胡宇微， 邱俊凱， 孫紅男， 木泰華

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

淀粉可食性膜是多糖類可食性膜的一種, 被譽(yù)為最具有發(fā)展?jié)摿Φ目墒承阅ぶ唬?這是由于淀粉具有良好的成膜性, 而且來源廣、 成本低[1]、 可食用和易成膜等優(yōu)點(diǎn)． 淀粉可食性膜可用于食品包裝中[2], 能減少傳統(tǒng)塑料包裝的使用, 且不對環(huán)境造成污染[3]． 通常用于制備淀粉可食性膜的原淀粉主要有馬鈴薯淀粉、 甘薯淀粉、 木薯淀粉、 豌豆淀粉和玉米淀粉等, 其中馬鈴薯淀粉的支鏈淀粉含量較高、 黏性高、 分子顆粒大、 糊化后透明度高, 因此馬鈴薯淀粉制成的包裝膜較其他淀粉膜透明度更好[4]． 然而單純的馬鈴薯淀粉可食性膜存在易碎和易吸潮等缺點(diǎn), 因此為提高馬鈴薯淀粉可食性膜的綜合性能, 通常加入甘油來保持淀粉可食性膜的結(jié)構(gòu)完整, 同時(shí)起到保濕和塑化的作用． 與此同時(shí), 在可食性膜中加入抗菌、 抗氧化等活性物質(zhì)能夠進(jìn)一步豐富薄膜材料的功能性, 以更好地應(yīng)用于食品包裝領(lǐng)域． 多酚類物質(zhì)是天然的抗氧化劑, 具有優(yōu)異的抗氧化能力、 自由基清除能力以及抑制細(xì)菌繁殖生長的能力[5]． 目前常與可食性膜復(fù)合使用的多酚類物質(zhì)主要有茶多酚、 蘋果多酚、 葡萄籽多酚等[6-8], 尚未見甘薯莖葉多酚類物質(zhì)與淀粉可食性膜復(fù)合使用的相關(guān)報(bào)道．

我國是甘薯產(chǎn)量大國, 2019年我國甘薯年產(chǎn)量約占世界甘薯產(chǎn)量的56%[9]． 甘薯地上部分莖葉資源同樣豐富, 一年中可多次采收, 產(chǎn)量與地下塊根基本相當(dāng)． 然而, 我國甘薯莖葉除2%～5%被用作動物飼料外, 其余大多被直接丟棄, 造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[10]． 甘薯莖葉中富含多酚類物質(zhì), 具有潛在的抗氧化、 降血糖、 消炎、 抑菌等生物活性[10-13], 在食品、 化妝品、 醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景． 在我們先前的研究中采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對甘薯莖葉多酚的組成及各組分含量進(jìn)行了分析[14], 發(fā)現(xiàn)甘薯莖葉多酚主要由9種單一組分構(gòu)成, 分別是咖啡酸、 蘆丁以及7種綠原酸類物質(zhì), 其中咖啡酸(caffeic acid, CA)的抗氧化及抑菌活性最強(qiáng)[15]．

本研究擬以馬鈴薯淀粉、 甘油以及甘薯莖葉多酚中抗氧化及抑菌活性最強(qiáng)的咖啡酸為原料制備咖啡酸/馬鈴薯淀粉可食性膜(caffeic acid /potato starch edible film, CA/PSEF)． 使用質(zhì)構(gòu)分析儀、 紫外可見分光光度計(jì)、 水蒸氣透過率測試儀、 掃描電子顯微鏡、 傅里葉紅外光譜儀等儀器分析不同濃度咖啡酸(0%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%)對馬鈴薯淀粉可食性膜的物理性能、 微觀結(jié)構(gòu)、 分子結(jié)構(gòu)、 抗氧化活性和抑菌活性的影響, 以期為綠色環(huán)保可食性包裝材料的生產(chǎn)提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì), 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司; 電熱恒溫水浴鍋, 天津市泰斯特儀器有限公司; 精密鼓風(fēng)干燥箱, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司; 物性測試儀, 英國Stable Micro System公司; 水蒸氣透過率測試儀, 北京丹貝爾儀器有限公司; 冷場發(fā)射掃描電鏡, 日本HITACHI公司．

1.1.2 試劑

本實(shí)驗(yàn)所用馬鈴薯淀粉購自北京本地, 馬鈴薯淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.80%, 含水量為13.01%． 咖啡酸(純度大于98%)購自北京索萊寶科技有限公司． 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、 大腸桿菌(Escherichiacoli)、 灰綠青霉(Penicilliumgriseus)和黑曲霉(Aspergillusniger)購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司． 甘油(純度99.7%)購自山東優(yōu)索化工科技有限公司．

1.2 方法

1.2.1 可食性膜的制備

按比例稱取馬鈴薯淀粉和甘油(1∶20)→加100 mL去離子水混勻→60 ℃溫水中預(yù)熱30 min→100 ℃沸水浴中持續(xù)攪拌10 min至完全糊化→加入咖啡酸溶液持續(xù)攪拌10 min→超聲波脫氣5 min→保溫靜置30 min→每15 mL成膜液澆鑄于直徑為10 cm的聚苯乙烯平板中→流延成膜→60 ℃熱風(fēng)干燥→揭膜→保存于密閉容器(相對濕度為55%～57%)中．

1.2.2 機(jī)械性能測定

選擇平整均勻無缺陷的薄膜, 切成12 mm×50 mm的條狀, 固定于質(zhì)構(gòu)分析儀拉伸探頭上, 探頭以0.8 mm/s恒速拉伸50 mm, 記錄抗拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率, 重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次[16]．

1.2.3 光學(xué)性質(zhì)測定

使用TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)測定樣品膜在波長300～800 nm范圍內(nèi)的透光率(T)[17]．

T=(-lgT600)/δ

式中,T600指600 nm處膜的光透過率,δ為樣品膜的厚度, 單位為mm． 透明度值越高, 則表示樣品膜越不透明．

1.2.4 水蒸氣透過率測定

薄膜的水蒸氣透過率(P水蒸氣)通過直徑為5.1 cm, 深度為5.4 cm的圓形玻璃杯進(jìn)行測定． 將25 mL水放入杯中以提供100%的相對濕度后, 將杯子用3層薄膜覆蓋． 將膜切成圓形, 直徑為9 cm, 并用熔化的石蠟密封． 將杯子與其內(nèi)容物一起稱質(zhì)量并置于保持在25 ℃的干燥器中． 每12 h對杯子稱質(zhì)量并測定其質(zhì)量損失． 計(jì)算公式為

P水蒸氣=ΔmX/AΔtΔp

式中,Δm/Δt為每單位時(shí)間的濕度增量(g/s),X為平均薄膜厚度(mm),A為暴露薄膜的表面積(m2),Δp為水蒸氣薄膜兩側(cè)的壓差(Pa)． 對于每種類型的膜, 重復(fù)測定3次．

1.2.5 掃描電子顯微鏡

利用冷場發(fā)射掃描電鏡觀察薄膜表面的形貌． 觀察前樣品表面進(jìn)行噴金處理, 測試時(shí)設(shè)定加速電壓為10 kV．

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜

利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行各淀粉膜樣品的紅外吸收光譜測試． 設(shè)定測試條件: 波長掃描范圍4 000～600 cm-1, 分辨率4 cm-1, 掃描次數(shù)64次．

1.2.7 DPPH清除活性實(shí)驗(yàn)

DPPH清除活性參照孫海燕[18]的方法． 修改后具體步驟如下: 用蒸餾水將咖啡酸配置成質(zhì)量濃度分別為5.0, 7.0, 10.0, 15.0, 20.0 μg/mL的樣品溶液, 取2.0 mL樣品溶液加入2.0 mL 6×10-5mol/L DPPH乙醇溶液, 激烈震蕩后, 避光保持60 min, 立即于517 nm處測定吸光值． DPPH清除率(CDPPH)計(jì)算公式為

CDPPH=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中,A0為2.0 mL的DPPH乙醇溶液和2.0 mL的蒸餾水混合后的吸光值,A1為2.0 mL的DPPH乙醇溶液和2.0 mL的樣品溶液混合后的吸光值,A2為2.0 mL的乙醇溶液和2.0 mL的樣品溶液混合后的吸光值．

樣品的DPPH自由基清除活性以每毫克可食性膜中含毫克咖啡酸當(dāng)量表示．

1.2.8 三價(jià)鐵離子(Fe3+)還原活性實(shí)驗(yàn)

三價(jià)鐵離子還原活性(ferric reduce reducing antioxidant power, FRAP)的測定參照Maqsood等[19]的方法． 具體步驟如下: 10 mmol/L TPTZ溶液(溶劑為40 mmol/L HCl溶液)和20 mmol/L FeCl3溶液(溶劑為0.3 mol/L pH值為3.6的磷酸鹽緩沖溶液)及磷酸鹽緩沖溶液以體積比1∶1∶10充分混勻后, 置于37 ℃水浴鍋中保溫30 min, 制得FRAP溶液． 用蒸餾水將各樣品配成不同質(zhì)量濃度的溶液(0.01, 0.05, 0.10 mg/mL), 取0.15 mL樣品溶液, 加入2.85 mL FRAP溶液, 室溫下避光反應(yīng)30 min, 立即于593 nm處測定吸光值, 以蒸餾水代替樣品作為空白對照． 采用質(zhì)量濃度為10, 20, 50, 70, 100, 200 μg/mL的咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得線性回歸方程y=9.789 2x+0.319 9,R2=0.989 4． 樣品的三價(jià)鐵離子還原活性以每毫克可食性膜中含毫克咖啡酸當(dāng)量表示．

1.2.9 抑菌實(shí)驗(yàn)

十字交叉劃線法參考Moreno等[20]的方法． 修改后具體步驟如下: 將薄膜樣品制備為10 mm×60 mm的長條, 在超凈工作臺的紫外燈下滅菌30 min備用． 配置麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的灰綠青霉、 黑曲霉、 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液． 用接種環(huán)蘸取少量剛配置好的菌懸液, 在瓊脂營養(yǎng)培養(yǎng)基的平板中央劃線, 再將膜片貼于平板中央． 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后, 觀察細(xì)菌的生長情況．

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖1是不同濃度咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜掃描電鏡圖, 分別在放大200倍和1 000倍下觀察． 未添加咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜表面和橫截面整體平整, 結(jié)構(gòu)緊湊密實(shí), 無空隙、 孔洞等缺陷, 表面白點(diǎn)為熱風(fēng)干燥空氣中的灰塵顆粒． 隨著咖啡酸濃度的增加, CA/PSEF的表面越來越粗糙, 逐漸出現(xiàn)空隙、 孔洞． 在咖啡酸濃度為0.1%時(shí), CA/PSEF的表面開始形成突起． 在咖啡酸濃度為0.3%時(shí), CA/PSEF的正面出現(xiàn)較多顆粒狀的突起, 孔洞逐漸增大, 橫截面結(jié)構(gòu)松散, 出現(xiàn)較多的空隙． 在咖啡酸濃度為0.5%時(shí), 橫截面出現(xiàn)明顯的孔洞． 這些數(shù)據(jù)表明CA/PSEF中咖啡酸與馬鈴薯淀粉可食性膜組分間的相容性較差, 膜的結(jié)構(gòu)被破壞, 表面或內(nèi)部粗糙、 出現(xiàn)小顆粒．

圖1 不同濃度咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜(CA/PSEF)的掃描電鏡圖

2.2 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF機(jī)械性能的影響

圖2a為不同濃度咖啡酸CA/PSEF的斷裂伸長率． 在不添加咖啡酸時(shí), 馬鈴薯淀粉可食性膜的斷裂伸長率為58.63%, 隨著咖啡酸濃度的增加, CA/PSEF的斷裂伸長率大幅度減?。?當(dāng)咖啡酸濃度為0.1%時(shí), CA/PSEF的斷裂伸長率為45.81%; 當(dāng)咖啡酸濃度增加到0.4%時(shí), CA/PSEF的斷裂伸長率降低至23.79%． 說明咖啡酸的添加影響了馬鈴薯淀粉可食性膜原本完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 從而降低了斷裂伸長率． 但隨著咖啡酸濃度的持續(xù)增加, CA/PSEF形成了一個(gè)新的較為穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 從而斷裂伸長率不再下降, 且有逐漸增加的趨勢．

圖2 不同濃度咖啡酸CA/PSEF的斷裂伸長率與拉伸強(qiáng)度

圖2b為不同濃度咖啡酸CA/PSEF的拉伸強(qiáng)度． 在不添加咖啡酸時(shí), 馬鈴薯淀粉可食性膜的拉伸強(qiáng)度為1.89 MPa, 隨著咖啡酸濃度的增加, CA/PSEF的拉伸強(qiáng)度大幅增加． 當(dāng)咖啡酸濃度為0.1%時(shí), 拉伸強(qiáng)度顯著提高到15.79 MPa; 當(dāng)咖啡酸濃度為0.3%時(shí), 拉伸強(qiáng)度為19.98 MPa． 說明咖啡酸能夠提高CA/PSEF的拉伸強(qiáng)度, 但隨著咖啡酸濃度的持續(xù)增加, 拉伸強(qiáng)度逐漸趨向穩(wěn)定．

2.3 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF透光率的影響

不同濃度咖啡酸CA/PSEF的透光率與咖啡酸濃度成反比(表1)． 在800 nm波長處, 未添加咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜的透光率為96.72%, 隨著咖啡酸濃度的增加, CA/PSEF的透光率逐漸下降． 當(dāng)咖啡酸濃度為0.5%時(shí), CA/PSEF的透光率降至38.13%． 造成這種現(xiàn)象的原因可能是咖啡酸本身為黃色結(jié)晶, 溶于熱水后將原本透明的馬鈴薯淀粉可食性膜染成黃色, 且隨著咖啡酸濃度的增加, 其黃色越來越深, 可食性膜透光率下降． 當(dāng)咖啡酸濃度為0.5%時(shí), 淀粉糊化液中開始出現(xiàn)咖啡酸顆粒, 無法進(jìn)一步溶解, 說明咖啡酸在淀粉糊化液中的溶解度達(dá)到飽和, 而咖啡酸顆粒的存在, 也對馬鈴薯淀粉可食性膜的透光率產(chǎn)生了一定的影響．

表1 不同濃度咖啡酸CA/PSEF的透光率

2.4 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF水蒸氣透過率的影響

圖3a顯示, 馬鈴薯淀粉可食性膜的水蒸氣透過率為28.15 g/m2, 當(dāng)咖啡酸濃度為0.1%時(shí), CA/PSEF的水蒸氣透過率上升至30.79 g/m2, 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 隨著咖啡酸濃度的持續(xù)增加, 水蒸氣透過率開始緩慢下降． 當(dāng)咖啡酸濃度為0.5%時(shí), CA/PSEF的水蒸氣透過率為28.79 g/m2, 趨近于馬鈴薯淀粉可食性膜的水蒸氣透過率, 說明咖啡酸對馬鈴薯淀粉可食性膜的水蒸氣透過率影響較?。?結(jié)果表明隨著咖啡酸濃度的持續(xù)增加, 水蒸氣透過率逐漸下降, CA/PSEF分子結(jié)構(gòu)逐漸變得穩(wěn)定, 從而接近馬鈴薯淀粉可食性膜的水蒸氣透過率．

圖3 不同濃度咖啡酸CA/PSEF的水蒸氣透過率和FITR光譜圖

2.5 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF化學(xué)鍵的影響

圖3b為不同濃度咖啡酸的CA/PSEF在500～4 000 cm-1波長范圍內(nèi)的FITR光譜圖． 馬鈴薯淀粉可食性膜在3 290 cm-1(O-H拉伸), 2 918 cm-1(烷基的C-H拉伸), 1 645 cm-1(O-H)、 1 336 cm-1(CH2拉伸), 1 001 cm-1(C-O-C拉伸)和968 cm-1(吡喃糖環(huán)拉伸)處出現(xiàn)了特征吸收峰． 所有濃度咖啡酸的CA/PSEF均表現(xiàn)出與馬鈴薯淀粉可食性膜相似的FITR光譜, 在咖啡酸加入到淀粉可食性膜中后, 可以發(fā)現(xiàn)CA/PSEF與馬鈴薯淀粉可食性膜呈現(xiàn)相似的譜圖, 沒有出現(xiàn)新的波峰, 因此說明馬鈴薯淀粉與咖啡酸之間的反應(yīng)沒有新的化學(xué)鍵生成．

2.6 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF的DPPH自由基清除能力和Fe3+還原活性的影響

從圖4可以看到, 未添加咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜沒有DPPH自由基清除能力, 說明馬鈴薯淀粉可食性膜本身并沒有DPPH自由基清除能力． 而隨著咖啡酸濃度的增加, 可食性膜的DPPH自由基清除能力開始呈上升趨勢, 且與咖啡酸濃度成正比, 在咖啡酸濃度為0.5%時(shí)達(dá)到0.120 1 mg咖啡酸當(dāng)量, 說明咖啡酸的加入能夠?yàn)轳R鈴薯淀粉可食性膜提供一定的抗氧化活性, 可用于食品保鮮．

圖4 不同濃度咖啡酸CA/PSEF的DPPH自由基清除能力和Fe3+還原活性

圖4b顯示未添加咖啡酸的馬鈴薯淀粉可食性膜沒有Fe3+還原活性, 而隨著咖啡酸濃度的增加, 同樣Fe3+還原活性開始出現(xiàn)上升趨勢, 在咖啡酸濃度為0.5%時(shí)達(dá)到0.129 8 mg咖啡酸當(dāng)量． 進(jìn)一步證明咖啡酸的加入能夠?yàn)轳R鈴薯淀粉可食性膜提供一定的抗氧化活性．

2.7 不同濃度咖啡酸對CA/PSEF的抑菌活性的影響

圖5為不同濃度咖啡酸CA/PSEF的抑菌活性, 可以發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、 黑曲霉以及灰綠青霉能夠在咖啡酸濃度為0%的馬鈴薯淀粉可食性膜培養(yǎng)基上正常生長, 并可在其覆蓋面下生長, 說明馬鈴薯淀粉可食性膜對這4種微生物的生長均未起到抑制作用． 當(dāng)CA/PSEF的咖啡酸濃度為0.1%時(shí), 觀察到這4種微生物依舊圍繞CA/PSEF生長, 但是其覆蓋面下的微生物數(shù)量顯著減少; 當(dāng)CA/PSEF的咖啡酸濃度為0.2%時(shí), 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌少量生長于覆蓋面下, 灰綠青霉和黑曲霉少量生長于CA/PSEF周邊, 說明0.2%濃度咖啡酸的CA/PSEF能夠顯著抑制灰綠青霉和黑曲霉的生長, 一定程度上抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長; 當(dāng)CA/PSEF的咖啡酸濃度為0.3%時(shí), 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌未在覆蓋面下生長, 而黑曲霉和灰綠青霉也不再圍繞CA/PSEF周邊生長; 當(dāng)CA/PSEF的咖啡酸濃度為0.4%時(shí), CA/PSEF完全抑制了這4種微生物在其覆蓋面下生長, 僅出現(xiàn)少量金黃色葡萄球菌和大腸桿菌圍繞CA/PSEF進(jìn)行生長, 說明該濃度下的CA/PSEF能夠?qū)@4種微生物生長起到明顯的抑制作用; 當(dāng)CA/PSEF的咖啡酸濃度為0.5%時(shí), 同樣僅出現(xiàn)少量金黃色葡萄球菌和大腸桿菌圍繞CA/PSEF進(jìn)行生長． 結(jié)果表明, 咖啡酸的加入使得馬鈴薯淀粉可食性膜出現(xiàn)了明顯的抑菌效果, 其中對黑曲霉和灰綠青霉的抑制作用要顯著優(yōu)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌．

圖5 不同濃度咖啡酸CA/PSEF的抑菌活性

3 結(jié)論

甘薯莖葉多酚作為一種天然植物添加劑, 具有良好的抗氧化活性和抑菌活性, 但從未應(yīng)用于可食性膜中． 將甘薯莖葉多酚中抑菌活性最強(qiáng)的咖啡酸添加到馬鈴薯淀粉可食性膜中, 發(fā)現(xiàn)咖啡酸的添加會導(dǎo)致馬鈴薯淀粉可食性膜的機(jī)械性能和透光率下降, 主要原因可能是咖啡酸破壞了馬鈴薯淀粉可食性膜原本穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 但隨著咖啡酸濃度的持續(xù)增加, 可食性膜能逐漸形成新的較為穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)． 研究結(jié)果還顯示馬鈴薯淀粉可食性膜本身并不具有任何抗氧化活性和抑菌活性, 但隨著咖啡酸濃度的增加, 可食性膜的抗氧化活性和抑菌活性得到顯著提高, 因此, 咖啡酸和馬鈴薯淀粉共同制備可食性膜可為綠色環(huán)保包裝材料的開發(fā)提供思路和理論支撐．