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 發(fā)酵菌液的制備

按0.1%(體積比)接種量將凍存的植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌分別接種于對應(yīng)的無菌液體培養(yǎng)基中，用MRS培養(yǎng)基活化植物乳桿菌，用LB培養(yǎng)基活化枯草芽胞桿菌，用YPD培養(yǎng)基活化釀酒酵母菌。將植物乳桿菌置于37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)24 h，枯草芽胞桿菌置于37 ℃、140 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h，釀酒酵母菌置于30 ℃、140 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h。用接種環(huán)取少量菌液通過平板涂布法接種到無菌固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中，制成發(fā)酵菌液并測定各菌液的活菌數(shù)，活菌數(shù)>5lg CFU/g即可用于飼料發(fā)酵(植物乳桿菌活菌數(shù)>7lg CFU/g，枯草芽胞桿菌活菌數(shù)>6lg CFU/g，釀酒酵母菌活菌數(shù)>6lg CFU/g)。

1.3 固態(tài)發(fā)酵

取500 g固態(tài)發(fā)酵底物置于帶有單向透氣閥的聚乙烯袋中(規(guī)格為 300 mm×200 mm)，將發(fā)酵菌液按照不同的組合和接種量接種到固態(tài)發(fā)酵底物中，攪拌均勻并在發(fā)酵袋中留存部分空氣后封口，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 發(fā)酵稻殼粉菌種比例優(yōu)化

采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將各菌種按3個(gè)接種比例進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)。按5%的接種量進(jìn)行發(fā)酵底物的接種，接種后，于35 ℃固體發(fā)酵(自然pH值)5 d，測定發(fā)酵飼料pH值、乳酸菌活菌數(shù)、芽胞桿菌活菌數(shù)、酵母菌活菌數(shù)、乳酸濃度、揮發(fā)性脂肪酸濃度、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素含量，上述指標(biāo)經(jīng)過Topsis(優(yōu)劣解距離法)計(jì)算后，確定發(fā)酵稻殼粉飼料的最佳菌種組合。發(fā)酵稻殼粉飼料菌種組合的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 發(fā)酵稻殼粉飼料菌種組合的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 發(fā)酵稻殼粉飼料的工藝優(yōu)化

在確定3個(gè)菌種最佳接種配比之后，采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將接種量(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)(表2)，每個(gè)水平3個(gè)重復(fù)，將上述發(fā)酵指標(biāo)含量經(jīng)過Topsis計(jì)算，確定發(fā)酵稻殼粉飼料的最佳條件。稻殼粉飼料的發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 稻殼粉飼料發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6 相關(guān)指標(biāo)的測定

1.6.1 活菌數(shù)

在無菌條件下從各個(gè)處理組取1 g發(fā)酵產(chǎn)物置于滅菌后的離心管中，加入9 mL 0.9%無菌生理鹽水，混合均勻，置于4 ℃冰箱過夜，之后用稀釋涂布平板法測定3種菌株活菌數(shù)；用MRS 培養(yǎng)基測定乳酸菌數(shù)量、LB 培養(yǎng)基測定芽胞桿菌數(shù)量、YPD 培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)量。具體方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.6.2 發(fā)酵指標(biāo)

開袋后將發(fā)酵產(chǎn)物混勻，從各個(gè)處理組取2 g發(fā)酵產(chǎn)物置于離心管，加入2 mL超純水后靜置于4 ℃冰箱保存過夜，提取浸提液，用HI-9024C便攜式pH計(jì)(HANNA Instruments，美國)測定其pH值；取1 g飼料加入9 mL超純水混合均勻置于4 ℃冰箱過夜后，取上清液，采用氣相色譜法(GC-14B，島津，日本)測定其揮發(fā)性脂肪酸的含量[9]，并取上述上清液采用乳酸試劑盒(南京建成生物科技有限公司，南京)測定其乳酸的含量。

1.6.3 營養(yǎng)成分含量

從各個(gè)處理組取5 g發(fā)酵產(chǎn)物置于烘箱，105 ℃烘干至恒重后回潮，用于測定纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素等飼料常規(guī)養(yǎng)分，具體方法參照文獻(xiàn)[10]。纖維素含量的測定使用ANKOM-A200i自動纖維分析儀(美國)，粗灰分含量的測定使用一恒箱式電阻爐SX2-4-10N(中國)，粗蛋白含量的測定使用FOSS凱氏定氮儀2300(丹麥)，粗脂肪含量的測定使用索氏提取儀。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel(2020)進(jìn)行初步整理，使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用SNK(Student-Newman-Keuls)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的Topsis法對發(fā)酵后的pH值、活菌數(shù)、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素分別賦予-2、2、1、1、1、-1、-1、-1、-1的權(quán)重后計(jì)算評分。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵稻殼粉的菌種組合優(yōu)化

2.1.1 不同菌種組合對發(fā)酵稻殼粉飼料中微生物數(shù)量的影響

由表3可知，試驗(yàn)8、9組的乳酸菌數(shù)量極顯著高于其他組(P<0.01)，試驗(yàn)5、7、8、9組的芽胞桿菌和酵母菌數(shù)量極顯著高于其他組(P<0.01)。

表3 不同菌種組合對發(fā)酵稻殼粉飼料中微生物數(shù)量的影響 lg CFU/g

2.1.2 不同菌種組合對發(fā)酵稻殼粉飼料的酸度、揮發(fā)性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

由表4可知，9個(gè)試驗(yàn)組的pH值均小于4.5，其中第8組的pH值最低為4.39，但差異不顯著(P>0.05)；第3組的乳酸含量最高，為35.45 μmol/g，顯著高于第2、6、7、9組(P<0.05)；第1組的乙酸含量極顯著高于第5、8、9組(P<0.01)；第3組的丙酸含量極顯著高于第7、8、9組(P<0.01)；各組均檢測到少量的丁酸，其中第6組的丁酸含量最低，為0.18 μmol/g，極顯著低于第3、8、9組(P<0.01)；第1組的纖維素含量最低，為36.19%；第9組的半纖維素含量最低，為19.36%；第4組的酸性洗滌木質(zhì)素最低，為6.76%，極顯著低于第1組(P<0.01)。

表4 不同菌種組合對發(fā)酵稻殼粉飼料的酸度、揮發(fā)性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

2.1.3 不同菌種比例的Topsis綜合評分

采用Topsis法對上述結(jié)果綜合多指標(biāo)分析，表5結(jié)果顯示第2組得分最高，為0.611 8。因此，接種比例的最佳組合為第2組，即植物乳桿菌∶枯草芽胞桿菌∶釀酒酵母菌=1∶2∶2。

表5 不同菌種比例的Topsis綜合評分法結(jié)果

2.2 發(fā)酵稻殼粉發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同發(fā)酵條件對發(fā)酵稻殼粉飼料中微生物數(shù)量的影響

由表6可知，試驗(yàn)1組(接種量為3%，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵溫度為25 ℃)的乳酸菌、芽胞桿菌和酵母菌數(shù)量均顯著高于其他組(P<0.001)，其中乳酸菌數(shù)量比最低組高57.73%，芽胞桿菌菌數(shù)量比最低組高46.35%，酵母菌數(shù)量比最低組高50.00%。

表6 不同發(fā)酵工藝條件對發(fā)酵稻殼粉飼料中微生物數(shù)量的影響 lg CFU/g

2.2.2 不同發(fā)酵條件對發(fā)酵稻殼粉飼料酸度、揮發(fā)性脂肪酸濃度和纖維素含量的影響

由表7可知，第2組pH值最低，為3.81，極顯著低于第1、6、9組(P<0.01)；第7組乳酸最高，為40.51 μmol/g，極顯著高于第1、6、9組(P<0.01)；第9組的乙酸含量最高，為44.70 μmol/g，顯著高于第1、3、4、7組(P<0.05)；第6組的丙酸含量最高，為6.62 μmol/g；第7組的丁酸含量最低，為0.84 μmol/g；第3組的纖維素和半纖維素含量最低；第4組的酸性洗滌木質(zhì)素含量最低，為15.43%。

表7 不同發(fā)酵工藝條件對發(fā)酵稻殼粉飼料酸度、揮發(fā)性脂肪酸濃度和纖維素的含量的影響

2.2.3 不同發(fā)酵條件的Topsis綜合評分

采用Topsis法對上述結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)綜合分析，表8結(jié)果顯示，第9組得分最高，為0.640 8。因此混合發(fā)酵稻殼粉工藝條件的最佳組合為第9組，即接種7%的菌液并在25 ℃的條件下發(fā)酵96 h。

表8 不同發(fā)酵工藝組合Topsis綜合評分法結(jié)果

2.3 發(fā)酵后稻殼粉飼料pH值及營養(yǎng)成分含量變化

按照篩選出的工藝參數(shù)發(fā)酵稻殼粉飼料，與發(fā)酵前稻殼粉進(jìn)行pH值及營養(yǎng)水平變化比較，每組4個(gè)重復(fù)，結(jié)果如表9所示。發(fā)酵前后稻殼粉干物質(zhì)含量、粗蛋白、粗灰分、粗纖維、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量沒有顯著差異(P>0.05)，pH值較發(fā)酵前極顯著下降(P<0.01)，酸溶蛋白和粗脂肪的含量均極顯著升高(P<0.01)。

表9 發(fā)酵后稻殼粉飼料pH值及營養(yǎng)成分含量變化(占干物質(zhì))

3 討論

我國稻殼粉產(chǎn)量豐富，但由于其纖維含量高且適口性差，較少在畜牧生產(chǎn)中使用。有研究表明，微生物發(fā)酵可以提高飼料的適口性并改善其營養(yǎng)成分。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻殼粉發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)地松散似砂礫，氣味酸香，結(jié)果表明，復(fù)合菌發(fā)酵可以改善稻殼粉飼料的感官品質(zhì)。曲強(qiáng)[11]研究表明，發(fā)酵產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)有助于改善菌糠飼料的適口性，增加動物食欲并提高采食量，顯著促進(jìn)了育成羊的增重。因此，可推測發(fā)酵稻殼粉有利于提升動物的采食量。

單菌發(fā)酵和復(fù)合菌發(fā)酵是常見的2種生產(chǎn)發(fā)酵飼料模式。單菌種發(fā)酵是采用單一菌種進(jìn)行發(fā)酵，大多使用乳酸菌，發(fā)酵條件與復(fù)合菌發(fā)酵相比，簡單可控，成本更低；而復(fù)合菌發(fā)酵是充分利用各菌種的協(xié)同發(fā)酵作用。有研究表明，復(fù)合菌發(fā)酵的交互作用使微生物代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)成分要優(yōu)于單菌發(fā)酵的結(jié)果[12]，在發(fā)酵飼料生產(chǎn)中使用枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌，不僅可將飼料中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子，還在發(fā)酵過程中消耗空氣，使飼料更快進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段，加快了植物乳桿菌生長代謝的速度，從而生成大量乳酸[13]。植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌3株菌之間沒有拮抗作用，是用于共同發(fā)酵的常見菌株[14]，因此本試驗(yàn)采用這3株菌對稻殼粉飼料進(jìn)行發(fā)酵。本試驗(yàn)發(fā)酵最佳組第9組的乳酸菌、芽胞桿菌和酵母菌活菌數(shù)均達(dá)到7.62 lg CFU/g 以上，說明3株菌在發(fā)酵底物上生長較好，而第2次發(fā)酵中的第2、3、6組活菌數(shù)含量較低，可能是飼料在發(fā)酵過程中產(chǎn)熱導(dǎo)致溫度超出環(huán)境溫度，達(dá)不到復(fù)合菌種生長的適宜溫度，且在較高溫度下，長時(shí)間發(fā)酵加速了菌種的衰亡。

研究表明，乳酸不僅可提高飼料適口性，還降低飼料pH值，進(jìn)而抑制有害菌的生長，也提高飼料的有氧穩(wěn)定性[15-16]。本試驗(yàn)發(fā)酵最佳組第9組乳酸含量為29.23 μmol/g，說明飼料發(fā)酵較為充分。有研究表明，優(yōu)質(zhì)飼料的pH值一般為3.8～4.2[17]。本試驗(yàn)發(fā)酵最佳組第9組pH值為3.93，達(dá)到了優(yōu)質(zhì)發(fā)酵飼料標(biāo)準(zhǔn)，且比第1次發(fā)酵pH值下降較多，說明合適的菌種配比可以有效降低飼料的pH值。乙酸是一種有效的抑菌劑，對條件致病菌(如腸桿菌、埃希氏菌等)有抑制作用，并能有效提高干物質(zhì)的回收率和水溶性化合物的含量，有利于有機(jī)成分的保存并提高飼料的儲存性能[18-19]。本試驗(yàn)發(fā)酵最佳組第9組的乙酸含量為44.70 μmol/g，發(fā)酵品質(zhì)較好。張相倫等[20]研究提出布氏乳桿菌可將乳酸分解為乙酸，所以乙酸含量的提高可能也與乳酸的分解有關(guān)。丁酸是一種具有刺激性氣味的短鏈脂肪酸，有研究表明，丁酸的出現(xiàn)和梭菌代謝相關(guān)，梭菌可將糖類和乳酸等轉(zhuǎn)化為丁酸，不僅造成了干物質(zhì)損失，而且生成的不適氣味會影響動物的采食[21]。本試驗(yàn)第9組中的丁酸含量為1.11 μmol/g，說明發(fā)酵過程良好。

Topsis是一種常見的決策分析方法，通過對指標(biāo)賦予權(quán)重，歸一后計(jì)算每個(gè)方案與理想方案幾何距離從而進(jìn)行排序篩選出最佳方案[22]。該試驗(yàn)選取發(fā)酵稻殼粉的pH值、活菌數(shù)、乳酸、揮發(fā)性脂肪酸、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素的含量作為指標(biāo)，分別根據(jù)其對飼喂動物的影響等賦予不同的權(quán)重，pH值在一定范圍內(nèi)降低更有利于動物采食消化；活菌數(shù)代表接種菌種生長狀況；乳酸、乙酸和丙酸均為發(fā)酵優(yōu)質(zhì)產(chǎn)物；丁酸、纖維素、半纖維素和酸性洗滌木質(zhì)素則對動物采食或消化飼料產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，由此設(shè)置各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重，最終篩選出最佳的菌種配比和發(fā)酵條件。

發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分的變化主要源于益生菌生長過程中對底物的降解和代謝產(chǎn)物的生成。朱曉峰等[23]研究表明乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵能降低菜籽粕硫代葡萄糖苷含量，改善其營養(yǎng)價(jià)值。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵后稻殼粉飼料的酸溶蛋白含量由7.74%上升到16.20%，提高了109.30%，可能是由于枯草芽胞桿菌將大分子蛋白質(zhì)水解成少量氨基酸組成的小肽；粗脂肪的含量達(dá)到4.50%，提高了69.17%，粗蛋白的含量提高了0.94%，一部分是所加菌液中的培養(yǎng)基成分具有的營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致的，發(fā)酵飼料干物質(zhì)的損失造成的“濃縮效應(yīng)”同樣會使其含量上升；發(fā)酵前后稻殼粉的纖維素含量均未顯著變化，可能是因?yàn)轱暳嫌醒醢l(fā)酵時(shí)間較短，抑制了芽胞桿菌產(chǎn)生纖維酶的能力，或是枯草芽胞桿菌對不同種類的發(fā)酵底物作用有差異，而酸性洗滌纖維上升了2.67%，可能是由于益生菌生長消耗飼料中的有機(jī)物，造成一定的干物質(zhì)損失導(dǎo)致的比例升高。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)篩選了植物乳桿菌、枯草芽胞桿菌和釀酒酵母菌混合發(fā)酵稻殼粉飼料的最優(yōu)工藝條件為：植物乳桿菌∶枯草芽胞桿菌∶釀酒酵母菌=1∶2∶2，接種量為7%，發(fā)酵溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間為96 h。經(jīng)過發(fā)酵的稻殼粉飼料pH值顯著下降，酸溶蛋白和粗脂肪含量顯著上升，在一定程度上提高了其營養(yǎng)價(jià)值，但其在生產(chǎn)中的具體應(yīng)用效果還需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。