周爽爽

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院 貴州,黔南 558000)

小貫小綠葉蟬(EmpoascaonukiiMatsuda,又名假眼小綠葉蟬)是茶園常見害蟲,刺吸式口器,被害茶樹常常出現(xiàn)卷葉,焦枯等為害狀。若防控不當(dāng),常致茶葉低產(chǎn)、質(zhì)差[1],長期使用單一的防控手段可能導(dǎo)致效果欠佳[2]。

利用昆蟲嗅覺識(shí)別機(jī)制開發(fā)行為調(diào)節(jié)劑(例如引誘劑或驅(qū)避劑)是害蟲綠色防控技術(shù)研發(fā)的重要內(nèi)容。在昆蟲嗅覺感受系統(tǒng)中,一系列嗅覺相關(guān)蛋白發(fā)揮著重要作用[3]。探明嗅覺識(shí)別機(jī)制對(duì)行為調(diào)節(jié)劑等害蟲防控技術(shù)開發(fā)具有重要意義。研究表明,化學(xué)感受蛋白(chemosensoryproteins,CSPs)等蛋白在嗅覺識(shí)別第一步生化反應(yīng)行使識(shí)別和運(yùn)輸功能[4]。大量實(shí)驗(yàn)通過蛋白表達(dá)和純化技術(shù)獲取體外重組蛋白,經(jīng)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)蛋白與化合物分子的結(jié)合能力,由此為引誘劑等成分篩選提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。對(duì)于無法表達(dá)純化的蛋白,也通過分子模擬測(cè)算蛋白與化合物分子的結(jié)合能力,而且可以在分子層面反映相互作用情況。小貫小綠葉蟬化學(xué)感受蛋白相關(guān)研究鮮見報(bào)道。AlphaFold是2021年發(fā)布,目前比較熱門的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)解析工具,大量昆蟲 CSPs的三維結(jié)構(gòu)模型可以直接在AlphaFold預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(AlphaFold Protein Structure Database)中獲取[5],為分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)提供了更多的便利。

本研究通過AlphaFold獲得EnouCSP21和EnouCSP22蛋白模型,利用MOE(Molecular Operating Environment)軟件開展分子對(duì)接研究,以闡明EnouCSP21和EnouCSP22與寄主揮發(fā)性化合物的結(jié)合模式和結(jié)合能力,為小貫小綠葉蟬行為調(diào)節(jié)劑成分篩選提供新思路,也為小貫小綠葉蟬化學(xué)感受蛋白分子識(shí)別機(jī)制研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蛋白模型準(zhǔn)備

通過AlphaFold蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://www.alphafold.ebi.ac.uk/)獲得蛋白三維結(jié)構(gòu)模型[5]。為了保證蛋白模型的質(zhì)量,通過UCLA 網(wǎng)站(http://services.mbi.ucla.edu/)上的程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行評(píng)估。利用 ERRAT程序統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)中0.35 nm范圍內(nèi)不同原子類型對(duì)之間形成的非共價(jià)鍵數(shù)目,若ERRAT值大于50%,則認(rèn)為該模型整體合理。Verify-3D評(píng)價(jià)模型的合理性一般需要至少80%的氨基酸3D-1D的相容性分值大于或等于0.2,合理表示為通過,反之表示為失敗[6]。利用 ProCheck 程序評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)質(zhì)量,結(jié)果以拉氏構(gòu)象圖呈現(xiàn),表明了蛋白質(zhì)殘基中二面角φ和ψ之間的相互關(guān)系,若90%以上的氨基酸殘基處于最佳區(qū)域則認(rèn)為該模型結(jié)構(gòu)可靠[7]。

1.1.2 配體化合物準(zhǔn)備

查閱文獻(xiàn)收集與小貫小綠葉蟬相關(guān)的揮發(fā)性化合物[8],并在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)PubChem分子庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取化合物的二維結(jié)構(gòu)用于分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)(圖4)。

1.1.3 分子對(duì)接

本研究采用MOE軟件進(jìn)行對(duì)接,參數(shù)設(shè)置參考Wang等[9]的研究,如表1。綜合結(jié)合能評(píng)分(S)以及是否發(fā)生實(shí)際的相互作用來判斷蛋白和化合物間的結(jié)合能力和結(jié)合模式。

表1 MOE分子對(duì)接參數(shù)設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型評(píng)估分析

兩個(gè)蛋白三維結(jié)構(gòu)模型經(jīng)ProCheck程序評(píng)估處于最佳區(qū)域(紅色區(qū)域)和額外允許區(qū)域(黃色區(qū)域)的氨基酸殘基數(shù)量均超過90%,模型結(jié)構(gòu)可靠(圖1);Verify-3D 程序和 ERRAT 程序結(jié)果均超過80%,表明蛋白模型質(zhì)量合理(圖2,圖3),可以用于分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。

圖1 EonuCSP21和EonuCSP22蛋白模型的拉氏圖

圖2 EonuCSP21蛋白模型的ERRAT和Verify-3D評(píng)價(jià)結(jié)果

圖3 EonuCSP22蛋白模型的ERRAT和Verify-3D評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 分子對(duì)接結(jié)果分析

2.2.1 分子對(duì)接結(jié)合能

EonuCSP21、EonuCSP22兩個(gè)蛋白與所有化合物分子對(duì)接的結(jié)合能得分(S)均為負(fù)值,說明蛋白與配體間的相互作用都是自發(fā)的、穩(wěn)定的(圖4)。顏色越深,結(jié)合越好。但是,結(jié)合能不是判定受體與配體結(jié)合能力的唯一標(biāo)準(zhǔn),必須在兩者間存在分子間的相互作用,才能說明兩者的結(jié)合能力。

2.2.2 分子對(duì)接相互作用

除了結(jié)合能之外,受體蛋白與化合物分子若發(fā)生了實(shí)際的相互作用情況,用“ ”標(biāo)記于圖4。如圖所示,EonuCSP21與(E)-2-已烯醛、(Z)-3-己烯醇、牻牛兒醇、芳樟醇、苯甲醛、苯甲酸乙酯等6種化合物有較好的結(jié)合能力,與其余化合物無實(shí)際相互作用;EonuCSP22與(Z)-3-己烯醇、牻牛兒醇、芳樟醇、檸檬烯、苯甲醛、壬醛、α-法呢烯等7種化合物有較好的結(jié)合能力與其余化合物無實(shí)際相互作用;其中(Z)-3-己烯醇、牻牛兒醇、芳樟醇、苯甲醛等4種化合物與兩個(gè)蛋白均有較好的相互作用。十六烷與兩個(gè)蛋白的結(jié)合都是最好的,但是并沒有分子間的實(shí)際相互作用。

2.2.3 分子間結(jié)合位點(diǎn)和作用方式

受體和配體間相互作用的結(jié)合位點(diǎn)和作用方式見圖5,統(tǒng)計(jì)于表2。

EonuCSP21與化合物相互作用的結(jié)合位點(diǎn)涉及Glu89、Phe90、Arg46和Met87四個(gè)氨基酸位點(diǎn),作用方式有H-donor、H-pi、pi-H三種。

注:表示受體與配體間具有實(shí)際的相互作用。顏色越深,結(jié)合能(S)越低,表示結(jié)合越穩(wěn)定。圖4 EonuCSP21和EonuCSP22分子對(duì)接結(jié)果

EonuCSP22與化合物相互作用的結(jié)合位點(diǎn)涉及Arg1、Arg38、Glu58、Gln61和Ile4五個(gè)氨基酸位點(diǎn),作用方式主要是H-acceptor、H-donor、pi-cation三種。

表2 EonuCSP21和EonuCSP22與化合物相互作用的氨基酸位點(diǎn)和作用方式統(tǒng)計(jì)

圖 5 EonuCSP21和EonuCSP22與化合物相互作用的二維圖

3 討論

在蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的研究中,常用的X射線晶體學(xué)、核磁共振、低溫電子顯微鏡等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)設(shè)備要求高,耗費(fèi)也較高。已有研究表明,通過同源建模方法對(duì)未解析的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬,以分子對(duì)接的方法直觀地顯示蛋白受體和其配體間的結(jié)合模式,可用于化學(xué)感受蛋白的初步功能研究以及配體篩選[10]。本研究通過AlphaFold預(yù)測(cè)得到蛋白三維結(jié)構(gòu)模型,并經(jīng)三種軟件評(píng)估了模型質(zhì)量,確保了實(shí)驗(yàn)的可靠性。目前,小貫小綠葉蟬化學(xué)感受蛋白結(jié)合和功能研究未見報(bào)道,本文可作為進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。

本文研究表明,EnouCSP21蛋白在與化合物結(jié)合中,氨基酸位點(diǎn)Arg38出現(xiàn)4次,推測(cè)Arg38在該蛋白的化合物識(shí)別中可能起著關(guān)鍵作用’同理推測(cè),Phe90是EnouCSP22蛋白識(shí)別化合物的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)[11]。

鑒于同一家族蛋白間的氨基酸序列差異性,在功能上可能存在一定特異性[12]。分子對(duì)接技術(shù)可虛擬計(jì)算受體蛋白與配體分子結(jié)合能力,可視化反映結(jié)合模式,對(duì)蛋白功能和分子識(shí)別機(jī)制研究具有參考作用[13,14]。本研究結(jié)果也表明,EnouCSP21和EnouCSP22兩個(gè)蛋白與化合物的結(jié)合并非完全一致,存在一定的差異性。但是,兩個(gè)蛋白與化合物都可以產(chǎn)生自發(fā)的,穩(wěn)定的結(jié)合。小貫小綠葉蟬是雜食性害蟲,可取食多種植物。在今后的實(shí)驗(yàn)中,可以EnouCSP21和EnouCSP22為靶標(biāo),篩選更多親和力較好的揮發(fā)性化合物,用于生理或行為實(shí)驗(yàn),為驅(qū)避劑和引誘劑的篩選提供基礎(chǔ)[15,16]。