宋淼 鄒通 徐禮斌 龔雪琳 王笑峰 邢士超

[摘要] 目的 探討高尿酸血癥（HUA）對雌性大鼠生殖功能的影響。方法 利用腺嘌呤、高酵母飼料和氧嗪酸鉀（尿酸酶抑制劑）進(jìn)行9個周的HUA模型建立。通過陰道脫落細(xì)胞涂片觀察大鼠動情周期；留取完整子宮、卵巢稱質(zhì)量，計算器官系數(shù)；采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察卵巢的病理變化；采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法檢測卵巢組織中吻素1（KISS1）和吻素1受體（KISS1R）mRNA表達(dá)。結(jié)果 HUA雌性大鼠模型構(gòu)建成功。與正常大鼠相比，HUA雌性大鼠動情間期明顯縮短（F=14.000，P＜0.01），卵巢系數(shù)顯著下降（t=2.377，P＜0.05），卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA表達(dá)顯著增高（t=3.456、5.408，P＜0.05）。結(jié)論 HUA可造成雌性大鼠KISS1系統(tǒng)紊亂，引起動情間期縮短和卵巢系數(shù)降低。

[關(guān)鍵詞] 高尿酸血癥；不育，女（雌）性；大鼠，Wistar；生殖；親吻素

[中圖分類號] R589.9;R339.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0551-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.110

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20230912.1030.002;2023-09-13 19：08：50

EFFECTS OF HYPERURICEMIA ON REPRODUCTIVE FUNCTION IN FEMALE RATS SONG Miao， ZOU Tong， XU Libin， GONG Xuelin， WANG Xiaofeng， XING Shichao （Department of Pathogenic Biology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the effects of hyperuricemia （HUA） on reproductive function in female rats. Methods A HUA model was established by nine weeks of high-yeast feeding with adenine and oteracil potassium （a uricase inhibitor）. The rat estrous cycle was determined through observing the smears of exfoliated vaginal cells. The intact uterus and ovaries were weighed to calculate the organ coefficients. Pathological changes in the ovaries were observed with hematoxylin-eosin （HE） staining. The mRNA expression of kisspeptin 1 （KISS1） and kisspeptin 1 receptor （KISS1R） in the ovaries was measured using quantitative real-time PCR. Results The female rat HUA model was successfully constructed. Compared with normal rats， the female rats with HUA showed a significantly shorter interestrus interval （F=14.000，P<0.01）， a significantly lower ovarian coefficient （t=2.377，P<0.05）， and significantly higher mRNA expression of KISS1 （t=3.456，P<0.05） and KISS1R （t=5.408，P<0.05） in the ovarian tissue. Conclusion HUA can disrupt the KISS1 system in female rats， resulting in a shortened interestrus interval and a reduced ovarian coefficient.

[KEY WORDS] hyperuricemia; infertility， female; rats， Wistar; reproduction; kisspeptins

尿酸是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物。在我國，高尿酸血癥（HUA）的患病率為13.3%，其中女性的患病率為7.9%^[1-2]。近年來，女性不孕率不斷升高，這與飲食、生活習(xí)慣和環(huán)境等因素密切相關(guān)^[3]。研究表明，HUA與女性生殖障礙之間存在密切聯(lián)系，但其機(jī)制尚不清楚^[4-5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，親吻肽（Kiss-peptin）通過調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素（GnRH）影響下丘腦-垂體-性腺軸^[6]。Kisspeptin蛋白由吻素1（KISS1）基因所編碼，通過與吻素1受體（KISS1R）結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)功能^[7]。Kisspeptin和其受體KISS1R基因敲除的小鼠無正常的動情周期，且卵巢更小，存在生育困難^[8-9]。本實驗通過構(gòu)建HUA雌性大鼠模型，觀察雌鼠動情周期、器官濕質(zhì)量系數(shù)、卵巢病理變化及卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA的表達(dá)，探究HUA對雌鼠生殖功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康成年雌性Wistar大鼠14只，12周齡，體質(zhì)量為（240±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。腺嘌呤（北京索萊寶生物科技有限公司）；氧嗪酸鉀（生工生物工程股份有限公司）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10的高酵母飼料（北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）；毛細(xì)玻璃管（華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；真空采血管（康衛(wèi)仕醫(yī)療器械有限公司）；低溫離心機(jī)（賽默飛科技有限公司）；PCR試劑盒（塞維爾生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為HUA組和對照組，每組7只。HUA造模參考李傳偉等^[10]的方法。HUA組大鼠飲食分為兩個階段：第1階段，飼喂高酵母飼料，并且用40 g/L的腺嘌呤溶液按照100 mg/（kg·d）的劑量灌胃；在檢測到大鼠血尿酸（SUA）水平顯著下降時，進(jìn)入第2階段，繼續(xù)飼喂高酵母飼料，腺嘌呤劑量減半，同時每日12：00給予大鼠腹腔注射氧嗪酸鉀，用量為100 mg/（kg·d）。整個實驗持續(xù)9周。對照組大鼠飼喂普通飼料，并且給予等體積的蒸餾水進(jìn)行灌胃。兩組大鼠均每間隔1周內(nèi)眥取血0.5 mL，以3 500 r/min 離心10 min，取血清，采用生化分析儀檢測SUA。

1.2.2 動情周期觀察 在確認(rèn)造模成功后（第7周），每天8：00和20：00，抓取大鼠放置于手心，將沾有生理鹽水的細(xì)小棉棒緩慢地插入大鼠陰道后稍停留，并輕輕旋轉(zhuǎn)，緩慢地拔出，將陰道內(nèi)含物均勻地涂抹在載玻片上，待自然干燥后，用亞甲藍(lán)染色5 min，顯微鏡下觀察。參考印丹丹等^[11]的方法，根據(jù)細(xì)胞種類和比例的變化來判斷動情周期，直至觀察一個完整的動情周期。

1.2.3 器官濕質(zhì)量系數(shù)測定 在造模第9周后處死大鼠，留取完整的子宮、卵巢，吸干表面水分后稱質(zhì)量，計算器官系數(shù)。子宮（卵巢）系數(shù)=子宮（卵巢）質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.4 卵巢組織病理學(xué)觀察 卵巢稱質(zhì)量后，取部分組織立即置于40 g/L甲醛中進(jìn)行固定，制備組織蠟塊，切片（5 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達(dá)檢測 剩余部分卵巢組織用trizol提取mRNA，逆轉(zhuǎn)成為cDNA后，使用PCR試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR（qPCR）檢測。所用引物及其序列見表1。采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組不同時間SUA和動情周期比較采用重復(fù)測量方差分析，其他兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SUA水平比較

在模型構(gòu)建第1、5、7、9周時，HUA組大鼠的SUA水平均顯著高于對照組（F=9.430～28.910，P＜0.05），表明HUA大鼠模型造模成功。見表2。

2.2 兩組動情周期比較

雌性大鼠動情周期可分為4個階段。①動情前期：涂片可見大量有核上皮細(xì)胞和少量的角化上皮細(xì)胞（圖1A）；②動情期：涂片可見滿視野的角化上皮細(xì)胞和少量的有核上皮細(xì)胞（圖1B）；③動情后期：涂片上有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞均可見且比例相當(dāng)（圖1C）；④動情間期：可見大量的白細(xì)胞和黏液（圖1D）。與對照組相比，HUA組大鼠動情前期、動情期、動情后期時間無明顯變化，而動情間期明顯縮短（F=14.000，P＜0.01）。見表3。

2.3 兩組器官濕質(zhì)量系數(shù)比較

與對照組相比，HUA組大鼠的子宮系數(shù)無明顯變化，但卵巢系數(shù)顯著下降（t=2.377，P＜0.05），說明HUA對卵巢產(chǎn)生影響。見表4。

2.4 卵巢組織病理學(xué)觀察

兩組大鼠卵泡細(xì)胞的發(fā)育和成熟正常，病理切片無明顯改變，說明HUA對卵巢組織沒有明顯破壞。見圖2。

2.5 兩組卵巢組織KISS1和KISS1R mRNA表達(dá)比較

qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA表達(dá)顯著增高（t=3.456、5.408，P＜0.05）。見表5。

3 討論

隨著生活水平的提高，我國HUA發(fā)病率越來越高，女性發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年增長的趨勢。尿酸不僅已經(jīng)被證實是心血管疾病和高脂血癥、糖尿病等代謝類疾病的風(fēng)險因素^[12]，還與多種女性生殖障礙類疾病相關(guān)，如多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位、妊娠并發(fā)癥等^[5，13]。

在雌性哺乳動物中，動情周期分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期4個階段。雌性大鼠體內(nèi)的激素水平、卵巢和子宮的生理狀態(tài)都隨著動情周期的改變而變化，動情周期是雌性生殖健康的重要標(biāo)志^[14]。動情周期是由下丘腦-垂體-性腺軸所控制的，主要通過GnRH進(jìn)行調(diào)節(jié)，主要有兩種調(diào)節(jié)模式：一種是脈沖式分泌模式，負(fù)責(zé)刺激卵泡發(fā)育和類固醇生成；另一種則是激增分泌模式，主要負(fù)責(zé)誘導(dǎo)促黃體生成素的激增^[15]。KISS1R是GnRH神經(jīng)元脈沖式分泌活動調(diào)節(jié)的關(guān)鍵受體^[16]。荀文娟等^[17]研究發(fā)現(xiàn)，KISS1/KISS1R系統(tǒng)對豬的發(fā)情周期具有重要的調(diào)節(jié)作用。本文研究結(jié)果顯示，與對照組相比較，HUA組大鼠卵巢組織中KISS1和KISS1R mRNA的表達(dá)水平均明顯增高，尤其是KISS1R mRNA的表達(dá)增高更為顯著。KISS1R mRNA編碼的產(chǎn)物為Kisspeptin蛋白受體，本研究HUA組大鼠動情間期縮短，可能是由于KISS1R表達(dá)水平升高，使大鼠對激素更加敏感所致。

卵巢KISS1/KISS1R系統(tǒng)還控制著卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、調(diào)節(jié)排卵和卵巢類固醇激素的合成等^[18]。FABOV?等^[19]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢的體外模型中，低劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢有保護(hù)、抗凋亡的作用，而高劑量的Kisspeptin蛋白對卵巢具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究HUA組大鼠卵巢組織中KISS1 mRNA表達(dá)水平增高，但卵巢系數(shù)下降。猜測這可能是由于卵巢中Kisspeptin蛋白過量表達(dá)，卵巢功能被抑制所導(dǎo)致的。但目前尚缺乏直接證據(jù)與大規(guī)模的臨床研究證實這一猜測。

綜上所述，HUA可能通過KISS1系統(tǒng)導(dǎo)致雌性大鼠動情周期紊亂和卵巢系數(shù)下降，這為HUA的早期篩查及其并發(fā)癥的預(yù)防性治療提供了新的理論依據(jù)，也為女性生殖障礙相關(guān)疾病的診療提供了新的思路。

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（本文編輯 馬偉平）